Una pipeline versatile per l'analisi dei cambiamenti dinamici nei corpi nucleari in una varietà di tipi di cellule

Riepilogo

Questo metodo descrive un protocollo di immunofluorescenza e una pipeline di quantificazione per valutare la distribuzione proteica con vari modelli di organizzazione nucleare nei linfociti T umani. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo, a partire dalla preparazione del campione e proseguendo attraverso l'esecuzione di analisi semi-automatizzate nelle Fiji, concludendo con la gestione dei dati da parte di un taccuino Google Colab.

Abstract

Vari processi nucleari, come il controllo trascrizionale, si verificano all'interno di strutture discrete note come focolai che sono distinguibili attraverso la tecnica dell'immunofluorescenza. Lo studio della dinamica di questi focolai in diverse condizioni cellulari tramite microscopia fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l'identità e le funzioni cellulari. Tuttavia, l'esecuzione di saggi di immunofluorescenza su diversi tipi di cellule e la valutazione delle alterazioni nell'assemblaggio, nella diffusione e nella distribuzione di questi focolai presentano numerose sfide. Queste sfide comprendono complessità nella preparazione dei campioni, nella determinazione dei parametri per l'analisi dei dati di imaging e nella gestione di volumi di dati sostanziali. Inoltre, i flussi di lavoro di imaging esistenti sono spesso personalizzati per utenti esperti, limitando così l'accessibilità a un pubblico più ampio.

In questo studio, introduciamo un protocollo di immunofluorescenza ottimizzato su misura per lo studio delle proteine nucleari in diversi tipi di cellule T primarie umane che possono essere personalizzate per qualsiasi proteina di interesse e tipo di cellula. Inoltre, presentiamo un metodo per quantificare in modo imparziale la colorazione delle proteine, sia che formino focolai distinti sia che mostrino una distribuzione nucleare diffusa.

Il metodo proposto offre una guida completa, dalla colorazione cellulare all'analisi, sfruttando una pipeline semi-automatizzata sviluppata a Jython ed eseguibile nelle Fiji. Inoltre, forniamo uno script Python di facile utilizzo per semplificare la gestione dei dati, accessibile pubblicamente su un notebook Google Colab. Il nostro approccio ha dimostrato efficacia nel produrre analisi di immunofluorescenza altamente informative per proteine con diversi modelli di organizzazione nucleare in diversi contesti.

Introduzione

L'organizzazione del genoma eucariotico è governata da più strati di modificazioni epigenetiche¹, coordinando diverse funzioni nucleari che possono verificarsi all'interno di compartimenti specializzati chiamati corpi nucleari o condensati². All'interno di queste strutture, avvengono processi come l'inizio della trascrizione³, l'elaborazione dell'RNA ^4,5,6, la riparazione del DNA ^7,8, la biogenesi dei ribosomi

Protocollo

L'utilizzo di campioni umani a fini di ricerca è stato approvato dai Comitati Etici della Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milano) ed è stato ottenuto il consenso informato di tutti i soggetti (numeri di autorizzazione: 708_2020). Il protocollo è organizzato in tre sezioni principali: esecuzione dell'immunofluorescenza, acquisizione delle immagini e analisi delle immagini. In media, richiede 4 giorni lavorativi per essere completato (Figura 1).

1. Preparazione all'immunofluorescenza

NOTA: Qu....

Discussione

In questo studio, presentiamo un metodo per eseguire esperimenti di immunofluorescenza su proteine nucleari nei linfociti T umani. Questo metodo offre flessibilità per l'uso con vari tipi di cellule attraverso piccole modifiche nelle fasi di fissazione e permeabilizzazione, come descritto in precedenza^30,31.

Il nostro flusso di lavoro di imaging si basa su tecniche consolidate descritte in letteratura, in particolare FindFoci e 3D Sui.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1