Method Article
يصف هذا البروتوكول الزراعة في المختبر لمسببات الأمراض الزهرية اللولبية الشاحبة subsp. الشاحبة في الزراعة المشتركة مع خلايا الثدييات. الطريقة قابلة للتطوير. يمكن استخدامه لإنتاج كميات كبيرة من T. الشاحبة ولتوليد الثقافات النسيلية.
لأكثر من قرن من الزمان ، اللولبية الشاحبة subsp. الشاحب، البكتيريا الحلزونية الشكل التي تسبب مرض الزهري ، لا يمكن نشرها إلا عن طريق تلقيح وحصاد الكائنات الحية من خصيتي الأرانب. في عام 2018 ، وصفنا طريقة لزراعة T. pallidumin vitro باستمرار. يستخدم هذا النظام الزراعة المشتركة مع الخلايا الظهارية للأرانب (خلايا Sf1Ep) في وسط زراعة الأنسجة المحتوية على المصل يسمى TpCM-2. يشبه وقت مضاعفة T. pallidum في الثقافة ذلك المقدر أنه يحدث أثناء العدوى الطبيعية (حوالي 33-45 ساعة). يمكن استزراع الكائن الحي بشكل مستمر مع وقت مرور قياسي قدره أسبوع واحد في بيئة منخفضة الأكسجين (1.5٪) عند 34 درجة مئوية. تحتوي هذه المقالة على بروتوكولات استزراع الشريطية الشاحبة ، وطرق نمو خلايا زراعة الأنسجة المطلوبة والحفاظ عليها ، وتقنية توليد سلالات متساوية الوراثة عن طريق الحد من التخفيف. توفر القدرة على زراعة T. pallidum في المختبر طرقا تجريبية جديدة لدراسة وفهم هذا الكائن الحي الغامض.
اللولبية الشاحبة هي نوع من البكتيريا الحلزونية الشكل (تسمى اللولبيات) التي تسبب مرض الزهري والالتهابات ذات الصلة لدى البشر والرئيسيات الأخرى. مرض الزهري مرض خطير له آثار طويلة المدى على الأفراد المصابين ، ويقدر أن أكثر من 8 ملايين حالة جديدة من مرض الزهري تحدث في جميع أنحاء العالم كلعام 1. T. الشاحبة تم تقسيمها إلى ثلاثة أنواع فرعية بناء على الأمراض التي تسببها في البشر بالإضافة إلى الاختلافات الجينية الطفيفة: الأنواع الفرعية الشاحبة (التي تسبب مرض الزهري المنقول جنسيا) ، والأنواع الفرعية pertenue (الداء العليقي) ، والأنواع الفرعية المتوطنة (المسببة للزهري المتوطن) 2،3. T. pallidum subsp. pertenue يسبب أيضا التهابات في البابون والشمبانزي والرئيسيات الأخرى. كائن حي وثيق الصلة يسمى اللولبية (وتسمى أيضا اللولبية paraluisleporidarum) يسبب عدوى في الأرانب والأرانبالبرية 4،5. ترتبط كل هذه البكتيريا ارتباطا وثيقا ، مع هوية تسلسل الحمض النووي بنسبة تزيد عن 98٪ على مستوى الجينوم6،7،8. لكل منها كروموسوم دائري واحد صغير يبلغ حجمه حوالي 1.14 مليون زوج أساسي. أعضاء هذه المجموعة T. pallidum تم العثور عليها فقط بالاشتراك مع مضيفيها من الثدييات. على هذا النحو ، فهي مسببات الأمراض الملزمة التي تعتمد على الأنواع المضيفة للبقاء والنمو9،10.
بدأت محاولات استزراع T. pallidum في المختبر بعد فترة وجيزة من تحديده من قبل Schaudinn و Hoffman في عام 190511،12. ومع ذلك ، فشلت هذه الجهود في أن تؤدي إلى نمو ثابت وقابل للتكرار للكائن الحي. نتيجة لذلك ، T . شاحبة تتطلب الدراسات البحثية تكاثر الكائن الحي من خلال العدوى التجريبية لحيوانات المختبر ، والأكثر شيوعا الأرنب13،14. في عام 1981 ، قدم Fieldsteel et al.15 نظاما لزراعة الأنسجة عزز تكاثر سلالات T. pallidum لمدة تصل إلى أسبوعين. تضمن هذا النظام الزراعة المشتركة ل T. pallidum مع الخلايا الظهارية للأرانب ذات الذيل القطني Sf1Ep في وسط زراعة الأنسجة المعدلة (T. pallidum Culture Medium 1 ، TpCM-1) بناء على الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر (MEM) و 20٪ مصل بقري جنين (FBS). كانت ظروف الاستزراع الأخرى المطلوبة هي الحضانة عند 34 درجة مئوية في جو يحتوي على 1.5٪ O2 و 5٪ CO29،16. في هذا النظام ، ترتبط T. pallidum بخلايا Sf1Ep وتتكاثر عندما تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا بسطح خلية الثدييات. على الرغم من العديد من محاولات الزراعة الفرعية والتعديلات الأخرى ، فشل نظام Fieldsteel et al. في تعزيز النمو المستمر في المختبر .
في عام 2018 ، أفاد مختبرنا أن استخدام وسيط معدل يسمى TpCM-2 (حيث تم استبدال Mem الخاص ب Eagle's MEM بوسط زراعة أنسجة أكثر تعقيدا ، CMRL 1066) يوفر ل T. pallidum العناصر الغذائية المطلوبة للسماح بثقافة متسقة على المدىالطويل 17. حتى الآن ، أدى هذا التعديل إلى ثقافة متسقة ومستمرة لما لا يقل عن 5 سلالات من T. pallidum subsp. الشاحبة (Nichols و SS14 و Mexico A و UW231B و UW249B) وسلالة واحدة من T. pallidum subsp. endemicum (البوسنة أ) 18،19. على سبيل المثال ، تم الآن زراعة سلالة Nichols بشكل مستمر في المختبر لأكثر من 6 سنوات. حتى الآن ، لم تنجح محاولات استزراع عزلات الداء العليقي (T. pallidum subsp. pertenue) أو T. paraluiscuniculiin vitro 18. لا يزال نظام TpCM-2 يتطلب وجود خلايا Sf1Ep ، وتركيزات منخفضة من الأكسجين ، وحضانة عند 34 درجة مئوية ، مما يجعل النظام أكثر تعقيدا من معظم تقنيات الاستزراع البكتيري. ومع ذلك ، فإن هذا النظام المعدل لزراعة الشريطية الشاحبة كان مفيدا في تحديد متطلبات نمو البكتيريا18 ، وتحديد الحد الأدنى من التركيزات المثبطة (MICs) للمركبات والببتيدات المضادةللميكروبات 20،21،22،23،24،25 ، ونشر سلالات جديدة من أنسجة المريض التي تستنشق26 ، مما أدى إلى عزل التجمعات النسيلة ل الكائنالحي 27 ، الذي يميز نظام التباين المستضد tprK 27،28 ، فحص التعبير الجيني29 ، وإجراء تحليل الطفري30،31،32.
هنا ، نصف الطرق الحالية لزراعة T. pallidum في المختبر. نأمل أن تساعد هذه المعلومات في تسهيل التطبيق على نطاق أوسع لتقنية الثقافة في المختبر لتحسين تشخيص مرض الزهري والالتهابات اللولبية ذات الصلة وعلاجه والوقاية منه.
ملاحظة: تتطلب جميع الخطوات استخدام تقنية معقمة ومواد وكواشف معقمة. يوصى باستخدام غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة لتقليل أ) تعرض الأفراد للمواد المعدية و ب) إمكانية التلوث الميكروبي للثقافات.
1. إنشاء مخزونات خلايا Sf1Ep
ملاحظة: يمكن شراء الخلايا الظهارية للأرانب ذات الذيل القطني Sf1Ep كمخزونات مجمدة من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (انظر جدول المواد). يبدو أن الطبيعة البطيئة النمو ومعدل الأيض المنخفض لخلايا Sf1Ep هي المفتاح لقدرتها على دعم بقاء ونمو T. pallidum33 على المدى الطويل. لذلك ، لا ينصح بالاستبدال بمزارع خلايا الثدييات الأخرى. خلايا Sf1Ep ليست خط خلوي خالد ويمكن الحفاظ عليها لمدة 25-30 مقطعا فقط في الثقافة. لذلك ، من المهم الحفاظ على مخزون مجمد من خلايا Sf1Ep منخفضة المرور للاستخدام في المستقبل. تنشأ خطوط Sf1Ep الخالدة أحيانا أثناء الثقافة طويلة المدى لخلايا Sf1Ep. (ملاحظات غير منشورة). غالبا ما تنمو هذه الخطوط بشكل أسرع ويسهل التعامل معها. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، يفقدون القدرة على دعم نمو الشريطية الشاحبة . يمكن استخدام خطوط Sf1Ep الخالدة ثم استبدالها عندما تبدأ اللولبيات في النمو ببطء.
2. مرور خلايا Sf1Ep
ملاحظة: تتم مراقبة نمو مزرعة الخلايا Sf1Ep باستخدام مجهر مقلوب باستخدام بصريات تباين الطور. عادة ما تستغرق الخلايا حوالي أسبوع للوصول إلى التقاء قريب. عندما تصل الخلايا إلى ~ 90٪ من التقاء ، يمكن تمريرها أو استخدامها لزراعة T. pallidum أو تحضير المخزونات المجمدة. يمكن تمديد عمر الثقافة إلى أسبوعين عن طريق استبدال نصف وسط الثقافة بعد أسبوع واحد من الثقافة.
3. زراعة T. الشاحبة
تنبيه: جميع T. pallidum الأنواع الفرعية والسلالات المسببة للأمراض للإنسان وتصنف على أنها مسببات الأمراض من مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL-2)34. ومن الضروري اتخاذ التدابير المناسبة لحماية الموظفين؛ وتشمل هذه استخدام القفازات ومعدات الحماية الشخصية الأخرى (PPE) بالإضافة إلى تطهير الأسطح والمواد والسوائل التي يحتمل أن تتعرض للمثقبية الشاحبة. يتم تعطيل المثقبية الشاحبة بسهولة عن طريق التعرض ل 70٪ من الإيثانول أو المطهرات المتاحة تجاريا. يوصى باستخدام أغطية التدفق الصفحي بشكل متسق للتعامل مع العينات التي تحتوي على T. pallidum .
ملاحظة: T. pallidum هو كائن حي دقيق يمكن قتله ببضع ساعات من التعرض لمستويات الأكسجين في الغلاف الجوي9،16،35. لذلك ، يوصى بأن يقتصر التعامل مع الشريطية الشاحبة في الهواء على أقل من ساعة إن أمكن. أيضا ، يجب أن يكون وسط TpCM-2 متوازنا مسبقا في 1.5٪ O2 ، و 5٪ CO2 ، والتوازن N2 ، ويجب أن يكون التقليب القوي (على سبيل المثال ، استخدام الدوامة) محدودا. نظرا لأن زراعة الشريطية الشاحبة تجرى عادة في حالة عدم وجود مضادات حيوية ، فهناك حاجة إلى مزيد من العناية لتجنب التلوث بالبكتيريا أو الفطريات. الإجراء Sf1Ep-TpCM-2 لزراعة T. الشاحبة ملخص في الشكل 1 ويتضمن خطوات متعددة ، بما في ذلك بذر أوعية الاستزراع بخلايا Sf1Ep ، وتحضير وسط TpCM-2 ، وتلقيح الثقافات بالمثقبية الشاحبة. مصل الأبقار الجنينية المعطلة بالحرارة (FBS) هو مكون متوسط مهم ، وتختلف فعاليته بين مختلف الموردين والمجموعات19. من الضروري الفحص المسبق لمجموعات FBS للتأكد من فعاليتها.
4. حصاد ومرور مزارع T. pallidum
ملاحظة: نظرا لأن غالبية T. الشاحبة في الثقافة مرتبطة بسطح خلايا Sf1Ep ، فمن الضروري فصل اللولبيات عن خلايا الثدييات من أجل استعادتها والحصول على تعداد دقيق للكائنات الحية. عادة ما يتم هذا "الحصاد" والمرور إلى الثقافات الطازجة في اليوم السابع من الثقافة. الإجراء الموصوف هنا هو لألواح 6 آبار. يتم ضبط كمية محلول التربسين-EDTA المستخدم لأعلى أو لأسفل اعتمادا على حجم تنسيق الثقافة17،19،27.
5. تجميد وتخزين ثقافات T. pallidum
ملاحظة: يمكن تخزين T. pallidum إلى أجل غير مسمى عند درجة حرارة -70 درجة مئوية أو أقل ، مع قابلية البقاء عند الذوبان عادة ما تكون 50٪ -90٪.
6. توليد استنساخ متساوي الجين من T. الشاحبة
ملاحظة: تم وصف هذا الإجراء بالتفصيل في دراسة سابقة27.
باستخدام الشروط الموصوفة ، يحتفظ T. pallidum عادة بحركة >90٪ ويتكاثر لوغاريتميا مع وقت مضاعفة من 33 ساعة إلى 45 ساعة لمدة 7 أيام تقريبا قبل دخول المرحلة الثابتة (الشكل 3). على مدار أسبوع واحد ، تخضع اللولبيات لما يقرب من 4-5 مضاعفات (الشكل 4). ). بالإضافة إلى ذلك ، قد تنمو سلالات مختلفة من T. الشاحبة بمعدلات مختلفة. سلالات مجموعة SS14 من T. الشاحبة تميل إلى أن يكون لها أوقات مضاعفة أبطأ من تلك الموجودة في مجموعة نيكولز17.
قد تؤدي تغذية الثقافات إلى إطالة وقت الزراعة لعدة أيام ولكن غالبا ما تفشل طبقة خلية Sf1Ep بعد أسبوع من الزراعة. علاوة على ذلك ، تصل اللولبيات إلى الحد الأعلى للكائنات الحية حوالي 5 × 107 / مل. عادة ما تستمر الثقافات المنقولة على فترات 7 أيام في الضرب اللوغاريتمي مع مرحلة تأخر قليلة أو معدومة. غالبا ما يصعب تمرير الكائنات الحية في المرحلة الثابتة.
ترتبط معظم الشريطية الشاحبة بخلايا Sf1Ep. ومع ذلك ، يبقى ما يكفي من T. pallidum في المادة الطافية بحيث يمكن إزالة العينات المتوسطة بشكل دوري للتحقق من الجدوى والتكاثر. إذا كانت هناك حاجة إلى تقدير دقيق ، فيجب قياس حجم الوسط الذي تمت إزالته ، وعدد T. pallidum كميا ، وإضافة العدد الإجمالي للكائنات الحية التي تمت إزالتها إلى التعداد النهائي عند الحصاد.
في الدراسات السابقة ، كانت كفاءة الاستنساخ (عدد المزارع الإيجابية لكل كائن حي ملقح) 12.5٪ ل 2 T. pallidum الملقح لكل بئر و 6.7٪ ل 0.5 T. الشاحبة الملقحة لكل بئر27. وبالتالي ، فمن المحتمل أن يمثل أي بئر إيجابي نتاج كائن حي واحد في أي من هذه العينات. ومع ذلك ، يجب التحقق من استنساخ المجموعات السكانية الناتجة من خلال فحص الثقافة للتأكد من تجانسها في المواقع غير المتجانسة في الثقافة الأم. الطريقة الأكثر تحديدا لإثبات أن الثقافة متساوية المنشأ هي من خلال تسلسل الجينوم الكامل27.
الشكل 1: مخطط انسيابي لإجراء الزراعة في المختبر T. pallidumin . أعيد طبع هذا الرقم بإذن من إدموندسون ونوريس (2021) 19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي للنظام لموازنة T. كاشف زراعة الشاحبة في بيئة منخفضة الأكسجين. يتم توصيل فتحة تهوية جرة البيرة عبر مفصل T بمصدر فراغ (مثل فراغ المنزل) وأسطوانات الغاز التي تحتوي على مخاليط غاز مخصصة (5٪ CO2 ، توازن النيتروجين و 1.5٪ O2 ، 5٪ CO2 ، توازن النيتروجين). يقيس مقياس التفريغ المضمن الفراغ المسحوب في البرطمان. يتم سحب الفراغ في الجرة إلى حوالي -58 كيلو باسكال. ثم يتم إعادة ملء البرطمان المفرغ ببطء بمخاليط الغاز. يتم إعادة تعبئة جرة Brewer ثلاث مرات بنسبة 5٪ CO2 ، وتوازن النيتروجين قبل الإخلاء النهائي ، وإعادة تعبئتها بنسبة 95٪ N2 ، و 5٪ CO2 ، و 1.5٪ O2. ثم تتم إزالة الثقافات أو الوسائط من البرطمان ونقلها بسرعة إلى الحاضنة منخفضة الأكسجين. بالتناوب ، يمكن تثبيت الأنبوب بين جرة Brewer والمفصل T الأول بإحكام ، وفصل الأنبوب عن المفصل T ، ويمكن نقل جرة Brewer بأكملها إلى حاضنة 34 درجة مئوية. أعيد طبع هذا الرقم بإذن من إدموندسون ونوريس (2021) 19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنيات نمو T. pallidum المزروعة بخلايا Sf1Ep مع وسط TpCM-2. تم زرع الثقافات الثلاثية المتوازية مع T. pallidum. تم حصاد النسخ المتماثلة في كل نقطة زمنية. تمثل النتائج المتوسط + SEM لهذه الثقافات. (أ) تظهر التغييرات في المشعرية الشاحبة لكل مزرعة و (ب) النسبة المئوية للحركة. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Edmondson et al.18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على مرور الثقافة المختبرية ل T. الشاحب، سلالة نيكولز. تم زرع الثقافات الثلاثية المتوازية مع T. الشاحبة وتم تمريرها أسبوعيا باستخدام تخفيف 1:20. تظهر مخطط سن المنشار أعداد T. pallidum لكل ثقافة والعدد المنقول إلى ثقافات جديدة في كل نقطة زمنية. تمثل النتائج متوسط ± SEM لثلاثة مكررات بيولوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
جدول 1: الحجم المتوسط ونسب البذر لأوعية الاستزراع. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: وسائط زراعة T. pallidum . يجب تعقيم جميع الوسائط بعد التحضير. يمكن تخزين وسط Sf1Ep عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين. عادة ما يتم تصنيع TpCM-2 قبل يوم واحد من الاستخدام. يجب أن يكون وسط التفكك مقتبسا ومجمدا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
نظام Sf1Ep-TpCM-2 هو أول إجراء متاح يعزز الاستزراع المستمر في المختبر للمثقبية الشاحبة. النظام معقد بسبب متطلبات النمو القصوى لهذا الكائن الحي: 1) الاحتياجات الغذائية المعقدة بسبب قدرات التخليق الحيوي المحدودة. 2) متطلبات غير مفهومة جيدا لكميات صغيرة من الأكسجين ، على الرغم من الحساسية العالية لأنواع الأكسجينالتفاعلية 9،10،16،36 ؛ و 3) الحاجة الحالية لوجود خلايا Sf1Ep. في حين أنه من المغري "قطع الزوايا" في الإجراء ، فمن المستحسن اتباع الخطوات بعناية حتى يتم تحقيق ثقافة ناجحة على المدى الطويل قبل تجربة التعديلات. مع تراكم معلومات إضافية حول متطلبات التمثيل الغذائي ل T. pallidum ، قد يكون من الممكن تطوير ظروف محورية لا تتطلب وجود خلايا Sf1Ep. ومع ذلك ، من المرجح أن يظل معدل النمو في المختبر بطيئا (مع حد أدنى لمضاعفة الوقت من 33 ساعة إلى 46 ساعة ، اعتمادا على السلالة)17،18 ، بالنظر إلى أن T. الشاحبة تتكاثر في وقت مضاعفة يقدر من 30 ساعة إلى 33 ساعة حتى أثناء عدوى الثدييات37،38. كما هو الحال مع أي ثقافة بكتيرية ، يوصى بالحفاظ على مخزونات مرور منخفضة وإجراء تجارب على ثقافات T. pallidum التي تقل عن 10 ممرات من هذه المخزونات لتجنب "الانجراف الجيني" والتغيرات المظهرية المرتبطة بها بسبب الطفرات.
يبدو أن خلايا Sf1Ep توفر العناصر الغذائية الأساسية أو الأنشطة الأنزيمية لللولبيات. ومع ذلك ، فإنها تستهلك أيضا العناصر الغذائية (مثل الجلوكوز والأكسجين) وقد تنتج ظروفا سامة مثل انخفاض درجة الحموضة9،16،39. لذلك ، هناك عمل موازنة بين وجود خلايا Sf1Ep كافية لدعم تكاثر الشريطية الشاحبة ومنع فرط نمو خلايا الثدييات وسميتها. تميل أعداد المرور العالية لخلايا Sf1Ep إلى النمو بشكل أسرع وفي بعض الأحيان تفقد القدرة على دعم تكاثر T. pallidum . على هذا النحو ، يجب مراقبة رقم مرور Sf1Ep ، ويجب استبدال مخزونات الخلايا بمستحضرات مجمدة منخفضة الممر بشكل دوري. يؤدي وجود خلايا Sf1Ep أيضا إلى تعقيد دراسة T . pallidum خصائص مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي ومحتوى البروتين وأنشطة الإنزيم. يمكن إزالة خلايا الأرانب إلى حد ما باستخدام الطرد المركزي المتكرر منخفض السرعة (100 × جم لمدة 5 دقائق) أو بشكل أكثر فعالية باستخدام تدرجات Percoll أو Hypaque40،41. ومع ذلك ، فإن طرق الطرد المركزي المتدرج فعالة بشكل عام فقط مع أعداد كبيرة من T. الشاحب. تقتصر الطرق البديلة لتكاثر الشريطية الشاحبة على عدوى المختبر مثل الأرانب13،14. هذا النهج له اعتبارات أخلاقية وأصبح مكلفا بشكل متزايد. ومع ذلك ، فإن نموذج الأرانب مفيد جدا لدراسة التسبب في الشريطية الشاحبة والاستجابات المناعية للمضيف. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن تكون هناك بعض الاختلافات في التعبير الجيني أو النمو أو سلوك T. pallidum أثناء زراعة المختبر وعدوى الأرانب27.
في وقت إعداد هذا التقرير ، تم إنشاء نظام Sf1Ep-TpCM-2 في 6 مجموعات بحثية على الأقل في الولايات المتحدة وأوروبا وأسفر عن 16 منشورا بموضوعات تتراوح من T. pallidum علم الأحياء الأساسي وعلم الوراثة إلى الحساسية لمضادات الميكروبات. من المرجح أن تزداد قيمة الثقافة في المختبر في دراسة هذا العامل الممرض الغامض مع الاستخدام الموسع والتحسينات المستقبلية.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
تم دعم هذا العمل بمنحة R01 AI141958 من المعاهد الوطنية للصحة بالولايات المتحدة / NIAID. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E8008 | |
10x Earle’s Balanced Salts, w/o Mg2+, Ca2+ | Gibco | 14155063 | |
15 and 50 mL conical sterile disposable centrifuge tubes | N/A | N/A | |
2 mL cryogenic vials | Corning | 430659 | |
6-well cell culture plates for T. pallidum cultivation | Falcon | 353046 | The plates must have low evaporation lids. |
70% ethanol | N/A | N/A | |
75 cm2 tissue culture flasks with vented caps | Corning | 43061U | |
93.5% nitrogen, 5% CO2, and 1.5% oxygen for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
95% nitrogen and 5% CO2 for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
96-well low evaporation clear, flat-bottom tissue culture-treated microplates | Corning Falcon | 353072 | |
Adjustable multi-channel pipette with 200 ul capacity | N/A | N/A | Optional, but very helpful for cloning |
Cell culture grade water | Sigma | W3500 | |
CMRL 1066 without L-Glutamine or Phenol Red | US Biological | C5900-03A | |
CO2 for tri-gas and tissue culture incubators | N/A | N/A | |
Cryogenic liquid nitrogen cell culture storage tank | N/A | N/A | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
Disposable filter units, 0.2 µm , > 100 mL capacity | N/A | N/A | |
Disposable pipets: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspirating | N/A | N/A | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M1902 | |
DMSO (sterile cell culture grade ) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Eagle’s MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
Fetal bovine serum, heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | We highly recommend this product. Must pre-screen for T. pallidum culture compatibility if using a different brand or catalog number. |
Freezer with capability of maintaining -70 °C or -80 °C | N/A | N/A | For storage of T. pallidum; liquid nitrogen storage may be used instead |
Freezing medium (Sf1Ep medium + 10% [v/v] DMSO) | N/A | N/A | |
Gas cylinders with appropriate fittings | N/A | N/A | |
GasPak 150 vented anaerobic jar (Brewer Jar) | Fisher Scientific | 11-816 | |
Glycerol | N/A | N/A | |
Helber counting chambers with Thoma rulings | Hawksley Medical and Laboratory Equipment | For quantitating T. pallidum | |
Hemocytometer | N/A | N/A | For Sf1Ep cell quantitation |
Incubator tank switch | NuAire | NU-1550 TankGuard Automatic CO2 Incubator Tank Switch | Optional, but very helpful in maintaining appropriate O2 conditions. |
Inverted microscope with phase contrast optics | N/A | N/A | For viewing Sf1Ep cell cultures |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
Microscope with darkfield condensor | N/A | N/A | The microscope should have a 40x objective and 15x eyepieces. |
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
Multi-channel adapter for aspirator | Integra | 155520 | Optional, but useful for cloning |
NaHCO3 (7.5%) | Sigma-Aldrich | S8761 | |
Nitrogen for tri-gas incubator | N/A | N/A | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Sf1Ep (NBL-11) cells | American Type Culture Collection | CCL-68 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Sterile PBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sterile reagent reservoirs, 50 or 100 mL size | N/A | N/A | |
T. pallidum sample, frozen or fresh | from a rabbit infection or in vitro culture | ||
Tissue culture incubator maintained at 37 °C, 5% CO2 | N/A | N/A | |
Tri-gas tissue culture incubator maintained at 34 °C, 5% CO2, 1.5% O2 | Thermofisher | Heracell™ VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator | Optional; anaerobic jars may be used instead (see Ref. 17) |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Vacuum source (e.g. house vacuum), vacuum tubing, vacuum gauge, and connectors | N/A | N/A | |
Water, suitable for cell culture, filter-sterilized, purified | Sigma-Aldrich | W3500 | Recommended for medium preparation; decreases culture variability |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved