Method Article
Dieses Protokoll beschreibt die in vitro Kultivierung des Syphilis-Erregers Treponema pallidum subsp. pallidum in Co-Kultur mit Säugetierzellen. Die Methode ist skalierbar; Es kann zur Herstellung großer Mengen von T. pallidum und zur Erzeugung klonaler Kulturen verwendet werden.
Über ein Jahrhundert lang konnte Treponema pallidum subsp. pallidum, das spiralförmige Bakterium, das Syphilis verursacht, nur durch Inokulation und Ernte der Organismen aus Kaninchenhoden vermehrt werden. Im Jahr 2018 haben wir eine Methode zur kontinuierlichen Kultivierung von T. pallidumin vitro beschrieben. Dieses System verwendet eine Co-Kultur mit Kaninchen-Epithelzellen (Sf1Ep-Zellen) in einem serumhaltigen Gewebekulturmedium namens TpCM-2. Die Verdopplungszeit von T. pallidum in Kultur ist ähnlich wie bei einer natürlichen Infektion (ca. 33-45 h). Der Organismus kann kontinuierlich mit einer Standard-Passagezeit von 1 Woche in einer sauerstoffarmen Umgebung (1,5 %) bei 34 °C kultiviert werden. Dieser Artikel enthält die Protokolle für die Kultivierung von T. pallidum, Methoden für die Züchtung und Erhaltung der erforderlichen Gewebekulturzellen und die Technik zur Erzeugung isogener Stämme durch Begrenzung der Verdünnung. Die Möglichkeit, T. pallidum in vitro zu züchten, bietet neue experimentelle Möglichkeiten, diesen rätselhaften Organismus zu untersuchen und zu verstehen.
Treponema pallidum ist eine spiralförmige Bakterienart (Spirochäten genannt), die bei Menschen und anderen Primaten Syphilis und verwandte Infektionen verursacht. Syphilis ist eine schwere Krankheit mit langfristigen Auswirkungen auf infizierte Personen, und es wird geschätzt, dass jedes Jahr weltweit über 8 Millionen neue Fälle von Syphilis auftreten1. T. pallidum wurde in drei Unterarten unterteilt, basierend auf den Krankheiten, die sie beim Menschen verursachen, sowie geringfügigen genetischen Unterschieden: Unterart pallidum (Erreger der sexuell übertragbaren Krankheit Syphilis), Unterart pertenue (Frambösie) und Unterart endemicum (Verursacher von Bejel oder endemischer Syphilis)2,3. T. pallidum subsp. pertenue verursacht auch Infektionen bei Pavianen, Schimpansen und anderen Primaten. Ein eng verwandter Organismus namens Treponema paraluiscuniculi (auch Treponema paraluisleporidarum genannt) verursacht bei Kaninchen und Hasen eine Infektion 4,5. Alle diese Bakterien sind sehr eng miteinander verwandt, mit einer DNA-Sequenzidentität von mehr als 98 % auf Genomebene 6,7,8. Sie haben jeweils ein einzelnes, kleines zirkuläres Chromosom mit einer Größe von etwa 1,14 Millionen Basenpaaren (Mb). Die Mitglieder dieser T. pallidum-Gruppe kommen nur in Verbindung mit ihren Säugetierwirten vor; Als solche sind sie obligate Krankheitserreger, die für ihr Überleben und Wachstum von ihrer Wirtsspezies abhängig sind 9,10.
Versuche, T. pallidum in vitro zu kultivieren, begannen kurz nach seiner Identifizierung durch Schaudinn und Hoffman im Jahr 190511,12. Diese Bemühungen führten jedoch nicht zu einem konsistenten, reproduzierbaren Wachstum des Organismus. Infolgedessen erforderten Forschungsstudien zu T. pallidum die Vermehrung des Organismus durch die experimentelle Infektion von Labortieren, am häufigsten des Kaninchens13,14. Im Jahr 1981 führten Fieldsteel et al.15 ein Gewebekultursystem ein, das die Vermehrung von T. pallidum-Stämmen über einen Zeitraum von bis zu 2 Wochen förderte. Dieses System umfasste die Co-Kultur von T. pallidum mit Sf1Ep-Epithelzellen aus Baumwollschwanzkaninchen in einem modifizierten Gewebekulturmedium (T. pallidum Kulturmedium 1, TpCM-1) auf der Grundlage von Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) und 20 % fötalem Rinderserum (FBS). Weitere erforderliche Kulturbedingungen waren die Inkubation bei 34 °C in einer Atmosphäre, die 1,5 %O2 und 5 % CO2 9,16 enthielt. In diesem System bindet sich T. pallidum an die Sf1Ep-Zellen und vermehrt sich, wenn es in enger Verbindung mit der Zelloberfläche von Säugetieren steht. Trotz vieler Subkulturversuche und anderer Modifikationen gelang es dem System von Fieldsteel et al. nicht, ein kontinuierliches In-vitro-Wachstum zu fördern.
Im Jahr 2018 berichtete unser Labor, dass die Verwendung eines modifizierten Mediums namens TpCM-2 (bei dem Eagles MEM durch ein komplexeres Gewebekulturmedium, CMRL 1066, ersetzt wurde) T. pallidum die erforderlichen Nährstoffe lieferte, um eine konsistente Langzeitkultur zu ermöglichen17. Bisher hat diese Modifikation zu einer konsistenten, kontinuierlichen Kultur von mindestens 5 Stämmen von T. pallidum subsp. pallidum (Nichols, SS14, Mexico A, UW231B und UW249B) und einem Stamm von T. pallidum subsp. endemicum (Bosnien A)18,19 geführt. Als Beispiel wird der Nichols-Stamm nun seit über 6 Jahren kontinuierlich in vitro kultiviert. Bisher waren Versuche, Frambösie-Isolate (T. pallidum subsp. pertenue) oder T. paraluiscuniculiin vitro zu kultivieren, erfolglos18. Das TpCM-2-System erfordert immer noch das Vorhandensein von Sf1Ep-Zellen, niedrige Sauerstoffkonzentrationen und eine Inkubation bei 34 °C, was das System komplexer macht als die meisten Bakterienkulturtechniken. Dieses modifizierte T. pallidum-Kultursystem war jedoch nützlich für die weitere Definition der Wachstumsanforderungen des Bakteriums18, die Bestimmung minimaler inhibitorischer Konzentrationen (MICs) von antimikrobiellen Verbindungen und Peptiden20,21,22,23,24,25, die Vermehrung neuer Stämme aus Patientengewebeaspiraten26 und die Isolierung klonaler Populationen der Organismus27, Charakterisierung des antigenen Variationssystems tprK 27,28, Untersuchung der Genexpression29 und Durchführung von Mutationsanalysen 30,31,32.
Hier beschreiben wir die aktuellen Methoden zur Kultivierung von T. pallidum in vitro. Wir hoffen, dass diese Informationen dazu beitragen werden, die breitere Anwendung dieser In-vitro-Kulturtechnik zur Verbesserung der Diagnose, Behandlung und Prävention von Syphilis und verwandten Treponemalinfektionen zu erleichtern.
HINWEIS: Alle Schritte erfordern die Verwendung einer aseptischen Technik sowie steriler Materialien und Reagenzien. Die Verwendung einer Laminar-Flow-Haube für Gewebekulturen wird empfohlen, um sowohl a) die Exposition des Personals gegenüber infektiösem Material als auch b) die Möglichkeit einer mikrobiellen Kontamination der Kulturen zu reduzieren.
1. Aufbau von Sf1Ep-Zellbeständen
HINWEIS: Sf1Ep Baumwollschwanz-Kaninchen-Epithelzellen können als gefrorene Bestände aus der American Type Culture Collection erworben werden (siehe Materialtabelle). Das langsame Wachstum und die niedrige Stoffwechselrate von Sf1Ep-Zellen scheinen der Schlüssel zu ihrer Fähigkeit zu sein, das langfristige Überleben und Wachstum von T. pallidumzu unterstützen 33; Daher wird eine Substitution mit anderen Säugetierzellkulturen nicht empfohlen. Sf1Ep-Zellen sind keine immortalisierte Zelllinie und können nur 25-30 Passagen in Kultur aufbewahrt werden. Daher ist es wichtig, einen gefrorenen Bestand an Sf1Ep-Zellen mit niedrigem Durchgang für die zukünftige Verwendung vorzuhalten. Immortalisierte Sf1Ep-Linien entstehen gelegentlich während der Langzeitkultur von Sf1Ep-Zellen. (unveröffentlichte Beobachtungen). Diese Linien wachsen oft schneller und sind einfacher zu handhaben; Manchmal verlieren sie jedoch die Fähigkeit, das Wachstum von T. pallidum zu unterstützen. Immortalisierte Sf1Ep-Leinen können verwendet und dann ersetzt werden, wenn die Spirochäten langsam zu wachsen beginnen.
2. Passieren von Sf1Ep-Zellen
HINWEIS: Das Wachstum der Sf1Ep-Zellkultur wird mit einem inversen Mikroskop unter Verwendung einer Phasenkontrastoptik überwacht. Normalerweise dauert es etwa eine Woche, bis die Zellen nahezu konfluenzfähig sind. Wenn die Zellen eine Konfluenz von ~90% erreichen, können sie passieren, für die Kultivierung von T. pallidum oder die Zubereitung von gefrorenen Brühen verwendet werden. Die Lebensdauer der Kultur kann auf zwei Wochen verlängert werden, indem die Hälfte des Nährmediums nach einer Woche Kultur ausgetauscht wird.
3. Anbau von T. pallidum
VORSICHT: Alle Unterarten und Stämme von T. pallidum sind für den Menschen pathogen und als Krankheitserreger der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2)34 eingestuft. Zum Schutz des Personals sind geeignete Maßnahmen erforderlich; Dazu gehören die Verwendung von Handschuhen und anderer persönlicher Schutzausrüstung (PSA) sowie die Desinfektion von Oberflächen, Materialien und Flüssigkeiten, die möglicherweise T. pallidum ausgesetzt sind. T. pallidum lässt sich leicht inaktivieren, wenn man 70%igem Ethanol oder handelsüblichen Desinfektionsmitteln ausgesetzt wird. Die konsequente Verwendung von Laminar-Flow-Hauben für den Umgang mit Proben, die T. pallidum enthalten, wird empfohlen.
HINWEIS: T. pallidum ist ein mikroaerophiler Organismus, der durch einige Stunden Exposition gegenüber atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen 9,16,35 abgetötet werden kann. Daher wird empfohlen, den Umgang mit T. pallidum an der Luft nach Möglichkeit auf weniger als eine Stunde zu beschränken. Außerdem sollte das TpCM-2-Medium in 1,5 % O2, 5 % CO2 und dem Rest N2 voräquilibriert werden, und kräftiges Rühren (z. B. Verwendung eines Wirbels) sollte begrenzt werden. Da die T. pallidum-Kultur in der Regel ohne Antibiotika durchgeführt wird, ist besondere Vorsicht geboten, um eine Kontamination mit Bakterien oder Pilzen zu vermeiden. Das Sf1Ep-TpCM-2-Verfahren zur Kultivierung von T. pallidum ist in Abbildung 1 zusammengefasst und umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Aussaat von Kulturgefäßen mit Sf1Ep-Zellen, der Vorbereitung des TpCM-2-Mediums und der Inokulation der Kulturen mit T. pallidum. Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) ist eine kritische Komponente des Mediums, und seine Wirksamkeit variiert je nach Anbieter und Charge19. Ein Vorab-Screening von FBS-Chargen auf Wirksamkeit ist erforderlich.
4. Ernte und Passage von T. pallidum-Kulturen
HINWEIS: Da der Großteil von T. pallidum in Kultur an der Oberfläche der Sf1Ep-Zellen gebunden ist, ist es notwendig, die Treponeme von den Säugetierzellen zu trennen, um sie zu gewinnen und eine genaue Zählung der Organismen zu erhalten. Eine solche "Ernte" und der Übergang zu frischen Kulturen erfolgt in der Regel am 7. Tag der Kultur. Das hier beschriebene Verfahren gilt für 6-Well-Platten; Die Menge der verwendeten Trypsin-EDTA-Lösung wird je nach Größe des Kulturformats nach oben oder unten angepasst 17,19,27.
5. Einfrieren und Lagern von T. pallidum-Kulturen
HINWEIS: T. pallidum kann unbegrenzt bei oder unter -70 °C gelagert werden, wobei die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen typischerweise 50 % bis 90 % beträgt.
6. Erzeugung isogener Klone von T. pallidum
HINWEIS: Dieses Verfahren ist in einer früheren Studieausführlich beschrieben 27.
Unter den beschriebenen Bedingungen behält T. pallidum typischerweise eine Motilität von >90 % bei und vermehrt sich logarithmisch mit einer Verdopplungszeit von 33 h bis 45 h für etwa 7 Tage, bevor es in die stationäre Phase eintritt (Abbildung 3). Im Laufe von 1 Woche durchlaufen die Spirochäten etwa 4-5 Verdopplungen (Abbildung 4). ). Darüber hinaus können verschiedene Stämme von T. pallidum unterschiedlich schnell wachsen. Stämme der SS14-Gruppe von T. pallidum neigen dazu, langsamere Verdopplungszeiten zu haben als die der Nichols-Gruppe17.
Die Fütterung von Kulturen kann die Kulturzeit um mehrere Tage verlängern, aber die Sf1Ep-Zellschicht versagt oft nach einer Woche Kultur. Darüber hinaus erreichen die Treponeme eine Obergrenze für Organismen von etwa 5 x 107/ml. Kulturen, die in Abständen von 7 Tagen übertragen werden, setzen in der Regel die logarithmische Multiplikation mit geringer oder keiner Verzögerungsphase fort. Organismen in der stationären Phase sind oft schwer zu passieren.
Die meisten T. pallidum sind an die Sf1Ep-Zellen gebunden. Es verbleibt jedoch so viel T. pallidum im Überstand, dass die Proben des Mediums regelmäßig entnommen werden können, um die Lebensfähigkeit und Vermehrung zu überprüfen. Wenn eine sorgfältige Quantifizierung erforderlich ist, sollte das Volumen des entnommenen Mediums gemessen, die Anzahl von T. pallidum quantifiziert und die Gesamtzahl der entfernten Organismen zu den endgültigen Zählungen bei der Ernte addiert werden.
In früheren Studien betrug die Klonierungseffizienz (Anzahl der positiven Kulturen pro geimpftem Organismus) 12,5 % für 2 T. pallidum , die pro Vertiefung geimpft wurden, und 6,7 % für 0,5 T. pallidum , die pro Vertiefung geimpft wurden27. Daher ist es wahrscheinlich, dass jede positive Vertiefung das Auswachsen eines einzelnen Organismus an einer dieser Inokula darstellt. Die Klonalität der resultierenden Populationen muss jedoch verifiziert werden, indem die Kultur an Stellen, die in der Elternkultur heterogen sind, auf Homogenität untersucht wird. Der eindeutigste Weg, um nachzuweisen, dass die Kultur isogen ist, ist die Sequenzierung des gesamten Genoms27.
Abbildung 1: Flussdiagramm des In-vitro-Kultivierungsverfahrens von T. pallidum . Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Edmondson und Norris (2021)19 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Diagramm des Systems zur Äquilibrierung von Reagenzien der T . pallidum-Kultur in einer sauerstoffarmen Umgebung. Eine Entlüftung eines Brauerglases wird über ein T-Gelenk mit einer Vakuumquelle (z. B. einem Hausvakuum) und mit Gasflaschen verbunden, die kundenspezifische Gasgemische enthalten (5 % CO2, Balance Stickstoff und 1,5 % O2, 5 % CO2, Balance Stickstoff). Ein Inline-Vakuummeter misst das im Gefäß gezogene Vakuum. Das Vakuum wird im Gefäß auf ca. -58 kPa gezogen. Das evakuierte Gefäß wird dann langsam wieder mit den Gasgemischen befüllt. Das Brauglas wird dreimal mit 5 % CO2 nachgefüllt, vor einer abschließenden Evakuierung mit Stickstoff ausgeglichen und mit 95 % N2, 5 % CO2 und 1,5 % O2 aufgefüllt. Kulturen oder Medien werden dann aus dem Glas entnommen und schnell in den sauerstoffarmen Inkubator überführt. Alternativ kann der Schlauch zwischen dem Brewerglas und dem ersten T-Gelenk fest geklemmt, der Schlauch vom T-Gelenk getrennt und das gesamte Brewerglas in einen 34 °C heißen Inkubator überführt werden. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Edmondson und Norris (2021)19 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Wachstumskurven von T. pallidum , kultiviert mit Sf1Ep-Zellen mit TpCM-2-Medium. Parallele dreifache Kulturen wurden mit T. pallidum besiedelt. Zu jedem Zeitpunkt wurden Replikate geerntet; Die Ergebnisse stellen den Mittelwert + SEM für diese Kulturen dar. (A) Die Veränderungen von T. pallidum pro Kultur und (B) prozentuale Motilität sind dargestellt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Edmondson et al.18 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispiel für die Passage einer In-vitro-Kultur von T. pallidum, Nichols-Stamm. Parallele dreifache Kulturen wurden mit T. pallidum besät und wöchentlich in einer Verdünnung von 1:20 verabreicht. Das Sägezahndiagramm zeigt die Anzahl von T. pallidum pro Kultur und die Anzahl, die zu jedem Zeitpunkt in neue Kulturen übertragen wurde. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SEM für drei biologische Replikate dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Mittleres Volumen und Aussaatverhältnis für Kulturgefäße. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Medien für den Anbau von T. pallidum . Alle Medien sollten nach der Aufbereitung filtersterilisiert werden. Das Sf1Ep-Medium kann bis zu zwei Monate bei 4 °C gelagert werden. TpCM-2 wird in der Regel einen Tag vor der Anwendung hergestellt. Das Dissoziationsmedium sollte aliquotiert und eingefroren werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Das Sf1Ep-TpCM-2-System ist das erste verfügbare Verfahren, das die kontinuierliche In-vitro-Kultur von T. pallidum fördert. Das System ist aufgrund der extremen Wachstumsanforderungen dieses Organismus komplex: 1) komplexe Ernährungsbedürfnisse aufgrund begrenzter Biosynthesefähigkeiten; 2) ein wenig verstandener Bedarf an kleinen Sauerstoffmengen trotz hoher Empfindlichkeit gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies 9,10,16,36; und 3) der derzeitige Bedarf an Sf1Ep-Zellen. Obwohl es verlockend ist, bei dem Verfahren Abstriche zu machen, wird empfohlen, die Schritte sorgfältig zu befolgen, bis eine erfolgreiche Langzeitkultur erreicht ist, bevor Änderungen ausprobiert werden. Wenn sich zusätzliche Informationen über den metabolischen Bedarf von T. pallidum ansammeln, kann es möglich sein, axenische Zustände zu entwickeln, die keine Sf1Ep-Zellen erfordern. Die In-vitro-Wachstumsrate wird jedoch wahrscheinlich langsam bleiben (mit einer minimalen Verdopplungszeit von 33 h bis 46 h, je nach Stamm)17,18, da sich T. pallidum auch während einer Säugetierinfektion mit einer geschätzten Verdopplungszeit von 30 h bis 33 h vermehrt37,38. Wie bei jeder Bakterienkultur wird empfohlen, niedrige Passagenbestände beizubehalten und Experimente mit T. pallidum-Kulturen durchzuführen, die weniger als 10 Passagen von diesen Stämmen entfernt sind, um eine "genetische Drift" und damit verbundene phänotypische Veränderungen aufgrund von Mutationen zu vermeiden.
Sf1Ep-Zellen versorgen die Treponeme offenbar mit essentiellen Nährstoffen oder enzymatischen Aktivitäten. Sie verbrauchen jedoch auch Nährstoffe (wie Glukose und Sauerstoff) und können toxische Bedingungen wie einen niedrigen pH-Wertvon 9,16,39 hervorrufen. Daher besteht ein Balanceakt zwischen genügend Sf1Ep-Zellen zur Unterstützung der Vermehrung von T. pallidum und der Verhinderung des Überwachsens und der Toxizität von Säugetierzellen. Hohe Passagezahlen von Sf1Ep-Zellen neigen dazu, schneller zu wachsen und verlieren manchmal die Fähigkeit, die Vermehrung von T. pallidum zu unterstützen. Daher sollte die Passagenummer von Sf1Ep überwacht werden, und die Zellbestände sollten regelmäßig durch gefrorene Präparate mit niedriger Passage ersetzt werden. Das Vorhandensein von Sf1Ep-Zellen erschwert auch die Untersuchung von T. pallidum-Eigenschaften wie DNA-, RNA- und Proteingehalt sowie Enzymaktivitäten. Die Entnahme der Kaninchenzellen ist bis zu einem gewissen Grad durch wiederholte Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit (100 x g für 5 min) oder effektiver unter Verwendung von Percoll- oder Hypaque-Gradientenmöglich 40,41. Die Methoden der Gradientenzentrifugation sind jedoch in der Regel nur bei hohen Anzahlen von T. pallidum wirksam. Alternative Methoden zur Vermehrung von T. pallidum sind auf die Infektion von Versuchstieren wie Kaninchen beschränkt13,14. Dieser Ansatz ist ethisch begründet und ist immer teurer geworden; Das Kaninchenmodell ist jedoch sehr nützlich für die Untersuchung der Pathogenese von T. pallidum und der Immunantworten des Wirts. Darüber hinaus gibt es wahrscheinlich einige Unterschiede in der Genexpression, dem Wachstum oder dem Verhalten von T. pallidum während der In-vitro-Kultur und der Kanincheninfektion27.
Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Berichts war das Sf1Ep-TpCM-2-System in mindestens 6 Forschungsgruppen in den Vereinigten Staaten und Europa etabliert und hat zu 16 Veröffentlichungen mit Themen geführt, die von der grundlegenden Biologie und Genetik von T. pallidum bis hin zur antimikrobiellen Empfindlichkeit reichen. Der Wert der In-vitro-Kultur bei der Erforschung dieses rätselhaften Erregers wird wahrscheinlich mit zunehmender Nutzung und zukünftigen Verbesserungen zunehmen.
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium R01 AI141958 der United States National Institutes of Health/NIAID unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E8008 | |
10x Earle’s Balanced Salts, w/o Mg2+, Ca2+ | Gibco | 14155063 | |
15 and 50 mL conical sterile disposable centrifuge tubes | N/A | N/A | |
2 mL cryogenic vials | Corning | 430659 | |
6-well cell culture plates for T. pallidum cultivation | Falcon | 353046 | The plates must have low evaporation lids. |
70% ethanol | N/A | N/A | |
75 cm2 tissue culture flasks with vented caps | Corning | 43061U | |
93.5% nitrogen, 5% CO2, and 1.5% oxygen for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
95% nitrogen and 5% CO2 for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
96-well low evaporation clear, flat-bottom tissue culture-treated microplates | Corning Falcon | 353072 | |
Adjustable multi-channel pipette with 200 ul capacity | N/A | N/A | Optional, but very helpful for cloning |
Cell culture grade water | Sigma | W3500 | |
CMRL 1066 without L-Glutamine or Phenol Red | US Biological | C5900-03A | |
CO2 for tri-gas and tissue culture incubators | N/A | N/A | |
Cryogenic liquid nitrogen cell culture storage tank | N/A | N/A | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
Disposable filter units, 0.2 µm , > 100 mL capacity | N/A | N/A | |
Disposable pipets: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspirating | N/A | N/A | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M1902 | |
DMSO (sterile cell culture grade ) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Eagle’s MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
Fetal bovine serum, heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | We highly recommend this product. Must pre-screen for T. pallidum culture compatibility if using a different brand or catalog number. |
Freezer with capability of maintaining -70 °C or -80 °C | N/A | N/A | For storage of T. pallidum; liquid nitrogen storage may be used instead |
Freezing medium (Sf1Ep medium + 10% [v/v] DMSO) | N/A | N/A | |
Gas cylinders with appropriate fittings | N/A | N/A | |
GasPak 150 vented anaerobic jar (Brewer Jar) | Fisher Scientific | 11-816 | |
Glycerol | N/A | N/A | |
Helber counting chambers with Thoma rulings | Hawksley Medical and Laboratory Equipment | For quantitating T. pallidum | |
Hemocytometer | N/A | N/A | For Sf1Ep cell quantitation |
Incubator tank switch | NuAire | NU-1550 TankGuard Automatic CO2 Incubator Tank Switch | Optional, but very helpful in maintaining appropriate O2 conditions. |
Inverted microscope with phase contrast optics | N/A | N/A | For viewing Sf1Ep cell cultures |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
Microscope with darkfield condensor | N/A | N/A | The microscope should have a 40x objective and 15x eyepieces. |
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
Multi-channel adapter for aspirator | Integra | 155520 | Optional, but useful for cloning |
NaHCO3 (7.5%) | Sigma-Aldrich | S8761 | |
Nitrogen for tri-gas incubator | N/A | N/A | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Sf1Ep (NBL-11) cells | American Type Culture Collection | CCL-68 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Sterile PBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sterile reagent reservoirs, 50 or 100 mL size | N/A | N/A | |
T. pallidum sample, frozen or fresh | from a rabbit infection or in vitro culture | ||
Tissue culture incubator maintained at 37 °C, 5% CO2 | N/A | N/A | |
Tri-gas tissue culture incubator maintained at 34 °C, 5% CO2, 1.5% O2 | Thermofisher | Heracell™ VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator | Optional; anaerobic jars may be used instead (see Ref. 17) |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Vacuum source (e.g. house vacuum), vacuum tubing, vacuum gauge, and connectors | N/A | N/A | |
Water, suitable for cell culture, filter-sterilized, purified | Sigma-Aldrich | W3500 | Recommended for medium preparation; decreases culture variability |
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