JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, sifiliz patojeni Treponema pallidum subsp. pallidum'un memeli hücreleri ile ko-kültürde in vitro kültivasyonunu tanımlar. Yöntem ölçeklenebilir; büyük miktarlarda T. pallidum üretmek ve klonal kültürler oluşturmak için kullanılabilir.

Özet

Bir asırdan fazla bir süredir, Frengiye neden olan spiral şekilli bakteri olan Treponema pallidum subsp. pallidum, yalnızca organizmaların tavşan testislerinden aşılanması ve toplanmasıyla çoğaltılabilirdi. 2018 yılında, T. pallidumin vitro'yu sürekli olarak yetiştirmek için bir yöntem tanımladık. Bu sistem, TpCM-2 adı verilen serum içeren bir doku kültürü ortamında tavşan epitel hücreleri (Sf1Ep hücreleri) ile ko-kültür kullanır. Kültürdeki T. pallidum iki katına çıkma süresi, doğal enfeksiyon sırasında (yaklaşık 33-45 saat) meydana geldiği tahmin edilene benzer. Organizma, 34 ° C'de düşük oksijenli (% 1.5) bir ortamda 1 haftalık standart bir geçiş süresi ile sürekli olarak kültürlenebilir. Bu makale, T. pallidum'un kültürlenmesi için protokolleri, gerekli doku kültürü hücrelerini büyütme ve sürdürme yöntemlerini ve seyreltmeyi sınırlayarak izojenik suşlar oluşturma tekniğini içerir. T. pallidum'u in vitro olarak büyütme yeteneği, bu esrarengiz organizmayı incelemek ve anlamak için yeni deneysel yollar sağlar.

Giriş

Treponema pallidum, insanlarda ve diğer primatlarda sifiliz ve buna bağlı enfeksiyonlara neden olan spiral şekilli bir bakteri türüdür (spiroket olarak adlandırılır). Frengi, enfekte bireyler üzerinde uzun vadeli etkileri olan ciddi bir hastalıktır ve her yıl dünya çapında 8 milyondan fazla yeni sifiliz vakasının ortaya çıktığı tahmin edilmektedir1. T. pallidum, insanlarda neden oldukları hastalıklara ve küçük genetik farklılıklara bağlı olarak üç alt türe ayrılmıştır: alt tür pallidum (cinsel yolla bulaşan frengi hastalığına neden olur), alt tür pertenue (yaws) ve alt tür endemicum (bejel veya endemik sifilize neden olur)2,3. T. pallidum subsp. pertenue ayrıca babunlarda, şempanzelerde ve diğer primatlarda enfeksiyonlara neden olur. Treponema paraluiscuniculi (Treponema paraluisleporidarum olarak da bilinir) adı verilen yakından ilişkili bir organizma, tavşanlarda ve tavşanlardaenfeksiyona neden olur 4,5. Bu bakterilerin tümü çok yakından ilişkilidir ve genom düzeyinde 6,7,8% 98'den fazla DNA dizisi kimliği vardır. Her birinin yaklaşık 1.14 milyon baz çifti (Mb) boyutunda tek, küçük dairesel bir kromozomu vardır. Bu T. pallidum grubunun üyeleri, yalnızca memeli konakçılarıyla ilişkili olarak bulunur; Bu nedenle, hayatta kalmak ve büyümek için konakçı türlerine bağımlı olan zorunlu patojenlerdir 9,10.

T. pallidum'u in vitro kültürleme girişimleri, 1905'te Schaudinn ve Hoffman tarafından tanımlanmasından kısa bir süre sonra başladı11,12. Bununla birlikte, bu çabalar organizmanın tutarlı, tekrarlanabilir büyümesine yol açamadı. Sonuç olarak, T. pallidum araştırma çalışmaları, laboratuvar hayvanlarının, en yaygın olarak tavşanın deneysel enfeksiyonu yoluyla organizmanın yayılmasını gerektirmiştir13,14. 1981 yılında, Fieldsteel ve ark.15, T. pallidum suşlarının 2 haftaya kadar bir süre boyunca çoğalmasını teşvik eden bir doku kültürü sistemi tanıttı. Bu sistem, T. pallidum'un Eagle's Minimum Esansiyel Ortamı (MEM) ve% 20 fetal sığır serumu (FBS) bazlı modifiye edilmiş bir doku kültürü ortamında (T. pallidum Kültür Ortamı 1, TpCM-1) Sf1Ep pamuk kuyruklu tavşan epitel hücreleri ile ko-kültürünü içeriyordu. Gerekli diğer kültür koşulları,% 1.5 O2 ve% 5 CO2 9,16 içeren bir atmosferde 34 ° C'de inkübasyondu. Bu sistemde, T. pallidum Sf1Ep hücrelerine bağlanır ve memeli hücre yüzeyi ile yakın ilişki içinde olduğunda çoğalır. Birçok alt kültür girişimine ve diğer modifikasyonlara rağmen, Fieldsteel ve ark. sistem sürekli in vitro büyümeyi teşvik edemedi.

2018'de laboratuvarımız, TpCM-2 (Eagle'ın MEM'inin daha karmaşık bir doku kültürü ortamı olan CMRL 1066 ile değiştirildiği) adı verilen modifiye edilmiş bir ortamın kullanılmasının, T. pallidum'a tutarlı uzun vadeli kültüre izin vermek için gerekli besinleri sağladığını bildirdi17. Bugüne kadar, bu modifikasyon en az 5 T. pallidum subsp. pallidum suşu (Nichols, SS14, Meksika A, UW231B ve UW249B) ve bir T. pallidum subsp. endemicum (Bosna A)18,19. Örnek olarak, Nichols suşu 6 yılı aşkın bir süredir sürekli olarak in vitro olarak kültürlenmektedir. Şimdiye kadar, yaws izolatları (T. pallidum subsp. pertenue) veya T. paraluiscuniculiin vitro kültür girişimleri başarısız olmuştur18. TpCM-2 sistemi hala Sf1Ep hücrelerinin varlığını, düşük oksijen konsantrasyonlarını ve 34 ° C'de inkübasyonu gerektirir ve bu da sistemi çoğu bakteri kültürü tekniğinden daha karmaşık hale getirir. Bununla birlikte, bu modifiye edilmiş T. pallidum kültür sistemi, bakterinin büyüme gereksinimlerini18 daha fazla tanımlamak, antimikrobiyal bileşiklerin ve peptitlerin 20,21,22,23,24,25 minimal inhibitör konsantrasyonlarını (MIC'ler) belirlemek, hasta dokusu aspiratlarından yeni suşları yaymakiçin yararlı olmuştur 26, bakterinin klonal popülasyonlarını izole etmek organizma27, tprK antijenik varyasyon sisteminikarakterize eder 27,28, gen ekspresyonunuinceler 29 ve mutasyon analizi yapar30,31,32.

Burada, T. pallidum'un in vitro olarak yetiştirilmesi için mevcut yöntemleri açıklıyoruz. Bu bilgilerin, sifiliz ve ilgili treponemal enfeksiyonların daha iyi teşhisi, tedavisi ve önlenmesi için bu in vitro kültür tekniğinin daha yaygın bir şekilde uygulanmasını kolaylaştırmaya yardımcı olacağını umuyoruz.

Protokol

NOT: Tüm adımlar, aseptik bir tekniğin ve steril malzemelerin ve reaktiflerin kullanılmasını gerektirir. Hem a) personelin bulaşıcı materyale maruz kalmasını hem de b) kültürlerin mikrobiyal kontaminasyon olasılığını azaltmak için bir doku kültürü laminer akış başlığının kullanılması önerilir.

1. Sf1Ep hücre stoklarının oluşturulması

NOT: Sf1Ep pamuk kuyruklu tavşan epitel hücreleri, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan donmuş stoklar olarak satın alınabilir (bkz. Malzeme Tablosu). Sf1Ep hücrelerinin yavaş büyüyen doğası ve düşük metabolik hızı, T. pallidum33'ün uzun süreli sağkalımını ve büyümesini destekleme yeteneklerinin anahtarı gibi görünmektedir; bu nedenle, diğer memeli hücre kültürleri ile ikame edilmesi önerilmez. Sf1Ep hücreleri ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı değildir ve kültürde sadece 25-30 geçiş için korunabilir. Bu nedenle, ileride kullanılmak üzere donmuş bir düşük geçişli Sf1Ep hücre stoğunun muhafaza edilmesi önemlidir. Ölümsüzleştirilmiş Sf1Ep çizgileri bazen Sf1Ep hücrelerinin uzun süreli kültürü sırasında ortaya çıkar. (yayınlanmamış gözlemler). Bu çizgiler genellikle daha hızlı büyür ve kullanımı daha kolaydır; bununla birlikte, bazen, T. pallidum büyümesini destekleme yeteneğini kaybederler. Ölümsüzleştirilmiş Sf1Ep çizgileri kullanılabilir ve daha sonra spiroketler yavaş yavaş büyümeye başladığında değiştirilebilir.

  1. Bir Sf1Ep hücre ortamı hazırlayın ve 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde önceden ısıtın.
    NOT: Sf1Ep hücre ortamı, %10 FBS, 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat ile desteklenmiş Eagle'ın MEM'inden oluşur. (Bkz . Malzeme Tablosu). Ortam filtreyle sterilize edilmelidir ve 4 ° C'de 2 aya kadar saklanabilir. Antibiyotikler (penisilin ve streptomisin gibi) Sf1Ep hücre ortamında kullanılmamalıdır, çünkü eser miktarda antibiyotiğin taşınması bile T. pallidum'un büyümesini engelleyecektir.
  2. Dondurulmuş Sf1Ep stoğunu 37 °C'de hızlı bir şekilde çözdürün. Şişenin dışını %70 etanol ile silin.
  3. Kriyoviyal için 1 mL Sf1Ep hücre ortamı ekleyin ve hafifçe karıştırın. Ortam/hücre stok karışımını, 5 mL Sf1Ep hücre ortamı içeren steril 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  4. Hücreleri 7 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarın ve atın.
  5. Çözülmüş Sf1Ep hücrelerini 15 mL taze Sf1Ep hücre ortamında nazikçe yeniden süspanse edin ve bunları bir T75 doku kültürü şişesine aktarın.
    NOT: Yeni çözülmüş Sf1Ep hücrelerinin geri kazanımı, hücreleri dondurmak için kullanılan DMSO'yu çıkarmak için santrifüjleme ile iyileştirilir. Bununla birlikte, 1.4-1.7 adımları atlanabilir ve 3. adımdaki çözülmüş hücreler doğrudan 14 mL Sf1Ep hücre ortamı içeren bir T75 doku kültürü şişesine ekilebilir. Gece boyunca inkübasyondan sonra, kalan DMSO'yu seyreltmek için ortamın yarısını taze Sf1Ep ortamı ile değiştirin.
  6. Sf1Ep kültürlerini 37 °C, %5 CO2'de standart bir nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Uygun ortam pH'ını korumak için havalandırılmamış doku kültürü şişelerinin kapaklarını gevşetin.

2. Sf1Ep hücrelerinin geçirilmesi

NOT: Sf1Ep hücre kültürü büyümesi, faz kontrast optikleri kullanılarak ters çevrilmiş bir mikroskopla izlenir. Tipik olarak, hücrelerin birleşmeye yakın bir yere ulaşması yaklaşık bir hafta sürer. Hücreler ~% 90 birleşmeye ulaştığında, geçirilebilir, T. pallidum yetiştiriciliği veya donmuş stokların hazırlanması için kullanılabilir. Kültür ömrü, bir haftalık kültürden sonra kültür ortamının yarısının değiştirilmesiyle iki haftaya kadar uzatılabilir.

  1. Sf1Ep büyüme ortamını şişeden aspire edin ve atın. Hücre tabakasını oda sıcaklığında (RT) 5 mL steril PBS ile durulayın ve PBS durulamasını aspire edin ve atın.
  2. Şişeye 2,5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve kapağı kapatın. Hücre katmanını tripsin-EDTA ile kaplamak için şişeyi ileri geri sallayın ve şişeyi 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
  3. Hücreleri yerinden çıkarmak için şişeye hafifçe vurun. Sf1Ep hücrelerinin dağılmasını doğrulamak için ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin.
  4. 5 mL Sf1Ep büyüme ortamı ekleyin ve tripsin-EDTA ile karıştırmak ve tripsinin etkisini durdurmak için şişeyi sallayın. Askıya alınmış Sf1Ep hücrelerini steril bir konik tüpe çıkarın.
  5. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri ölçün.
  6. Çalışan hücre stoklarını korumak için, ortam / tripsin-EDTA / hücre karışımının bir alikotunu (0.5-1.0 mL veya ~ 8 x 105 hücre) 15 mL taze Sf1Ep ortamı içeren yeni bir T75 doku kültürü şişesine aktarın.
  7. T. pallidum kültürü için, Sf1Ep ortamındaki hücreleri 0.25-0.5 x 105 hücre / mL'ye seyreltin ve uygun kültür kaplarına tohumlayın (Tablo 1).
  8. Sf1Ep hücrelerini dondurmak için, 7 dakika boyunca 100 x g'da bir masa üstü santrifüjde döndürün. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücre peletini% 10 doku kültürü dereceli DMSO ile desteklenmiş Sf1Ep ortamında yeniden süspanse edin.
  9. Her bir kriyoviyal için 1 mL hücre süspansiyonu dağıtın ve şişeleri sıvı nitrojen kriyojenik bir kaba aktarmadan önce canlılığın korunmasını artırmak için yalıtılmış bir kapta (strafor test tüpü tutucusu gibi) -70 ° C ila -80 ° C arasında gece boyunca dondurun.

3. T. pallidum'un yetiştirilmesi

DİKKAT: Tüm T. pallidum alt türleri ve suşları insanlar için patojeniktir ve Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) Patojenleri34 olarak sınıflandırılır. Personeli korumak için uygun önlemler gereklidir; bunlar arasında eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipmanların (KKD) kullanımının yanı sıra potansiyel olarak T. pallidum'a maruz kalan yüzeylerin, malzemelerin ve sıvıların dezenfeksiyonu yer alır. T. pallidum ,% 70 etanol veya ticari olarak temin edilebilen dezenfektanlara maruz bırakılarak kolayca inaktive edilir. T. pallidum içeren numunelerin taşınması için laminer akış başlıklarının tutarlı bir şekilde kullanılması önerilir.

NOT: T. pallidum, atmosferik oksijen 9,16,35 seviyelerine birkaç saat maruz kaldığında öldürülebilen mikroaerofilik bir organizmadır. Bu nedenle, T. pallidum'un havada işlenmesinin mümkünse bir saatten daha az bir süre ile sınırlandırılması önerilir. Ayrıca, TpCM-2 ortamı% 1.5 O2,% 5 CO2, denge N2 içinde önceden dengelenmeli ve kuvvetli karıştırma (örneğin, bir girdap kullanımı) sınırlandırılmalıdır. T. pallidum kültürü tipik olarak antibiyotik yokluğunda gerçekleştirildiğinden, bakteri veya mantarlarla kontaminasyonu önlemek için ekstra özen gösterilmesi gerekir. T. pallidum'un kültürlenmesi için Sf1Ep-TpCM-2 prosedürü Şekil 1'de özetlenmiştir ve kültür kaplarının Sf1Ep hücreleri ile tohumlanması, TpCM-2 ortamının hazırlanması ve kültürlerin T. pallidum ile aşılanması dahil olmak üzere çok sayıda adımı içerir. Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) kritik bir orta bileşendir ve etkinliği farklı tedarikçiler ve lotlararasında değişir 19. FBS lotlarının etkinlik açısından ön taraması gereklidir.

  1. Uygun kültür boyutunu seçin.
    NOT: T. pallidum kültürü, büyük formatlardan (kültür başına ~1 x 109T. pallidum veren 75 cm'lik2 şişe gibi) 96 oyuklu plakalara (klonlama deneyleri için uygundur) ölçeklenebilir17,18,19,27. 
    1. Kültür boyutunu ayarlarken, Tablo 1'de gösterildiği gibi, kültür başına aşılanan Sf1Ep hücrelerinin ve T. pallidum'un sayısını ve ayrıca ihtiyaç duyulan ortam miktarını dikkate alın. Buharlaşma nedeniyle daha az hacim kaybı ile gazların serbest dolaşımına izin verdikleri için havalandırmalı kapaklı şişeler kullanın.
    2. İlk kültürler için 6 oyuklu plaka formatını kullanın, çünkü mikrobiyal kontaminasyonun meydana gelmesi durumunda üçlü kopyaları ve ekstra kuyucukları dahil etmek uygundur.
  2. Deneyden 1-2 gün önce Sf1Ep hücrelerini tohumlayın.
    1. Adım 2.7'de tarif edildiği gibi, stok kültürlerinin tripsinizasyonu ile Sf1Ep hücrelerinin bir süspansiyonunu hazırlayın.
    2. Bir hematitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak süspansiyondaki Sf1Ep hücrelerinin konsantrasyonunu belirleyin.
    3. Her kültüre uygun sayıda Sf1Ep hücresi ve Sf1Ep ortamı (Tablo 1) ekleyin. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile standart bir doku kültürü inkübatöründe kullanıma kadar inkübe edin.
  3. Deneyden 1 gün önce TpCM-2'yi hazırlayın.
    NOT: TpCM-2 birkaç ay boyunca -20 ° C'de hazırlanabilir ve saklanabilir. Ortam, deneyden bir gün önce düşük oksijenli inkübatörde çözülmeli ve dengelenmelidir.
    1. TpCM-2 (Tablo 2) bileşenleri için ticari olarak steril çözeltiler elde edin veya bunları kuru reaktiflerden hazırlayın ve filtreyle sterilize edin. Solüsyonları 4 °C'de 2 aya kadar saklayın. Filtre sterilizasyonundan önce MOPS tamponunun pH'ını 7,5'e ayarlayın; aksi takdirde, bileşenlerin veya nihai TpCM-2'nin pH ayarına ihtiyacı yoktur.
      NOT: Ortam bileşenlerinin hazırlanması için steril, doku kültürü dereceli damıtılmış su kullanılması önerilir.
    2. Tablo 2'de listelenen reaktifleri steril bir kapta birleştirin ve en son kuru toz olarak ditiyotreitol (DTT) ekleyin (oksidasyonunu en aza indirmek için). Gerekli miktarda TpCM-2 hazırlamak için her bir bileşenin miktarlarını artırın (veya azaltın). 0,22 μm'lik bir filtre ünitesi kullanarak ortamı nazikçe karıştırın ve filtreyle sterilize edin.
    3. TpCM-2 içeren şişenin kapağını gevşetin. Ortamı anaerobik (Brewer) bir kavanoza koyarak, üç kez% 95 N2,% 5 CO2 gaz karışımı ile boşaltıp yeniden doldurarak ve ardından% 1.5 O2,% 5 CO2 ile doldurarak önceden dengeleyin, son tahliyeden sonra N2 gaz karışımını dengeleyin. Bu gaz değişim işlemini gerçekleştirmek için bir sistem örneği Şekil 2'de gösterilmiştir.
    4. Ortamı, %1,5 O2,% 5 CO2 sağlamak veN2 atmosferini 34 ° C'de dengelemek için ayarlanmış bir tri gaz inkübatöre hızla aktarın. Alternatif olarak, besiyerini içeren anaerobik kavanoz, 3.3.3'te açıklanan gaz değişimini takiben kapatılabilir ve standart bir inkübatöre aktarılabilir.
  4. Deney sabahı, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak Sf1Ep kültürlerini kontrol edin. Hücrelerin bağlı olduğundan ve% 5 -% 10 birleşik olduğundan emin olun. Ortamı aseptik olarak çıkarın.
  5. Önceden dengelenmiş TpCM-2'nin küçük bir hacmini (damar boyutuna bağlı olarak 0.2 mL ila 2 mL) kullanarak kuyuları kısa bir süre durulayın, durulamayı çıkarın ve uygun miktarda TpCM-2 ekleyin (Tablo 1). Plakaları %1.5 O2,% 5 CO2 içinde dengeleyin ve daha önce tarif edildiği gibi 3-4 saat boyunca 34 ° C'deN2 atmosferini dengeleyin.
  6. Plakaları bir laminer akış başlığına aktarın ve donmuş stoklardan veya taze hasat edilmiş kültürlerden (aşağıda tarif edildiği gibi) tripsinli preparatlardan uygun sayıda (Tablo 1) T. pallidum ile aşılayın. Enfekte tavşanlardan(13) aseptik olarak toplanan taze hazırlanmış veya dondurulmuş stoklar da kullanılabilir. Plakaları 3.3.3'te tarif edildiği gibi yeniden dengeleyin ve kültürleri %1.5 O2,% 5 CO2 içinde inkübe edin veN2 atmosferini 34 ° C'de dengeleyin.

4. T. pallidum kültürlerinin hasat edilmesi ve geçirilmesi

NOT: Kültürdeki T. pallidum'un çoğunluğu Sf1Ep hücrelerinin yüzeyine bağlı olduğundan, onları almak ve organizmaların doğru bir sayımını elde etmek için treponemleri memeli hücrelerinden ayırmak gerekir. Bu tür 'hasat' ve taze kültürlere geçiş, tipik olarak kültürün 7. gününde yapılır. Burada açıklanan prosedür 6 oyuklu plakalar içindir; kullanılan tripsin-EDTA çözeltisinin miktarı, kültür formatının 17,19,27 boyutuna bağlı olarak yukarı veya aşağı ayarlanır.

  1. Hasat zamanında, kültürleri inkübatörden çıkarın. Ters faz kontrast mikroskobu kullanarak her bir oyuktaki Sf1Ep hücre katmanını inceleyin ve hücre yoğunluğunu (örneğin, %80 birleşik) ve görünümü kaydedin. Ayrıca, TpCM-2'nin rengine dikkat edin; resazurin göstergesi, düşük pH'ın bir sonucu olarak genellikle pembeden sarıya döner.
  2. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her kuyucuk için ayrı pipetler kullanarak ortamı her bir oyuktan steril 15 mL'lik bir konik tüpe pipetleyin. Her bir kuyuyu 0.35 mL önceden ısıtılmış Tripsin-EDTA çözeltisi ile durulayın ve durulamayı ortama ekleyin.
  3. Her oyuğa başka bir 0.35 mL Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve plakayı standart 37 ° C'lik bir inkübatörde 5 dakika inkübe edin; Bu kısa süre için düşük bir O2 atmosferi gerekli değildir.
  4. Sf1Ep hücrelerinin toplanmasını ve ayrılmasını kontrol edin, bu aynı zamanda T. pallidum'un memeli hücrelerinden ayrışması ile de ilişkilidir. Ters çevrilmiş mikroskobu kullanarak bu işlemi izleyin ve gerektiğinde ek süre veya Tripsin-EDTA çözeltisi sağlayın. Ayrışma işlemi, hareketsiz hale getirilmiş plakanın yan tarafına plastik bir test tüpü rafı veya benzeri bir nesne ile hafifçe vurularak kolaylaştırılır.
  5. Ayrılmış ortamı pipetleyin ve ayrışmış T. pallidum ve hücrelerini almak için kuyuya durulayın. Kültür başına verimin hesaplanması için alınan toplam hacmi kaydedin.
  6. Çoğu deneyde, hasat edilen T. pallidum'un belirli bir hacmini taze Sf1Ep hücreleri ve TpCM-2 içeren kültür plakalarına aktarın. Bu gibi durumlarda, kültür hacminin yaklaşık 1 /20'sini aktarın (4 mL, 6 oyuklu bir plaka kültürü için 200 μl gibi); T. pallidum suşunun hızlı veya yavaş büyümesine bağlı olarak bu sesi yukarı veya aşağı ayarlayın. Aşılamadaki Sf1Ep hücrelerini 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj ederek çıkarın, ancak bu adım rutin transferler için gerekli değildir.
  7. Bir deney için plakalar aşılandıktan hemen sonra, tahliye ve yeniden doldurma işlemini kullanarak plakalardaki atmosferi değiştirin (adım 3.3.3). Plakaları Brewer kavanozu içinde 34 °C'de inkübe edin veya bir tri-gaz inkübatöre aktarın.
  8. T. pallidum'u, üreticinin talimatlarını izleyerek bir Helber sayma odası veya benzeri bir cihaz kullanarak karanlık alan mikroskobu ile numaralandırın.
    NOT: Helber haznesi, bakteri sayımlarının doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde artıran kalibre edilmiş bir cam sürgü ve kapak kızağıdır; Hazne, %70 etanol ve kağıt mendil kullanılarak kolayca dezenfekte edilir, temizlenir ve kurutulur ve süresiz olarak yeniden kullanılabilir. İdeal olarak, karanlık alan mikroskobu 40x objektife ve 15x göz merceğine sahip olmalıdır. Her kültür için mükerrer sayımlar yapın ve hareketli ve hareketsiz T. pallidum sayısını kaydedin ve herhangi bir morfolojik değişiklik kaydedilmelidir. Kantitatif PCR (qPCR), kesin kantitasyon ve motilitenin belirlenmesinin gerekli olmadığı durumlarda da kullanılabilir17,24.
  9. Tripsin ile tedavinin istenmeyebileceği deneylerde (T. pallidum protein içeriğini inceleyenler gibi), T. pallidum ve hücre tek tabakasını ayırmak için bir EDTA Ayrışma Ortamı kullanın17,19.
    NOT: Ayrışma Ortamı, basitleştirilmiş bir T. pallidum yetiştirme ortamında iki değerlikli katyonları uzaklaştırmak için kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) veya Earle's Temel Tuz Çözeltisine (EBSS) karşı diyalize edilmiş FBS'den oluşur (Tablo 2). Bu prosedür daha uzun bir süre (30 dakikaya kadar) veya tam ayrışma için tekrarlanan tedavi alabilir.

5. T. pallidum kültürlerinin dondurulması ve saklanması

NOT: T. pallidum -70 ° C'de veya altında süresiz olarak saklanabilir, çözüldükten sonra canlılık tipik olarak% 50 -% 90'dır.

  1. T . pallidum kültürlerini hasatta %10 (h/h) gliserol ilavesiyle dondurun. Gliserolü, hafif pipetleme veya ters çevirme yoluyla hazırlık boyunca dağıtın. Daha sonra, hazırlığı 1-2 mL'lik alikotlar halinde vidalı kapaklı dondurucu şişelerine dağıtın ve şişeleri hemen -80 ° C'lik bir dondurucuya veya sıvı bir N2 dondurucuya yerleştirin.
  2. Donmuş stoktan bir T. pallidum kültürü başlatmak için, önce bölüm 3'te tarif edildiği gibi Sf1Ep hücreleri ve TpCM-2 içeren uygun kültür kaplarını hazırlayın. T. pallidum dondurulmuş stoğu içeren şişeyi hızlı bir şekilde çözün; 37 °C'lik bir su banyosunun veya ısıtma bloğunun dikkatli bir şekilde kullanılması bu konuda yardımcı olacaktır.
  3. Daha sonra, çözülmüş preparatı kültür kabına/kaplarına aktarın. T. pallidum'un hayatta kalmasını ve büyümesini desteklemek için gliserolün yeterli seyreltilmesini sağlamak için donmuş stok hacminin Tp-CM2 ortamına oranının 1: 5 veya daha yüksek olduğundan emin olun.
  4. Kültürü mikroaerobik koşullar altında 7 gün inkübe edin ve bölüm 4'te tarif edildiği gibi taze kültürlere aktarın.

6. T. pallidum'un izojenik klonlarının üretilmesi

NOT: Bu prosedür daha önceki bir çalışmada ayrıntılı olarak açıklanmıştır27.

  1. Tipik bir deneyde, bölüm 3'te açıklandığı gibi, oyuk başına 1000 Sf1Ep hücresi ve 200 μL TpCM-2 ile iki adet 96 oyuklu plaka hazırlayın ve önceden dengeleyin.
    NOT: Çok kanallı 200 μL'lik bir pipetleyici ve uyumlu steril tek kullanımlık reaktif rezervuarları, Sf1Ep hücre aşılaması, ortam değişimi ve aşılama adımlarını büyük ölçüde basitleştirir.
  2. Bir karanlık alan mikroskobu ve bir Helber odası kullanarak taze hasat edilmiş bir preparatta T. pallidum konsantrasyonunu ölçün (adım 4.8). 10 treponem/mL ve 40 treponem/mL konsantrasyonlarda iki preparat üretmek için T. pallidum süspansiyonunu TpCM-2 içinde seyreltin; Her preparatın 10 mL'si, her seyreltme ile 96 oyuklu bir plakayı aşılamak için fazlasıyla yeterlidir. Kontrol olarak, 2 x 103 T. pallidum / mL içeren 1 mL başka bir seyreltme hazırlayın.
  3. Standart bir tek kanallı pipet veya çok kanallı bir pipet kullanarak, 10 T. pallidum / mL preparatın oyuklu başına 50 μL'yi, iki kontrol kuyusunu atlayarak, hazırlanan 96 oyuklu plakadan birine aşılayın. Bu işlemi 40 T. pallidum/mL preparat ve diğer plaka ile tekrarlayın. Her plakadaki iki kontrol kuyusunda, 2 x 103 T. pallidum / mL seyreltmeyi aşılayın. Bu işlem, 100 T. pallidum içeren pozitif kontrol kuyuları ile birlikte kuyu başına (ortalama) 0.5 veya 2 T. pallidum içeren plakalar üretecektir.
    NOT: T. pallidum'un kaplama verimliliği bu koşullar altında düşüktür, bu nedenle ~ 2 organizma ile tohumlanan kuyuların bile klonal popülasyonlar vermesi muhtemeldir.
  4. Plakaları düşük O2 gaz karışımı (adım 3.3.3) ile dengeleyin ve 34 ° C'de bir Brewer kavanozunda veya tri gaz inkübatöründe inkübe edin.
  5. 7 günde, her kültür kuyucuğundan 100 μL ortamı çıkarın ve 100 μL taze, dengelenmiş TpCM-2 ile değiştirin. Kültür koşullarının T. pallidum çarpımını desteklediğinden emin olmak için karanlık alan mikroskobu ve sayım ile kontrol kuyucuklarında T. pallidum'un canlılığını ve büyümesini kontrol edin.
    NOT: Klonal kültürlerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için her kuyucuk için yeni bir pipet ucu kullandığınızdan emin olun.
  6. 14 günde, her bir oyuktan 50 μL kültür süpernatanı, adım 6.1'deki gibi hazırlanan taze plakalara aktarın.
  7. 21. ve 28. günlerde gerektiği gibi alternatif besleme ve geçişi tekrarlayın.
  8. Karanlık alan mikroskobu veya qPCR26 kullanarak her bir oyukta T. pallidum varlığını izleyin.
    NOT: T. pallidum'un yavaş büyüme hızı ve beslenme ve transfer sırasında gerekli organizma kaybı ile, 0.5 veya 2 T. pallidum ile ekilen kuyucuklar tipik olarak 28. güne veya daha sonrasına kadar her iki yöntemle de pozitif değildir.
  9. Pozitif kuyular tanımlandıktan sonra, daha fazla genişleme için bu kuyuları tripsinize edin ve 24 oyuklu plakalara aktarın. Tek bir tprK dizisinin baskınlığı ve ana suşta heterojen olan bölgelerde tek dizilerin varlığı ile klonaliteyi belirleyin27.

Sonuçlar

Açıklanan koşulları kullanarak, T. pallidum tipik olarak %>90 motiliteyi korur ve durağan faza girmeden önce yaklaşık 7 gün boyunca 33 saat ila 45 saatlik bir ikiye katlama süresi ile logaritmik olarak çoğalır (Şekil 3). 1 hafta boyunca, spiroketler yaklaşık 4-5 ikiye katlanırlar (Şekil 4). ). Ek olarak, farklı T. pallidum suşları farklı oranlarda büyüyebilir. SS14 grubu T. pallidum'un suşları, Nichols grubu 17'ninkinden daha yavaş ikiye katlanma sürelerine sahip olma eğilimindedir.

Kültürlerin beslenmesi kültür süresini birkaç gün uzatabilir, ancak Sf1Ep hücre tabakası genellikle bir haftalık kültürden sonra başarısız olur. Ayrıca, treponemler yaklaşık 5 x 107 / mL'lik bir organizma üst sınırına ulaşır. 7 günlük aralıklarla aktarılan kültürler tipik olarak çok az gecikme fazı ile veya hiç gecikme fazı olmadan logaritmik çarpmaya devam eder. Durağan fazdaki organizmaların geçmesi genellikle zorlaşır.

Çoğu T. pallidum , Sf1Ep hücrelerine bağlanır. Bununla birlikte, süpernatantta, canlılığı ve çoğalmayı kontrol etmek için orta numunelerin periyodik olarak çıkarılabileceği kadar T. pallidum kalır. Dikkatli bir miktar tayini gerekiyorsa, çıkarılan besiyerinin hacmi ölçülmeli, T. pallidum sayısı ölçülmeli ve çıkarılan toplam organizma sayısı hasattaki son sayımlara eklenmelidir.

Önceki çalışmalarda, klonlama etkinliği (aşılanan organizma başına pozitif kültür sayısı) oyuk başına aşılanan 2 T. pallidum için %12.5 ve oyuk başına aşılanan 0.5 T. pallidum için %6.7 idi27. Bu nedenle, herhangi bir pozitif kuyunun, bu aşılardan herhangi birinde tek bir organizmanın büyümesini temsil etmesi muhtemeldir. Bununla birlikte, ortaya çıkan popülasyonların klonalitesi, ana kültürde heterojen olan bölgelerde homojenlik için kültürün incelenmesiyle doğrulanmalıdır. Kültürün izojenik olduğunu göstermenin en kesin yolu, tüm genom dizilemesidir27.

figure-results-2285
Şekil 1: T. pallidumin vitro kültivasyon prosedürünün akış şeması. Bu rakam Edmondson ve Norris'in (2021)19 izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2829
Şekil 2: T. pallidum kültür reaktiflerini düşük oksijenli bir ortama dengelemek için sistemin şeması. Bir Brewer kavanoz havalandırması, bir T-eklemi aracılığıyla bir vakum kaynağına (ev vakumu gibi) ve özel gaz karışımları içeren gaz silindirlerine (%5 CO2, denge nitrojeni ve% 1,5 O2,% 5 CO2, denge azotu) bağlanır. Sıralı bir vakum ölçer, kavanozda çekilen vakumu ölçer. Vakum, kavanozda yaklaşık -58 kPa'ya kadar çekilir. Boşaltılan kavanoz daha sonra yavaşça gaz karışımları ile yeniden doldurulur. Brewer kavanozu üç kez %5 CO2 ile yeniden doldurulur, son tahliyeden önce nitrojen dengelenir ve %95N2, %5 CO2, %1.5 O2 ile yeniden doldurulur. Kültürler veya besiyerleri daha sonra kavanozdan çıkarılır ve hızlı bir şekilde düşük oksijenli inkübatöre aktarılır. Alternatif olarak, Brewer kavanozu ile ilk T-eklemi arasındaki boru sıkıca kenetlenebilir, boru T-bağlantısından ayrılabilir ve tüm Brewer kavanozu 34 °C'lik bir inkübatöre aktarılabilir. Bu rakam Edmondson ve Norris'in (2021)19 izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4337
Şekil 3: TpCM-2 ortamı ile Sf1Ep hücreleri ile kültürlenmiş T. pallidum'un büyüme eğrileri. Paralel üçlü kültürler T. pallidum ile tohumlandı. Kopyalar her zaman noktasında hasat edildi; Sonuçlar, bu kültürler için ortalama + SEM'i temsil eder. (A) Kültür başına T. pallidum'daki değişiklikler ve (B) yüzde motilite gösterilmiştir. Bu rakam Edmondson ve ark.18'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5183
Şekil 4: T. pallidum, Nichols suşunun in vitro kültürünün geçiş örneği. Paralel üçlü kültürler T. pallidum ile tohumlandı ve 1:20 seyreltme kullanılarak haftalık olarak geçirildi. Testere dişi grafiği, kültür başına T. pallidum sayılarını ve her zaman noktasında yeni kültürlere aktarılan sayıyı gösterir. Sonuçlar, üç biyolojik kopya için ortalama ± SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kültür kapları için orta hacim ve tohumlama oranları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: T. pallidum yetiştiriciliği için ortam. Tüm ortamlar hazırlandıktan sonra filtre ile sterilize edilmelidir. Sf1Ep ortamı 4 °C'de iki aya kadar saklanabilir. TpCM-2 tipik olarak kullanımdan bir gün önce yapılır. Ayrışma ortamı alıntılanmalı ve dondurulmalıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Sf1Ep-TpCM-2 sistemi, T. pallidum'un sürekli in vitro kültürünü destekleyen ilk mevcut prosedürdür. Sistem, bu organizmanın aşırı büyüme gereksinimleri nedeniyle karmaşıktır: 1) sınırlı biyosentetik yetenekler nedeniyle karmaşık beslenme ihtiyaçları; 2) reaktif oksijen türlerinekarşı yüksek hassasiyete rağmen, küçük miktarlarda oksijen için yeterince anlaşılmamış bir gereklilik 9,10,16,36; ve 3) Sf1Ep hücrelerinin varlığı için mevcut ihtiyaç. Prosedürde 'köşeleri kesmek' cazip gelse de, modifikasyonları denemeden önce başarılı bir uzun vadeli kültür elde edilene kadar adımların dikkatli bir şekilde takip edilmesi önerilir. T. pallidum'un metabolik gereksinimleri hakkında ek bilgi biriktikçe, Sf1Ep hücrelerinin varlığını gerektirmeyen aksenik durumlar geliştirmek mümkün olabilir. Bununla birlikte, in vitro büyüme hızı muhtemelen yavaş kalacaktır (suşa bağlı olarak minimum iki katına çıkma süresi 33 saat ila 46 saat arasında)17,18, T. pallidum'un memeli enfeksiyonu sırasında bile tahmini iki katına çıkma süresinde 30 saat ila 33 saat arasında çoğaldığı göz önüne alındığında37,38. Herhangi bir bakteri kültüründe olduğu gibi, düşük pasajlı stokların korunması ve mutasyonlara bağlı 'genetik sürüklenme' ve ilişkili fenotipik değişikliklerden kaçınmak için bu stoklardan 10 geçişten daha az olan T. pallidum kültürleri ile deneyler yapılması önerilir.

Sf1Ep hücreleri, görünüşe göre treponemlere temel besinleri veya enzimatik aktiviteleri sağlar. Bununla birlikte, besinleri de (glikoz ve oksijen gibi) tüketirler ve düşük pH 9,16,39 gibi toksik durumlar üretebilirler. Bu nedenle, T. pallidum çoğalmasını desteklemek için yeterli Sf1Ep hücresine sahip olmak ile memeli hücrelerinin aşırı büyümesini ve toksisitesini önlemek arasında bir dengeleme eylemi vardır. Sf1Ep hücrelerinin yüksek geçiş sayıları daha hızlı büyüme eğilimindedir ve zaman zaman T. pallidum çoğalmasını destekleme yeteneğini kaybeder. Bu nedenle, Sf1Ep geçiş sayısı izlenmeli ve hücre stokları periyodik olarak düşük geçişli donmuş preparatlarla değiştirilmelidir. Sf1Ep hücrelerinin varlığı, DNA, RNA ve protein içeriği gibi T. pallidum özelliklerinin ve enzim aktivitelerinin incelenmesini de zorlaştırır. Tavşan hücrelerinin uzaklaştırılması, tekrarlanan düşük hızlı santrifüjleme (100 dakika boyunca 5 x g) veya daha etkili bir şekilde Percoll veya Hipak gradyanları40,41 kullanılarak bir dereceye kadar mümkündür. Bununla birlikte, gradyan santrifüjleme yöntemleri genellikle sadece yüksek sayıda T. pallidum ile etkilidir. T. pallidum'un çoğaltılması için alternatif yöntemler, tavşan gibi laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu ile sınırlıdır13,14. Bu yaklaşımın etik düşünceleri vardır ve giderek daha pahalı hale gelmiştir; bununla birlikte, tavşan modeli, T. pallidum patogenezini ve konakçı immün yanıtlarını incelemek için çok yararlıdır. Ek olarak, in vitro kültür ve tavşan enfeksiyonu sırasında T. pallidum'un gen ekspresyonu, büyümesi veya davranışında bazı farklılıklar olması muhtemeldir27.

Bu raporun yazıldığı tarihte, Sf1Ep-TpCM-2 sistemi Amerika Birleşik Devletleri ve Avrupa'da en az 6 araştırma grubunda kurulmuştur ve T. pallidum temel biyolojisi ve genetiğinden antimikrobiyal duyarlılığa kadar çeşitli konularda 16 yayınla sonuçlanmıştır. Bu esrarengiz patojenin incelenmesinde in vitro kültürün değeri, genişletilmiş kullanım ve gelecekteki iyileştirmelerle muhtemelen artacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri / NIAID'den R01 AI141958 hibe ile desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Sigma E8008
10x Earle’s Balanced Salts, w/o Mg2+, Ca2+Gibco14155063
15 and 50 mL conical sterile disposable centrifuge tubes N/AN/A
2 mL cryogenic vials Corning430659
6-well cell culture plates for T. pallidum cultivation Falcon353046The plates must have low evaporation lids.
70% ethanolN/AN/A
75 cm2 tissue culture flasks with vented capsCorning43061U
93.5% nitrogen, 5% CO2, and 1.5% oxygen for pre-equilibrating medium and culturesN/AN/A
95% nitrogen and 5% CO2 for pre-equilibrating medium and culturesN/AN/A
96-well low evaporation clear, flat-bottom tissue culture-treated microplatesCorning Falcon353072
Adjustable multi-channel pipette with 200 ul capacity N/AN/AOptional, but very helpful for cloning
Cell culture grade waterSigmaW3500
CMRL 1066 without L-Glutamine or Phenol RedUS BiologicalC5900-03A
CO2 for tri-gas and tissue culture incubators N/AN/A
Cryogenic liquid nitrogen cell culture storage tankN/AN/A
D-glucoseSigma-AldrichG6152
Disposable filter units, 0.2 µm , > 100 mL capacityN/AN/A
Disposable pipets: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspiratingN/AN/A
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD9779
D-Mannitol Sigma-AldrichM1902
DMSO (sterile cell culture grade )Sigma-AldrichD2650
Eagle’s MEMSigma-AldrichM4655
Fetal bovine serum, heat inactivated Sigma-AldrichF4135We highly recommend this product. Must pre-screen for T. pallidum culture compatibility if using a different brand or catalog number.
Freezer with capability of maintaining -70 °C or -80 °CN/AN/AFor storage of T. pallidum; liquid nitrogen storage may be used instead
Freezing medium (Sf1Ep medium + 10% [v/v] DMSO)N/AN/A
Gas cylinders with appropriate fittingsN/AN/A
GasPak 150 vented anaerobic jar (Brewer Jar)Fisher Scientific11-816
GlycerolN/AN/A
Helber counting chambers with Thoma rulingsHawksley Medical and Laboratory EquipmentFor quantitating T. pallidum
HemocytometerN/AN/A For Sf1Ep cell quantitation
Incubator tank switchNuAire NU-1550 TankGuard Automatic CO2 Incubator Tank SwitchOptional, but very helpful in maintaining appropriate O2 conditions.
Inverted microscope with phase contrast opticsN/AN/AFor viewing Sf1Ep cell cultures
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
L-Histidine Sigma-AldrichH6034
MEM Non-Essential Amino AcidsGibco11140-050
Microscope with darkfield condensorN/AN/AThe microscope should have a 40x objective and 15x eyepieces.
MOPSSigma-AldrichM3183
Multi-channel adapter for aspirator Integra155520Optional, but useful for cloning
NaHCO3 (7.5%)Sigma-AldrichS8761
Nitrogen for tri-gas incubatorN/AN/A
ResazurinSigma-AldrichR7017
Sf1Ep (NBL-11) cellsAmerican Type Culture CollectionCCL-68
Sodium pyruvateSigma-AldrichS8636
Sterile PBS (without calcium chloride and magnesium chloride) Sigma-AldrichD8537
Sterile reagent reservoirs, 50 or 100 mL sizeN/AN/A
T. pallidum sample, frozen or fresh from a rabbit infection or in vitro culture
Tissue culture incubator maintained at 37 °C, 5% CO2N/AN/A
Tri-gas tissue culture incubator maintained at 34 °C, 5% CO2, 1.5% O2ThermofisherHeracell™ VIOS 160i Tri-Gas CO2 IncubatorOptional; anaerobic jars may be used instead (see Ref. 17)
Trypsin-EDTA solution Sigma-AldrichT4049
Vacuum source (e.g. house vacuum), vacuum tubing, vacuum gauge, and connectorsN/AN/A
Water, suitable for cell culture, filter-sterilized, purifiedSigma-AldrichW3500Recommended for medium preparation; decreases culture variability

Referanslar

  1. Implementing the global health sector strategies on HIV, viral hepatitis and sexually transmitted infections, 2022-2030: Report on progress and gaps. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240094925 (2024)
  2. Antal, G. M., Lukehart, S. A., Meheus, A. Z. The endemic treponematoses. Microbes Infect. 4 (1), 83-94 (2002).
  3. Norris, S. J., Paster, B. J., Smibert, R. M. . Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 4, (2010).
  4. Lumeij, J. T., Mikalová, L., Šmajs, D. Is there a difference between hare syphilis and rabbit syphilis? Cross infection experiments between rabbits and hares. Vet Microbiol. 164 (1-2), 190-194 (2013).
  5. Knauf, S., et al. High prevalence and genetic diversity of Treponema paraluisleporidarum isolates in European lagomorphs. Microbiol Spectr. 12 (1), e0177423 (2024).
  6. Šmajs, D., et al. Complete genome sequence of Treponema paraluiscuniculi, strain Cuniculi A: the loss of infectivity to humans is associated with genome decay. PLoS One. 6 (5), e20415 (2011).
  7. Šmajs, D., Norris, S. J., Weinstock, G. M. Genetic diversity in Treponema pallidum: implications for pathogenesis, evolution and molecular diagnostics of syphilis and yaws. Infect Genet Evol. 12 (2), 191-202 (2012).
  8. Šmajs, D., Strouhal, M., Knauf, S. Genetics of human and animal uncultivable treponemal pathogens. Infect Genet Evol. 61, 92-107 (2018).
  9. Norris, S. J., Cox, D. L., Weinstock, G. M. Biology of Treponema pallidum: correlation of functional activities with genome sequence data. J Mol Microbiol Biotechnol. 3 (1), 37-62 (2001).
  10. Radolf, J. D., et al. Treponema pallidum, the syphilis spirochete: making a living as a stealth pathogen. Nat Rev Microbiol. 14 (12), 744-759 (2016).
  11. Schaudinn, F. R., Hoffman, E. Vorläufiger bericht über das Vorkommen für Spirochaeten in syphilitischen Krankheitsprodukten und bei Papillomen. Arb Gesundh Amt Berlin. 22, 528-534 (1905).
  12. Schaudinn, F., Hoffmann, E. Über Spirochaetenbefunde im Lymphdrüsensaft Syphilitischer. Deut Med Wochenschr. 31 (18), 711-714 (1905).
  13. Turner, T. B., Hollander, D. H. Biology of the treponematoses. World Health Organization. , (1957).
  14. Lukehart, S. A., Marra, C. M. Isolation and laboratory maintenance of Treponema pallidum. Curr Protoc Microbiol. , (2007).
  15. Fieldsteel, A. H., Cox, D. L., Moeckli, R. A. Cultivation of virulent Treponema pallidum in tissue culture. Infect Immun. 32, 908-915 (1981).
  16. Cox, D. L. Culture of Treponema pallidum. Meth Enzymol. 236, 390-405 (1994).
  17. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete Treponema pallidum subsp. pallidum. mBio. 9 (3), e01153-e01218 (2018).
  18. Edmondson, D. G., DeLay, B. D., Kowis, L. E., Norris, S. J. Parameters affecting continuous in vitro culture of Treponema pallidum strains. mBio. 12 (1), e03536-e03620 (2021).
  19. Edmondson, D. G., Norris, S. J. In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum. Curr Protoc. 1 (2), e44 (2021).
  20. Edmondson, D. G., Wormser, G. P., Norris, S. J. In vitro susceptibility of Treponema pallidum subsp. pallidum to doxycycline. Antimicrob Agents Chemother. 64 (10), e00979-e01020 (2020).
  21. Leimer, N., et al. A selective antibiotic for Lyme disease. Cell. 184 (21), 5405-5418 (2021).
  22. Haynes, A. M., et al. Efficacy of linezolid on Treponema pallidum, the syphilis agent: A preclinical study. EBioMedicine. 65, 103281 (2021).
  23. Houston, S., et al. Identification and functional characterization of peptides with antimicrobial activity From the syphilis spirochete, Treponema pallidum. Front Microbiol. 13, 888525 (2022).
  24. Tantalo, L. C., et al. Antimicrobial susceptibility of Treponema pallidum subspecies pallidum: an in-vitro study. Lancet Microbe. 4 (12), e994-e1004 (2023).
  25. Hayes, K. A., Dressler, J. M., Norris, S. J., Edmondson, D. G., Jutras, B. L. A large screen identifies beta-lactam antibiotics which can be repurposed to target the syphilis agent. NPJ Antimicrob Resist. 1 (1), 4 (2023).
  26. Tantalo, L. C., Molini, B. J., Bose, M., Klausner, J. D., Giacani, L. In vitro isolation of Treponema pallidum subsp. pallidum from fresh and frozen needle aspirates of primary experimental syphilis lesions. Sex Transm Dis. 50 (3), 180-183 (2023).
  27. Edmondson, D. G., De Lay, B. D., Hanson, B. M., Kowis, L. E., Norris, S. J. Clonal isolates of Treponema pallidum subsp. pallidum Nichols provide evidence for the occurrence of microevolution during experimental rabbit infection and in vitro culture. PLoS One. 18 (3), e0281187 (2023).
  28. Lin, M. J., et al. Longitudinal TprK profiling of in vivo and in vitro-propagated Treponema pallidum subsp. pallidum reveals accumulation of antigenic variants in absence of immune pressure. PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009753 (2021).
  29. De Lay, B. D., Cameron, T. A., De Lay, N. R., Norris, S. J., Edmondson, D. G. Comparison of transcriptional profiles of Treponema pallidum during experimental infection of rabbits and in vitro culture: Highly similar, yet different. PLoS Pathog. 17 (9), e1009949 (2021).
  30. Romeis, E., et al. Genetic engineering of Treponema pallidum subsp. pallidum, the syphilis spirochete. PLoS Pathog. 17 (7), e1009612 (2021).
  31. Phan, A., Romeis, E., Tantalo, L., Giacani, L. In vitro transformation and selection of Treponema pallidum subsp. pallidum. Curr Protoc. 2 (8), e507 (2022).
  32. Romeis, E., et al. Treponema pallidum subsp. pallidum with an artificially impaired TprK antigenic variation system is attenuated in the rabbit model of syphilis. bioRxiv. , 524629 (2023).
  33. Fieldsteel, A. H., Becker, F. A., Stout, J. G. Prolonged survival of virulent Treponema pallidum (Nichols strain) in cell-free and tissue culture systems. Infect Immun. 18, 173-182 (1977).
  34. U.S. Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 6th Edition. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. , (2020).
  35. Norris, S. J., Miller, J. N., Sykes, J. A., Fitzgerald, T. J. Influence of oxygen tension, sulfhydryl compounds, and serum on the motility and virulence of Treponema pallidum (Nichols strain) in a cell- free system. Infect Immun. 22 (3), 689-697 (1978).
  36. Cox, C. D., Barber, M. K. Oxygen uptake by Treponema pallidum. Infect Immun. 10 (1), 123-127 (1974).
  37. Magnuson, H. J., Eagle, H. The minimal infectious inoculum of Spirochaeta pallida (Nichols strain), and a consideration of its rate of multiplication in vivo. Am J Syph. 32, 1-18 (1948).
  38. Cumberland, M. C., Turner, T. B. The rate of multiplication of Treponema pallidum in normal and immune rabbits. Am J Syph. 33, 201-211 (1949).
  39. Norris, S. J., Edmondson, D. G. Factors affecting the multiplication and subculture of Treponema pallidum subsp. pallidum in a tissue culture system. Infect Immun. 53, 534-539 (1987).
  40. Baseman, J. B., Nichols, J. C., Rumpp, O., Hayes, N. S. Purification of Treponema pallidum from infected rabbit tissue: resolution into two treponemal populations. Infect Immun. 10, 1062-1067 (1974).
  41. Hanff, P. A., Norris, S. J., Lovett, M. A., Miller, J. N. Purification of Treponema pallidum, Nichols strain, by Percoll density gradient centrifugation. Sex Transm Dis. 11, 275-286 (1984).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır