Method Article
Bu protokol, sifiliz patojeni Treponema pallidum subsp. pallidum'un memeli hücreleri ile ko-kültürde in vitro kültivasyonunu tanımlar. Yöntem ölçeklenebilir; büyük miktarlarda T. pallidum üretmek ve klonal kültürler oluşturmak için kullanılabilir.
Bir asırdan fazla bir süredir, Frengiye neden olan spiral şekilli bakteri olan Treponema pallidum subsp. pallidum, yalnızca organizmaların tavşan testislerinden aşılanması ve toplanmasıyla çoğaltılabilirdi. 2018 yılında, T. pallidumin vitro'yu sürekli olarak yetiştirmek için bir yöntem tanımladık. Bu sistem, TpCM-2 adı verilen serum içeren bir doku kültürü ortamında tavşan epitel hücreleri (Sf1Ep hücreleri) ile ko-kültür kullanır. Kültürdeki T. pallidum iki katına çıkma süresi, doğal enfeksiyon sırasında (yaklaşık 33-45 saat) meydana geldiği tahmin edilene benzer. Organizma, 34 ° C'de düşük oksijenli (% 1.5) bir ortamda 1 haftalık standart bir geçiş süresi ile sürekli olarak kültürlenebilir. Bu makale, T. pallidum'un kültürlenmesi için protokolleri, gerekli doku kültürü hücrelerini büyütme ve sürdürme yöntemlerini ve seyreltmeyi sınırlayarak izojenik suşlar oluşturma tekniğini içerir. T. pallidum'u in vitro olarak büyütme yeteneği, bu esrarengiz organizmayı incelemek ve anlamak için yeni deneysel yollar sağlar.
Treponema pallidum, insanlarda ve diğer primatlarda sifiliz ve buna bağlı enfeksiyonlara neden olan spiral şekilli bir bakteri türüdür (spiroket olarak adlandırılır). Frengi, enfekte bireyler üzerinde uzun vadeli etkileri olan ciddi bir hastalıktır ve her yıl dünya çapında 8 milyondan fazla yeni sifiliz vakasının ortaya çıktığı tahmin edilmektedir1. T. pallidum, insanlarda neden oldukları hastalıklara ve küçük genetik farklılıklara bağlı olarak üç alt türe ayrılmıştır: alt tür pallidum (cinsel yolla bulaşan frengi hastalığına neden olur), alt tür pertenue (yaws) ve alt tür endemicum (bejel veya endemik sifilize neden olur)2,3. T. pallidum subsp. pertenue ayrıca babunlarda, şempanzelerde ve diğer primatlarda enfeksiyonlara neden olur. Treponema paraluiscuniculi (Treponema paraluisleporidarum olarak da bilinir) adı verilen yakından ilişkili bir organizma, tavşanlarda ve tavşanlardaenfeksiyona neden olur 4,5. Bu bakterilerin tümü çok yakından ilişkilidir ve genom düzeyinde 6,7,8% 98'den fazla DNA dizisi kimliği vardır. Her birinin yaklaşık 1.14 milyon baz çifti (Mb) boyutunda tek, küçük dairesel bir kromozomu vardır. Bu T. pallidum grubunun üyeleri, yalnızca memeli konakçılarıyla ilişkili olarak bulunur; Bu nedenle, hayatta kalmak ve büyümek için konakçı türlerine bağımlı olan zorunlu patojenlerdir 9,10.
T. pallidum'u in vitro kültürleme girişimleri, 1905'te Schaudinn ve Hoffman tarafından tanımlanmasından kısa bir süre sonra başladı11,12. Bununla birlikte, bu çabalar organizmanın tutarlı, tekrarlanabilir büyümesine yol açamadı. Sonuç olarak, T. pallidum araştırma çalışmaları, laboratuvar hayvanlarının, en yaygın olarak tavşanın deneysel enfeksiyonu yoluyla organizmanın yayılmasını gerektirmiştir13,14. 1981 yılında, Fieldsteel ve ark.15, T. pallidum suşlarının 2 haftaya kadar bir süre boyunca çoğalmasını teşvik eden bir doku kültürü sistemi tanıttı. Bu sistem, T. pallidum'un Eagle's Minimum Esansiyel Ortamı (MEM) ve% 20 fetal sığır serumu (FBS) bazlı modifiye edilmiş bir doku kültürü ortamında (T. pallidum Kültür Ortamı 1, TpCM-1) Sf1Ep pamuk kuyruklu tavşan epitel hücreleri ile ko-kültürünü içeriyordu. Gerekli diğer kültür koşulları,% 1.5 O2 ve% 5 CO2 9,16 içeren bir atmosferde 34 ° C'de inkübasyondu. Bu sistemde, T. pallidum Sf1Ep hücrelerine bağlanır ve memeli hücre yüzeyi ile yakın ilişki içinde olduğunda çoğalır. Birçok alt kültür girişimine ve diğer modifikasyonlara rağmen, Fieldsteel ve ark. sistem sürekli in vitro büyümeyi teşvik edemedi.
2018'de laboratuvarımız, TpCM-2 (Eagle'ın MEM'inin daha karmaşık bir doku kültürü ortamı olan CMRL 1066 ile değiştirildiği) adı verilen modifiye edilmiş bir ortamın kullanılmasının, T. pallidum'a tutarlı uzun vadeli kültüre izin vermek için gerekli besinleri sağladığını bildirdi17. Bugüne kadar, bu modifikasyon en az 5 T. pallidum subsp. pallidum suşu (Nichols, SS14, Meksika A, UW231B ve UW249B) ve bir T. pallidum subsp. endemicum (Bosna A)18,19. Örnek olarak, Nichols suşu 6 yılı aşkın bir süredir sürekli olarak in vitro olarak kültürlenmektedir. Şimdiye kadar, yaws izolatları (T. pallidum subsp. pertenue) veya T. paraluiscuniculiin vitro kültür girişimleri başarısız olmuştur18. TpCM-2 sistemi hala Sf1Ep hücrelerinin varlığını, düşük oksijen konsantrasyonlarını ve 34 ° C'de inkübasyonu gerektirir ve bu da sistemi çoğu bakteri kültürü tekniğinden daha karmaşık hale getirir. Bununla birlikte, bu modifiye edilmiş T. pallidum kültür sistemi, bakterinin büyüme gereksinimlerini18 daha fazla tanımlamak, antimikrobiyal bileşiklerin ve peptitlerin 20,21,22,23,24,25 minimal inhibitör konsantrasyonlarını (MIC'ler) belirlemek, hasta dokusu aspiratlarından yeni suşları yaymakiçin yararlı olmuştur 26, bakterinin klonal popülasyonlarını izole etmek organizma27, tprK antijenik varyasyon sisteminikarakterize eder 27,28, gen ekspresyonunuinceler 29 ve mutasyon analizi yapar30,31,32.
Burada, T. pallidum'un in vitro olarak yetiştirilmesi için mevcut yöntemleri açıklıyoruz. Bu bilgilerin, sifiliz ve ilgili treponemal enfeksiyonların daha iyi teşhisi, tedavisi ve önlenmesi için bu in vitro kültür tekniğinin daha yaygın bir şekilde uygulanmasını kolaylaştırmaya yardımcı olacağını umuyoruz.
NOT: Tüm adımlar, aseptik bir tekniğin ve steril malzemelerin ve reaktiflerin kullanılmasını gerektirir. Hem a) personelin bulaşıcı materyale maruz kalmasını hem de b) kültürlerin mikrobiyal kontaminasyon olasılığını azaltmak için bir doku kültürü laminer akış başlığının kullanılması önerilir.
1. Sf1Ep hücre stoklarının oluşturulması
NOT: Sf1Ep pamuk kuyruklu tavşan epitel hücreleri, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan donmuş stoklar olarak satın alınabilir (bkz. Malzeme Tablosu). Sf1Ep hücrelerinin yavaş büyüyen doğası ve düşük metabolik hızı, T. pallidum33'ün uzun süreli sağkalımını ve büyümesini destekleme yeteneklerinin anahtarı gibi görünmektedir; bu nedenle, diğer memeli hücre kültürleri ile ikame edilmesi önerilmez. Sf1Ep hücreleri ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı değildir ve kültürde sadece 25-30 geçiş için korunabilir. Bu nedenle, ileride kullanılmak üzere donmuş bir düşük geçişli Sf1Ep hücre stoğunun muhafaza edilmesi önemlidir. Ölümsüzleştirilmiş Sf1Ep çizgileri bazen Sf1Ep hücrelerinin uzun süreli kültürü sırasında ortaya çıkar. (yayınlanmamış gözlemler). Bu çizgiler genellikle daha hızlı büyür ve kullanımı daha kolaydır; bununla birlikte, bazen, T. pallidum büyümesini destekleme yeteneğini kaybederler. Ölümsüzleştirilmiş Sf1Ep çizgileri kullanılabilir ve daha sonra spiroketler yavaş yavaş büyümeye başladığında değiştirilebilir.
2. Sf1Ep hücrelerinin geçirilmesi
NOT: Sf1Ep hücre kültürü büyümesi, faz kontrast optikleri kullanılarak ters çevrilmiş bir mikroskopla izlenir. Tipik olarak, hücrelerin birleşmeye yakın bir yere ulaşması yaklaşık bir hafta sürer. Hücreler ~% 90 birleşmeye ulaştığında, geçirilebilir, T. pallidum yetiştiriciliği veya donmuş stokların hazırlanması için kullanılabilir. Kültür ömrü, bir haftalık kültürden sonra kültür ortamının yarısının değiştirilmesiyle iki haftaya kadar uzatılabilir.
3. T. pallidum'un yetiştirilmesi
DİKKAT: Tüm T. pallidum alt türleri ve suşları insanlar için patojeniktir ve Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) Patojenleri34 olarak sınıflandırılır. Personeli korumak için uygun önlemler gereklidir; bunlar arasında eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipmanların (KKD) kullanımının yanı sıra potansiyel olarak T. pallidum'a maruz kalan yüzeylerin, malzemelerin ve sıvıların dezenfeksiyonu yer alır. T. pallidum ,% 70 etanol veya ticari olarak temin edilebilen dezenfektanlara maruz bırakılarak kolayca inaktive edilir. T. pallidum içeren numunelerin taşınması için laminer akış başlıklarının tutarlı bir şekilde kullanılması önerilir.
NOT: T. pallidum, atmosferik oksijen 9,16,35 seviyelerine birkaç saat maruz kaldığında öldürülebilen mikroaerofilik bir organizmadır. Bu nedenle, T. pallidum'un havada işlenmesinin mümkünse bir saatten daha az bir süre ile sınırlandırılması önerilir. Ayrıca, TpCM-2 ortamı% 1.5 O2,% 5 CO2, denge N2 içinde önceden dengelenmeli ve kuvvetli karıştırma (örneğin, bir girdap kullanımı) sınırlandırılmalıdır. T. pallidum kültürü tipik olarak antibiyotik yokluğunda gerçekleştirildiğinden, bakteri veya mantarlarla kontaminasyonu önlemek için ekstra özen gösterilmesi gerekir. T. pallidum'un kültürlenmesi için Sf1Ep-TpCM-2 prosedürü Şekil 1'de özetlenmiştir ve kültür kaplarının Sf1Ep hücreleri ile tohumlanması, TpCM-2 ortamının hazırlanması ve kültürlerin T. pallidum ile aşılanması dahil olmak üzere çok sayıda adımı içerir. Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) kritik bir orta bileşendir ve etkinliği farklı tedarikçiler ve lotlararasında değişir 19. FBS lotlarının etkinlik açısından ön taraması gereklidir.
4. T. pallidum kültürlerinin hasat edilmesi ve geçirilmesi
NOT: Kültürdeki T. pallidum'un çoğunluğu Sf1Ep hücrelerinin yüzeyine bağlı olduğundan, onları almak ve organizmaların doğru bir sayımını elde etmek için treponemleri memeli hücrelerinden ayırmak gerekir. Bu tür 'hasat' ve taze kültürlere geçiş, tipik olarak kültürün 7. gününde yapılır. Burada açıklanan prosedür 6 oyuklu plakalar içindir; kullanılan tripsin-EDTA çözeltisinin miktarı, kültür formatının 17,19,27 boyutuna bağlı olarak yukarı veya aşağı ayarlanır.
5. T. pallidum kültürlerinin dondurulması ve saklanması
NOT: T. pallidum -70 ° C'de veya altında süresiz olarak saklanabilir, çözüldükten sonra canlılık tipik olarak% 50 -% 90'dır.
6. T. pallidum'un izojenik klonlarının üretilmesi
NOT: Bu prosedür daha önceki bir çalışmada ayrıntılı olarak açıklanmıştır27.
Açıklanan koşulları kullanarak, T. pallidum tipik olarak %>90 motiliteyi korur ve durağan faza girmeden önce yaklaşık 7 gün boyunca 33 saat ila 45 saatlik bir ikiye katlama süresi ile logaritmik olarak çoğalır (Şekil 3). 1 hafta boyunca, spiroketler yaklaşık 4-5 ikiye katlanırlar (Şekil 4). ). Ek olarak, farklı T. pallidum suşları farklı oranlarda büyüyebilir. SS14 grubu T. pallidum'un suşları, Nichols grubu 17'ninkinden daha yavaş ikiye katlanma sürelerine sahip olma eğilimindedir.
Kültürlerin beslenmesi kültür süresini birkaç gün uzatabilir, ancak Sf1Ep hücre tabakası genellikle bir haftalık kültürden sonra başarısız olur. Ayrıca, treponemler yaklaşık 5 x 107 / mL'lik bir organizma üst sınırına ulaşır. 7 günlük aralıklarla aktarılan kültürler tipik olarak çok az gecikme fazı ile veya hiç gecikme fazı olmadan logaritmik çarpmaya devam eder. Durağan fazdaki organizmaların geçmesi genellikle zorlaşır.
Çoğu T. pallidum , Sf1Ep hücrelerine bağlanır. Bununla birlikte, süpernatantta, canlılığı ve çoğalmayı kontrol etmek için orta numunelerin periyodik olarak çıkarılabileceği kadar T. pallidum kalır. Dikkatli bir miktar tayini gerekiyorsa, çıkarılan besiyerinin hacmi ölçülmeli, T. pallidum sayısı ölçülmeli ve çıkarılan toplam organizma sayısı hasattaki son sayımlara eklenmelidir.
Önceki çalışmalarda, klonlama etkinliği (aşılanan organizma başına pozitif kültür sayısı) oyuk başına aşılanan 2 T. pallidum için %12.5 ve oyuk başına aşılanan 0.5 T. pallidum için %6.7 idi27. Bu nedenle, herhangi bir pozitif kuyunun, bu aşılardan herhangi birinde tek bir organizmanın büyümesini temsil etmesi muhtemeldir. Bununla birlikte, ortaya çıkan popülasyonların klonalitesi, ana kültürde heterojen olan bölgelerde homojenlik için kültürün incelenmesiyle doğrulanmalıdır. Kültürün izojenik olduğunu göstermenin en kesin yolu, tüm genom dizilemesidir27.
Şekil 1: T. pallidumin vitro kültivasyon prosedürünün akış şeması. Bu rakam Edmondson ve Norris'in (2021)19 izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: T. pallidum kültür reaktiflerini düşük oksijenli bir ortama dengelemek için sistemin şeması. Bir Brewer kavanoz havalandırması, bir T-eklemi aracılığıyla bir vakum kaynağına (ev vakumu gibi) ve özel gaz karışımları içeren gaz silindirlerine (%5 CO2, denge nitrojeni ve% 1,5 O2,% 5 CO2, denge azotu) bağlanır. Sıralı bir vakum ölçer, kavanozda çekilen vakumu ölçer. Vakum, kavanozda yaklaşık -58 kPa'ya kadar çekilir. Boşaltılan kavanoz daha sonra yavaşça gaz karışımları ile yeniden doldurulur. Brewer kavanozu üç kez %5 CO2 ile yeniden doldurulur, son tahliyeden önce nitrojen dengelenir ve %95N2, %5 CO2, %1.5 O2 ile yeniden doldurulur. Kültürler veya besiyerleri daha sonra kavanozdan çıkarılır ve hızlı bir şekilde düşük oksijenli inkübatöre aktarılır. Alternatif olarak, Brewer kavanozu ile ilk T-eklemi arasındaki boru sıkıca kenetlenebilir, boru T-bağlantısından ayrılabilir ve tüm Brewer kavanozu 34 °C'lik bir inkübatöre aktarılabilir. Bu rakam Edmondson ve Norris'in (2021)19 izniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TpCM-2 ortamı ile Sf1Ep hücreleri ile kültürlenmiş T. pallidum'un büyüme eğrileri. Paralel üçlü kültürler T. pallidum ile tohumlandı. Kopyalar her zaman noktasında hasat edildi; Sonuçlar, bu kültürler için ortalama + SEM'i temsil eder. (A) Kültür başına T. pallidum'daki değişiklikler ve (B) yüzde motilite gösterilmiştir. Bu rakam Edmondson ve ark.18'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: T. pallidum, Nichols suşunun in vitro kültürünün geçiş örneği. Paralel üçlü kültürler T. pallidum ile tohumlandı ve 1:20 seyreltme kullanılarak haftalık olarak geçirildi. Testere dişi grafiği, kültür başına T. pallidum sayılarını ve her zaman noktasında yeni kültürlere aktarılan sayıyı gösterir. Sonuçlar, üç biyolojik kopya için ortalama ± SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Kültür kapları için orta hacim ve tohumlama oranları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: T. pallidum yetiştiriciliği için ortam. Tüm ortamlar hazırlandıktan sonra filtre ile sterilize edilmelidir. Sf1Ep ortamı 4 °C'de iki aya kadar saklanabilir. TpCM-2 tipik olarak kullanımdan bir gün önce yapılır. Ayrışma ortamı alıntılanmalı ve dondurulmalıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Sf1Ep-TpCM-2 sistemi, T. pallidum'un sürekli in vitro kültürünü destekleyen ilk mevcut prosedürdür. Sistem, bu organizmanın aşırı büyüme gereksinimleri nedeniyle karmaşıktır: 1) sınırlı biyosentetik yetenekler nedeniyle karmaşık beslenme ihtiyaçları; 2) reaktif oksijen türlerinekarşı yüksek hassasiyete rağmen, küçük miktarlarda oksijen için yeterince anlaşılmamış bir gereklilik 9,10,16,36; ve 3) Sf1Ep hücrelerinin varlığı için mevcut ihtiyaç. Prosedürde 'köşeleri kesmek' cazip gelse de, modifikasyonları denemeden önce başarılı bir uzun vadeli kültür elde edilene kadar adımların dikkatli bir şekilde takip edilmesi önerilir. T. pallidum'un metabolik gereksinimleri hakkında ek bilgi biriktikçe, Sf1Ep hücrelerinin varlığını gerektirmeyen aksenik durumlar geliştirmek mümkün olabilir. Bununla birlikte, in vitro büyüme hızı muhtemelen yavaş kalacaktır (suşa bağlı olarak minimum iki katına çıkma süresi 33 saat ila 46 saat arasında)17,18, T. pallidum'un memeli enfeksiyonu sırasında bile tahmini iki katına çıkma süresinde 30 saat ila 33 saat arasında çoğaldığı göz önüne alındığında37,38. Herhangi bir bakteri kültüründe olduğu gibi, düşük pasajlı stokların korunması ve mutasyonlara bağlı 'genetik sürüklenme' ve ilişkili fenotipik değişikliklerden kaçınmak için bu stoklardan 10 geçişten daha az olan T. pallidum kültürleri ile deneyler yapılması önerilir.
Sf1Ep hücreleri, görünüşe göre treponemlere temel besinleri veya enzimatik aktiviteleri sağlar. Bununla birlikte, besinleri de (glikoz ve oksijen gibi) tüketirler ve düşük pH 9,16,39 gibi toksik durumlar üretebilirler. Bu nedenle, T. pallidum çoğalmasını desteklemek için yeterli Sf1Ep hücresine sahip olmak ile memeli hücrelerinin aşırı büyümesini ve toksisitesini önlemek arasında bir dengeleme eylemi vardır. Sf1Ep hücrelerinin yüksek geçiş sayıları daha hızlı büyüme eğilimindedir ve zaman zaman T. pallidum çoğalmasını destekleme yeteneğini kaybeder. Bu nedenle, Sf1Ep geçiş sayısı izlenmeli ve hücre stokları periyodik olarak düşük geçişli donmuş preparatlarla değiştirilmelidir. Sf1Ep hücrelerinin varlığı, DNA, RNA ve protein içeriği gibi T. pallidum özelliklerinin ve enzim aktivitelerinin incelenmesini de zorlaştırır. Tavşan hücrelerinin uzaklaştırılması, tekrarlanan düşük hızlı santrifüjleme (100 dakika boyunca 5 x g) veya daha etkili bir şekilde Percoll veya Hipak gradyanları40,41 kullanılarak bir dereceye kadar mümkündür. Bununla birlikte, gradyan santrifüjleme yöntemleri genellikle sadece yüksek sayıda T. pallidum ile etkilidir. T. pallidum'un çoğaltılması için alternatif yöntemler, tavşan gibi laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu ile sınırlıdır13,14. Bu yaklaşımın etik düşünceleri vardır ve giderek daha pahalı hale gelmiştir; bununla birlikte, tavşan modeli, T. pallidum patogenezini ve konakçı immün yanıtlarını incelemek için çok yararlıdır. Ek olarak, in vitro kültür ve tavşan enfeksiyonu sırasında T. pallidum'un gen ekspresyonu, büyümesi veya davranışında bazı farklılıklar olması muhtemeldir27.
Bu raporun yazıldığı tarihte, Sf1Ep-TpCM-2 sistemi Amerika Birleşik Devletleri ve Avrupa'da en az 6 araştırma grubunda kurulmuştur ve T. pallidum temel biyolojisi ve genetiğinden antimikrobiyal duyarlılığa kadar çeşitli konularda 16 yayınla sonuçlanmıştır. Bu esrarengiz patojenin incelenmesinde in vitro kültürün değeri, genişletilmiş kullanım ve gelecekteki iyileştirmelerle muhtemelen artacaktır.
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri / NIAID'den R01 AI141958 hibe ile desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E8008 | |
10x Earle’s Balanced Salts, w/o Mg2+, Ca2+ | Gibco | 14155063 | |
15 and 50 mL conical sterile disposable centrifuge tubes | N/A | N/A | |
2 mL cryogenic vials | Corning | 430659 | |
6-well cell culture plates for T. pallidum cultivation | Falcon | 353046 | The plates must have low evaporation lids. |
70% ethanol | N/A | N/A | |
75 cm2 tissue culture flasks with vented caps | Corning | 43061U | |
93.5% nitrogen, 5% CO2, and 1.5% oxygen for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
95% nitrogen and 5% CO2 for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
96-well low evaporation clear, flat-bottom tissue culture-treated microplates | Corning Falcon | 353072 | |
Adjustable multi-channel pipette with 200 ul capacity | N/A | N/A | Optional, but very helpful for cloning |
Cell culture grade water | Sigma | W3500 | |
CMRL 1066 without L-Glutamine or Phenol Red | US Biological | C5900-03A | |
CO2 for tri-gas and tissue culture incubators | N/A | N/A | |
Cryogenic liquid nitrogen cell culture storage tank | N/A | N/A | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
Disposable filter units, 0.2 µm , > 100 mL capacity | N/A | N/A | |
Disposable pipets: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspirating | N/A | N/A | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M1902 | |
DMSO (sterile cell culture grade ) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Eagle’s MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
Fetal bovine serum, heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | We highly recommend this product. Must pre-screen for T. pallidum culture compatibility if using a different brand or catalog number. |
Freezer with capability of maintaining -70 °C or -80 °C | N/A | N/A | For storage of T. pallidum; liquid nitrogen storage may be used instead |
Freezing medium (Sf1Ep medium + 10% [v/v] DMSO) | N/A | N/A | |
Gas cylinders with appropriate fittings | N/A | N/A | |
GasPak 150 vented anaerobic jar (Brewer Jar) | Fisher Scientific | 11-816 | |
Glycerol | N/A | N/A | |
Helber counting chambers with Thoma rulings | Hawksley Medical and Laboratory Equipment | For quantitating T. pallidum | |
Hemocytometer | N/A | N/A | For Sf1Ep cell quantitation |
Incubator tank switch | NuAire | NU-1550 TankGuard Automatic CO2 Incubator Tank Switch | Optional, but very helpful in maintaining appropriate O2 conditions. |
Inverted microscope with phase contrast optics | N/A | N/A | For viewing Sf1Ep cell cultures |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
Microscope with darkfield condensor | N/A | N/A | The microscope should have a 40x objective and 15x eyepieces. |
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
Multi-channel adapter for aspirator | Integra | 155520 | Optional, but useful for cloning |
NaHCO3 (7.5%) | Sigma-Aldrich | S8761 | |
Nitrogen for tri-gas incubator | N/A | N/A | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Sf1Ep (NBL-11) cells | American Type Culture Collection | CCL-68 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Sterile PBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sterile reagent reservoirs, 50 or 100 mL size | N/A | N/A | |
T. pallidum sample, frozen or fresh | from a rabbit infection or in vitro culture | ||
Tissue culture incubator maintained at 37 °C, 5% CO2 | N/A | N/A | |
Tri-gas tissue culture incubator maintained at 34 °C, 5% CO2, 1.5% O2 | Thermofisher | Heracell™ VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator | Optional; anaerobic jars may be used instead (see Ref. 17) |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Vacuum source (e.g. house vacuum), vacuum tubing, vacuum gauge, and connectors | N/A | N/A | |
Water, suitable for cell culture, filter-sterilized, purified | Sigma-Aldrich | W3500 | Recommended for medium preparation; decreases culture variability |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır