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Resumen

Este protocolo describe el cultivo in vitro del patógeno de la sífilis Treponema pallidum subsp. pallidum en cocultivo con células de mamíferos. El método es escalable; se puede utilizar para producir grandes cantidades de T. pallidum y para generar cultivos clonales.

Resumen

Durante más de un siglo, Treponema pallidum subsp. pallidum, la bacteria en forma de espiral que causa la sífilis, solo pudo propagarse mediante la inoculación y la recolección de los organismos de los testículos de conejo. En 2018, describimos un método para cultivar continuamente T. pallidumin vitro. Este sistema utiliza el cocultivo con células epiteliales de conejo (células Sf1Ep) en un medio de cultivo de tejidos que contiene suero llamado TpCM-2. El tiempo de duplicación de T. pallidum en cultivo es similar al que se estima que ocurre durante la infección natural (alrededor de 33-45 h). El organismo puede cultivarse de forma continua con un tiempo de paso estándar de 1 semana en un ambiente con bajo contenido de oxígeno (1,5%) a 34 °C. Este artículo contiene los protocolos para el cultivo de T. pallidum, los métodos para cultivar y mantener las células de cultivo de tejidos requeridas y la técnica para generar cepas isogénicas mediante la limitación de la dilución. La capacidad de cultivar T. pallidum in vitro proporciona nuevas vías experimentales para estudiar y comprender este enigmático organismo.

Introducción

Treponema pallidum es una especie de bacteria en forma de espiral (llamada espiroquetas) que causa sífilis e infecciones relacionadas en humanos y otros primates. La sífilis es una enfermedad grave con efectos a largo plazo en las personas infectadas, y se estima que cada año se producen más de 8 millones de nuevos casos de sífilis en todo el mundo1. T. pallidum se ha subdividido en tres subespecies en función de las enfermedades que causan en los seres humanos, así como de pequeñas diferencias genéticas: subespecie pallidum (que causa la enfermedad de transmisión sexual sífilis), subespecie pertenue (pian) y subespecie endémico (causante de la sífilis endémica)2,3. Pertenue también causa infecciones en babuinos, chimpancés y otros primates. Un microorganismo estrechamente relacionado llamado Treponema paraluiscuniculi (también llamado Treponema paraluisleporidarum) causa una infección en conejos y liebres 4,5. Todas estas bacterias están estrechamente relacionadas, con más del 98% de identidad de secuencia de ADN a nivel del genoma 6,7,8. Cada uno de ellos tiene un solo cromosoma circular pequeño, de aproximadamente 1,14 millones de pares de bases (Mb) de tamaño. Los miembros de este grupo de T. pallidum se encuentran solo en asociación con sus huéspedes mamíferos; Como tales, son patógenos obligados que dependen de su especie huésped para sobrevivir y crecer 9,10.

Los intentos de cultivar T. pallidum in vitro comenzaron poco después de su identificación por Schaudinn y Hoffman en 190511,12. Sin embargo, estos esfuerzos no lograron conducir a un crecimiento consistente y reproducible del organismo. Como resultado, los estudios de investigación de T. pallidum requirieron la propagación del organismo a través de la infección experimental de animales de laboratorio, más comúnmente el conejo13,14. En 1981, Fieldsteel et al.15 introdujeron un sistema de cultivo de tejidos que promovía la multiplicación de cepas de T. pallidum durante un período de hasta 2 semanas. Este sistema implicó el cocultivo de T. pallidum con células epiteliales de conejo de cola de algodón Sf1Ep en un medio de cultivo de tejidos modificado (T. pallidum Culture Medium 1, TpCM-1) basado en el Medio Esencial Mínimo (MEM) de Eagle y un 20% de suero fetal bovino (FBS). Otras condiciones de cultivo requeridas fueron la incubación a 34 °C en una atmósfera que contuviera 1,5% deO2 y 5% de CO2 9,16. En este sistema, T. pallidum se adhiere a las células Sf1Ep y se multiplica cuando está en estrecha asociación con la superficie celular de los mamíferos. A pesar de muchos intentos de subcultivo y otras modificaciones, el sistema de Fieldsteel et al. no logró promover el crecimiento continuo in vitro.

En 2018, nuestro laboratorio informó que el uso de un medio modificado llamado TpCM-2 (en el que el MEM de Eagle se reemplazó por un medio de cultivo de tejidos más complejo, CMRL 1066) proporcionó a T. pallidum los nutrientes necesarios para permitir un cultivo consistente a largo plazo17. Hasta la fecha, esta modificación ha llevado a un cultivo consistente y continuo de al menos 5 cepas de T. pallidum subsp. pallidum (Nichols, SS14, México A, UW231B y UW249B) y una cepa de T. pallidum subsp. endemicum (Bosnia A)18,19. A modo de ejemplo, la cepa de Nichols se ha cultivado de forma continua in vitro durante más de 6 años. Hasta el momento, los intentos de cultivar aislados de pian (T. pallidum subsp. pertenue) o T. paraluiscuniculiin vitro han sido infructuosos18. El sistema TpCM-2 aún requiere la presencia de células Sf1Ep, bajas concentraciones de oxígeno e incubación a 34 °C, lo que hace que el sistema sea más complejo que la mayoría de las técnicas de cultivo bacteriano. Sin embargo, este sistema de cultivo modificado de T. pallidum ha sido útil para definir mejor los requisitos de crecimiento de la bacteria18, determinar las concentraciones inhibitorias mínimas (CMI) de compuestos antimicrobianos y péptidos 20,21,22,23,24,25, propagar nuevas cepas a partir de aspirados de tejido paciente 26, aislar poblaciones clonales de la organismo27, caracterizando el sistema de variación antigénica tprK 27,28, examinando la expresión génica29 y realizando análisis mutacionales 30,31,32.

En este trabajo describimos los métodos actuales de cultivo in vitro de T. pallidum. Esperamos que esta información ayude a facilitar la aplicación más generalizada de esta técnica de cultivo in vitro para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de la sífilis y las infecciones treponémicas relacionadas.

Protocolo

NOTA: Todos los pasos requieren el uso de una técnica aséptica y materiales y reactivos estériles. Se recomienda el uso de una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos para reducir a) la exposición del personal a material infeccioso y b) la posibilidad de contaminación microbiana de los cultivos.

1. Establecimiento de existencias de células Sf1Ep

NOTA: Las células epiteliales de conejo de cola de algodón Sf1Ep se pueden comprar como existencias congeladas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ver Tabla de Materiales). La naturaleza de crecimiento lento y la baja tasa metabólica de las células Sf1Ep parecen ser clave para su capacidad para apoyar la supervivencia y el crecimiento a largo plazo de T. pallidum33; por lo tanto, no se recomienda la sustitución por otros cultivos de células de mamíferos. Las células Sf1Ep no son una línea celular inmortalizada y solo se pueden mantener durante 25-30 pasajes en cultivo. Por lo tanto, es importante mantener un stock congelado de células Sf1Ep de paso bajo para su uso futuro. Las líneas de Sf1Ep inmortalizadas surgen ocasionalmente durante el cultivo a largo plazo de células Sf1Ep. (observaciones inéditas). Estas líneas a menudo crecen más rápido y son más fáciles de manejar; sin embargo, a veces, pierden la capacidad de soportar el crecimiento de T. pallidum . Las líneas Sf1Ep inmortalizadas se pueden usar y luego reemplazar cuando las espiroquetas comienzan a crecer lentamente.

  1. Prepare un medio celular Sf1Ep y precaliéntelo en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 .
    NOTA: El medio celular Sf1Ep consiste en MEM de Eagle suplementado con 10% de FBS, 1x MEM aminoácidos no esenciales, 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. (ver Tabla de Materiales). El medio debe estar esterilizado con filtro y puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 meses. Los antibióticos (como la penicilina y la estreptomicina) no deben usarse en el medio celular Sf1Ep porque el arrastre de incluso trazas de los antibióticos interferirá con el crecimiento de T. pallidum.
  2. Descongele rápidamente el caldo congelado de Sf1Ep a 37 °C. Limpie el exterior del vial con etanol al 70%.
  3. Agregue 1 mL de medio celular Sf1Ep al criovial y mezcle suavemente. Añada la mezcla de medio/material de célula a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL que contenga 5 mL de medio de célula Sf1Ep y mezcle suavemente.
  4. Granular las células por centrifugación a 100 x g durante 7 min. Retire y deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la pelletza de la celda.
  5. Vuelva a suspender suavemente las células Sf1Ep descongeladas en 15 ml de medio celular Sf1Ep fresco y transfiérelas a un matraz de cultivo de tejidos T75.
    NOTA: La recuperación de las células Sf1Ep recién descongeladas se mejora mediante la centrifugación para eliminar el DMSO utilizado para congelar las células. Sin embargo, se pueden omitir los pasos 1.4-1.7 y las células descongeladas del paso 3 se pueden sembrar directamente en un matraz de cultivo de tejidos T75 que contenga 14 mL de medio celular Sf1Ep. Después de la incubación durante la noche, reemplace la mitad del medio con medio Sf1Ep fresco para diluir el DMSO residual.
  6. Incubar los cultivos de Sf1Ep en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada estándar a 37 °C, 5% de CO2. Afloje las tapas de los matraces de cultivo de tejidos no ventilados para mantener un pH medio adecuado.

2. Paso de células Sf1Ep

NOTA: El crecimiento del cultivo de células Sf1Ep se monitorea con un microscopio invertido utilizando óptica de contraste de fase. Por lo general, las células tardan alrededor de una semana en alcanzar casi la confluencia. Cuando las células alcanzan ~90% de confluencia, pueden pasarse, utilizarse para el cultivo de T. pallidum o para la preparación de existencias congeladas. La vida del cultivo puede prolongarse a dos semanas mediante la sustitución de la mitad del medio de cultivo después de una semana de cultivo.

  1. Aspire y deseche el medio de crecimiento Sf1Ep del matraz. Enjuague la capa de células con 5 mL de PBS estéril a temperatura ambiente (RT) y aspire y deseche el enjuague de PBS.
  2. Añadir 2,5 mL de tripsina-EDTA al matraz y sellar el tapón. Agite el matraz hacia adelante y hacia atrás para cubrir la capa celular con tripsina-EDTA e incube el matraz a 37 °C durante 5 min.
  3. Golpee suavemente el matraz para desalojar las células. Observar bajo un microscopio invertido para confirmar la dispersión de las células Sf1Ep.
  4. Añadir 5 mL de medio de crecimiento Sf1Ep y mecer el matraz para mezclar con la tripsina-EDTA y detener la acción de la tripsina. Retire las células Sf1Ep suspendidas y colóquelas en un tubo cónico estéril.
  5. Cuantifique las células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  6. Para mantener las existencias de células de trabajo, transfiera una alícuota (0,5-1,0 mL o ~8 x 105 células) de la mezcla de medio/tripsina-EDTA/células a un nuevo matraz de cultivo de tejidos T75 que contenga 15 mL de medio Sf1Ep fresco.
  7. Para el cultivo de T. pallidum , diluir las células en medio Sf1Ep a 0,25-0,5 x 105 células/mL y sembrar en recipientes de cultivo apropiados (Tabla 1).
  8. Para congelar células Sf1Ep, centrifugar en una centrífuga de mesa a 100 x g durante 7 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletización de la celda. Vuelva a suspender el pellet celular en medio Sf1Ep suplementado con DMSO de grado de cultivo de tejidos al 10%.
  9. Distribuya 1 mL de la suspensión celular a cada criovial y congele durante la noche a -70 °C a -80 °C en un recipiente aislado (como un soporte para tubos de ensayo de espuma de poliestireno) para mejorar la retención de la viabilidad antes de transferir los viales a un recipiente criogénico de nitrógeno líquido.

3. Cultivo de T. pallidum

PRECAUCIÓN: Todas las subespecies y cepas de T. pallidum son patógenas para los seres humanos y están clasificadas como patógenos de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2)34. Son necesarias medidas adecuadas para proteger al personal; estos incluyen el uso de guantes y otros equipos de protección personal (EPP), así como la desinfección de superficies, materiales y líquidos potencialmente expuestos a T. pallidum. T. pallidum se inactiva fácilmente mediante la exposición a etanol al 70% o a desinfectantes disponibles comercialmente. Se recomienda el uso constante de campanas de flujo laminar para el manejo de muestras que contengan T. pallidum .

NOTA: T. pallidum es un organismo microaerófilo que puede ser eliminado por unas pocas horas de exposición a los niveles atmosféricos de oxígeno 9,16,35. Por lo tanto, se recomienda que la manipulación de T. pallidum en el aire se limite a menos de una hora si es posible. Además, el medio TpCM-2 debe estar preequilibrado en 1.5% O2, 5% CO2, equilibrio N2 y se debe limitar la agitación vigorosa (por ejemplo, el uso de un vórtice). Debido a que el cultivo de T. pallidum generalmente se lleva a cabo en ausencia de antibióticos, se necesita cuidado adicional para evitar la contaminación con bacterias u hongos. El procedimiento de Sf1Ep-TpCM-2 para el cultivo de T. pallidum se resume en la Figura 1 e implica múltiples pasos, incluida la siembra de los recipientes de cultivo con células Sf1Ep, la preparación del medio TpCM-2 y la inoculación de los cultivos con T. pallidum. El suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor es un componente crítico del medio, y su eficacia varía según los diferentes proveedores y lotes19. Es necesario el precribado de la eficacia de los lotes de FBS.

  1. Seleccione el tamaño de referencia cultural adecuado.
    NOTA: El cultivo de T. pallidum es escalable desde formatos grandes (como matraces de75 cm 2 que producen ~1 x 109 T. pallidum por cultivo) hasta placas de 96 pocillos (adecuados para experimentos de clonación)17,18,19,27. 
    1. Al ajustar el tamaño del cultivo, se debe tener en cuenta el número de células Sf1Ep y T. pallidum inoculadas por cultivo, así como la cantidad de medio necesario, como se muestra en la Tabla 1. Utilice matraces con tapones ventilados, ya que permiten la libre circulación de gases con una disminución de la pérdida de volumen debido a la evaporación.
    2. Utilice el formato de placa de 6 pocillos para los cultivos iniciales porque es conveniente incluir réplicas por triplicado y pocillos adicionales en caso de que ocurra contaminación microbiana.
  2. Siembre las células Sf1Ep 1-2 días antes del experimento.
    1. Preparar una suspensión de células Sf1Ep por tripsinización de cultivos madre, como se describe en el paso 2.7.
    2. Determine la concentración de células Sf1Ep en la suspensión utilizando un hematitómetro o un contador de células automatizado.
    3. Agregue el número apropiado de células Sf1Ep y medio Sf1Ep (Tabla 1) a cada cultivo. Incubar los cultivos a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos estándar con 5% deCO2 hasta su uso.
  3. Prepare TpCM-2 1 día antes del experimento.
    NOTA: El TpCM-2 puede prepararse y almacenarse a -20 °C durante varios meses. El medio debe descongelarse y equilibrarse en la incubadora de bajo oxígeno el día anterior al experimento.
    1. Obtener soluciones estériles para los componentes de TpCM-2 (Tabla 2) comercialmente o prepararlas a partir de reactivos secos y filtrarlas-esterilizarlas. Almacene las soluciones a 4 °C durante un máximo de 2 meses. Ajuste el pH del tampón MOPS a 7,5 antes de la esterilización del filtro; de lo contrario, no es necesario ajustar el pH de los componentes o del TpCM-2 final.
      NOTA: Se recomienda el uso de agua destilada estéril de grado de cultivo de tejidos para la preparación de los componentes del medio.
    2. Combine los reactivos enumerados en la Tabla 2 en un recipiente estéril, agregando ditiotreitol (DTT) como polvo seco al final (para minimizar su oxidación). Aumente (o disminuya) las cantidades de cada componente para preparar la cantidad necesaria de TpCM-2. Mezcle suavemente y filtre-esterilice el medio con una unidad de filtro de 0,22 μm.
    3. Afloje la tapa del matraz que contiene el TpCM-2. Preequilibre el medio colocándolo en un frasco anaeróbico (Brewer), evacúe y vuelva a llenar con una mezcla de gases 95% N2, 5% CO 2 y 5% CO2 después de la evacuación final. En la Figura 2 se muestra un ejemplo de un sistema para llevar a cabo este proceso de intercambio de gases.
    4. Transfiera rápidamente el medio a una incubadora de tres gases configurada para proporcionar una atmósfera de 1,5 % de O2, 5 % de CO2 y equilibrar N2 a 34 °C. Alternativamente, el frasco anaeróbico que contiene el medio puede sellarse siguiendo el intercambio de gases descrito en el punto 3.3.3 y transferirse a una incubadora estándar.
  4. En la mañana del experimento, observe los cultivos de Sf1Ep con un microscopio invertido. Asegúrese de que las celdas estén unidas y confluentes entre un 5% y un 10%. Retire el medio de forma aséptica.
  5. Enjuague los pocillos brevemente con un volumen pequeño (de 0,2 mL a 2 mL, dependiendo del tamaño del recipiente) del TpCM-2 preequilibrado, retire el enjuague y agregue la cantidad adecuada de TpCM-2 (Tabla 1). Equilibrar las placas en una atmósfera de 1,5% O2, 5% de CO2 y equilibrar N2 a 34 °C durante 3-4 h como se ha descrito anteriormente.
  6. Transfiera las placas a una campana de flujo laminar e inocule con el número apropiado (Tabla 1) de T. pallidum de existencias congeladas o preparaciones tripsinizadas de cultivos recién cosechados (como se describe a continuación). También pueden utilizarse animales recién preparados o congelados recogidos asépticamente de conejos infectados13 13. Reequilibrar las placas como se describe en 3.3.3 e incubar los cultivos en una atmósfera de 1,5% de O2, 5% de CO2 y equilibrar N2 a 34 °C.

4. Cosecha y paso de cultivos de T. pallidum

NOTA: Debido a que la mayoría de T. pallidum en cultivo está adherida a la superficie de las células Sf1Ep, es necesario disociar los treponemas de las células de mamíferos para recuperarlos y obtener un recuento preciso de los organismos. Dicha "cosecha" y paso a cultivos frescos se realiza típicamente el día 7 de cultivo. El procedimiento descrito aquí es para placas de 6 pocillos; la cantidad de solución de tripsina-EDTA utilizada se ajusta hacia arriba o hacia abajo dependiendo del tamaño del formato de cultivo 17,19,27.

  1. En el momento de la cosecha, retire los cultivos de la incubadora. Examine la capa de células Sf1Ep en cada pocillo utilizando un microscopio de contraste de fase invertida y registre la densidad celular (por ejemplo, 80% confluente) y su apariencia. Además, observe el color del TpCM-2; el indicador de resazurina a menudo cambiará de rosa a amarillo como resultado de un pH más bajo.
  2. Pipetee el medio de cada pocillo en un tubo cónico estéril de 15 mL, utilizando pipetas separadas para cada pocillo para evitar la contaminación cruzada. Enjuague cada pocillo con 0,35 ml de solución precalentada de tripsina-EDTA y agregue el enjuague al medio.
  3. Añadir otros 0,35 mL de solución de tripsina-EDTA a cada pocillo e incubar la placa durante 5 min en una incubadora estándar a 37 °C; no se requiere una atmósfera baja deO2 durante este breve período de tiempo.
  4. Verifique el redondeo y el desprendimiento de las células Sf1Ep, que también se correlaciona con la disociación de T. pallidum de las células de mamíferos. Monitoree este proceso usando el microscopio invertido y proporcione tiempo adicional o solución de tripsina-EDTA según sea necesario. El proceso de disociación se facilita golpeando suavemente el costado de la placa inmovilizada con un soporte de tubo de ensayo de plástico u objeto similar.
  5. Pipetear el medio reservado y enjuagar en el pocillo para recuperar el T. pallidum disociado y las células. Registre el volumen total recuperado para el cálculo del rendimiento por cultivo.
  6. En la mayoría de los experimentos, transfiera un volumen determinado de T . pallidum cosechado a placas de cultivo con células frescas de Sf1Ep y TpCM-2. En tales casos, transfiera aproximadamente 1/20del volumen de cultivo (por ejemplo, 200 μl para un cultivo de 4 ml y 6 pocillos en placa); ajuste este volumen hacia arriba o hacia abajo dependiendo de si la cepa de T. pallidum es de crecimiento rápido o lento. Retire las células Sf1Ep en el inóculo por centrifugación a 100 x g durante 5 min, pero este paso no es necesario para las transferencias de rutina.
  7. Inmediatamente después de inocular las placas para un experimento, intercambie la atmósfera de las placas mediante el proceso de evacuación y rellenado (paso 3.3.3). Incubar las placas a 34 °C dentro del frasco de cerveza o transferirlas a una incubadora de tres gases.
  8. Enumere T. pallidum por microscopía de campo oscuro utilizando una cámara de recuento Helber o un dispositivo similar, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: La cámara Helber es un portaobjetos y cubreobjetos de vidrio calibrado que mejora en gran medida la precisión y la reproducibilidad de los recuentos bacterianos; La cámara se desinfecta, limpia y seca fácilmente con etanol al 70% y pañuelos de papel y se puede reutilizar indefinidamente. Idealmente, el microscopio de campo oscuro debe tener un objetivo de 40x y oculares de 15x. Realice recuentos duplicados para cada cultivo y registre el número de T. pallidum móvil e inmóvil y se registre cualquier cambio morfológico. La PCR cuantitativa (qPCR) también puede utilizarse en los casos en que no se requiere una cuantificación precisa y una determinación de la motilidad17,24.
  9. En experimentos en los que el tratamiento con tripsina puede no ser deseable (como los que examinan el contenido de proteínas de T. pallidum), utilice un medio de disociación de EDTA para disociar el T. pallidum y la monocapa celular17,19.
    NOTA: El medio de disociación consiste en FBS que se ha dializado contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina básica de Earle (EBSS) sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio para eliminar cationes divalentes en un medio de cultivo simplificado de T. pallidum (Tabla 2). Este procedimiento puede llevar un período de tiempo más largo (hasta 30 minutos) o un tratamiento repetido para una disociación completa.

5. Congelación y almacenamiento de cultivos de T. pallidum

NOTA: T. pallidum puede almacenarse indefinidamente a -70 °C o menos, con una viabilidad tras la descongelación que suele ser del 50% al 90%.

  1. Congele los cultivos de T. pallidum en la cosecha con la adición de glicerol al 10% (v/v). Disperse el glicerol por toda la preparación mediante un pipeteo suave o una inversión. A continuación, distribuya la preparación en alícuotas de 1-2 ml en viales de congelación con tapón de rosca e introduzca inmediatamente los viales en un congelador de -80 °C o en un congelador de líquidos N2 .
  2. Para iniciar un cultivo de T. pallidum a partir de material congelado, primero prepare uno o varios recipientes de cultivo apropiados que contengan células Sf1Ep y TpCM-2, como se describe en la sección 3. Descongele rápidamente el vial que contiene el caldo congelado de T. pallidum ; En este sentido, es útil el uso cuidadoso de un baño de agua a 37 °C o un bloque calefactor.
  3. Luego, transfiera la preparación descongelada a los recipientes de cultivo. Asegúrese de que la relación entre el volumen de caldo congelado y el medio Tp-CM2 sea de 1:5 o superior para garantizar una dilución suficiente de glicerol para promover la supervivencia y el crecimiento de T. pallidum.
  4. Incubar el cultivo en condiciones microaeróbicas durante 7 días y transferirlo a cultivos frescos como se describe en la sección 4.

6. Generación de clones isogénicos de T. pallidum

NOTA: Este procedimiento se describe en detalle en un estudio previo27.

  1. En un experimento típico, prepare y preequilibre dos placas de 96 pocillos con 1000 células Sf1Ep y 200 μL de TpCM-2 por pocillo, como se describe en la sección 3.
    NOTA: Una pipeta multicanal de 200 μL y depósitos de reactivos desechables estériles compatibles simplifican en gran medida los pasos de inoculación, intercambio de medios e inoculación de células Sf1Ep.
  2. Cuantifique la concentración de T. pallidum en una preparación recién cosechada utilizando un microscopio de campo oscuro y una cámara Helber (paso 4.8). Diluir la suspensión de T. pallidum en TpCM-2 para producir dos preparaciones con concentraciones de 10 treponemas/mL y 40 treponemas/mL; 10 mL de cada preparación es más que suficiente para inocular una placa de 96 pocillos con cada dilución. Como control, prepare 1 mL de otra dilución que contenga 2 x 103 T. pallidum/mL.
  3. Utilizando una pipeta monocanal estándar o una pipeta multicanal, inocule 50 μL por pocillo de la preparación de 10 T. pallidum/mL en una de las placas de 96 pocillos preparadas, omitiendo dos pocillos de control. Repita este proceso con la preparación de 40 T. pallidum/mL y la otra placa. En los dos pocillos de control de cada placa, inocular la dilución de 2 x 103 T . pallidum/mL. Este proceso producirá placas con (en promedio) 0.5 o 2 T. pallidum por pocillo, junto con pozos de control positivo que contienen 100 T. pallidum.
    NOTA: La eficiencia de siembra de T. pallidum es baja en estas condiciones, por lo que incluso los pozos sembrados con ~ 2 organismos probablemente produzcan poblaciones clonales.
  4. Equilibre las placas con la mezcla de gases con bajo contenido deO2 (paso 3.3.3) e incube en un frasco de cerveza o en una incubadora trigás a 34 °C.
  5. A los 7 días, retire 100 μL de medio de cada pocillo de cultivo y reemplácelo con 100 μL de TpCM-2 fresco y equilibrado. Verifique la viabilidad y el crecimiento de T. pallidum en los pocillos de control mediante microscopía de campo oscuro y enumeración para asegurarse de que las condiciones de cultivo apoyan la multiplicación de T. pallidum .
    NOTA: Asegúrese de utilizar una nueva punta de pipeta para cada pocillo para evitar la contaminación cruzada de los cultivos clonales.
  6. A los 14 días, transfiera 50 μL del sobrenadante de cultivo de cada pocillo a placas frescas preparadas como en el paso 6.1.
  7. Repita alternando la alimentación y el paso según sea necesario los días 21 y 28.
  8. Monitoree la presencia de T. pallidum en cada pozo mediante microscopía de campo oscuro o qPCR26.
    NOTA: Con la lenta tasa de crecimiento de T. pallidum y la pérdida necesaria de organismos durante la alimentación y la transferencia, los pocillos sembrados con 0.5 o 2 T. pallidum generalmente no son positivos por ninguno de los métodos hasta el día 28 o después.
  9. Una vez que se identifican los pozos positivos, se tripsinizan y se transfieren estos pocillos a placas de 24 pocillos para una mayor expansión. Determinar la clonalidad por el predominio de una sola secuencia de tprK y la presencia de secuencias únicas en sitios que son heterogéneos en la cepa parental27.

Resultados

Usando las condiciones descritas, T. pallidum típicamente retiene >90% de motilidad y se multiplica logarítmicamente con un tiempo de duplicación de 33 h a 45 h durante aproximadamente 7 días antes de entrar en la fase estacionaria (Figura 3). En el transcurso de 1 semana, las espiroquetas se someten a aproximadamente 4-5 duplicaciones (Figura 4). ). Además, las diferentes cepas de T. pallidum pueden crecer a diferentes ritmos. Las cepas del grupo SS14 de T. pallidum tienden a tener tiempos de duplicación más lentos que las del grupo Nichols17.

La alimentación de los cultivos puede prolongar el tiempo de cultivo varios días, pero la capa de células Sf1Ep a menudo falla después de una semana de cultivo. Además, los treponemas alcanzan un límite superior de organismos de aproximadamente 5 x 107/mL. Los cultivos transferidos a intervalos de 7 días generalmente continúan la multiplicación logarítmica con poca o ninguna fase de retraso. Los organismos en la fase estacionaria a menudo se vuelven difíciles de pasar.

La mayoría de los T. pallidum están unidos a las células Sf1Ep. Sin embargo, queda suficiente T. pallidum en el sobrenadante para que las muestras de medio puedan extraerse periódicamente para comprobar su viabilidad y multiplicación. Si se requiere una cuantificación cuidadosa, se debe medir el volumen del medio extraído, cuantificar el número de T. pallidum y agregar el número total de organismos extraídos a los recuentos finales en la cosecha.

En estudios previos, la eficiencia de clonación (número de cultivos positivos por organismo inoculado) fue de 12,5% para 2 T. pallidum inoculados por pocillo y de 6,7% para 0,5 T. pallidum inoculados por pocillo27. Por lo tanto, es probable que cualquier pozo positivo represente el crecimiento de un solo organismo en cualquiera de estos inóculos. Sin embargo, la clonalidad de las poblaciones resultantes debe verificarse examinando la homogeneidad del cultivo en sitios que son heterogéneos en el cultivo original. La forma más definitiva de demostrar que el cultivo es isogénico es a través de la secuenciación del genoma completo27.

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Figura 1: Diagrama de flujo del procedimiento de cultivo in vitro de T. pallidum. Esta figura ha sido reimpresa con permiso de Edmondson y Norris (2021)19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Diagrama del sistema para equilibrar los reactivos de cultivo de T. pallidum en un entorno con poco oxígeno. Un respiradero de jarra de cerveza está conectado a través de una junta en T a una fuente de vacío (como una aspiradora doméstica) y a cilindros de gas que contienen mezclas de gases personalizadas (5% de CO2, nitrógeno de equilibrio y 1,5% de O2, 5% de CO2, nitrógeno de equilibrio). Un vacuómetro en línea mide el vacío aspirado en el tarro. El vacío se extrae en el frasco a aproximadamente -58 kPa. A continuación, el frasco evacuado se vuelve a llenar lentamente con las mezclas de gases. El frasco de cerveza se rellena tres veces con 5% de CO2, equilibra el nitrógeno antes de una evacuación final y se rellena con 95% de N2, 5% de CO2, 1,5% de O2. A continuación, los cultivos o medios se retiran del frasco y se transfieren rápidamente a la incubadora de bajo oxígeno. Alternativamente, el tubo entre el frasco de cerveza y la primera junta en T se puede sujetar firmemente, el tubo se puede desconectar de la junta en T y todo el frasco de cerveza se puede transferir a una incubadora a 34 °C. Esta figura ha sido reimpresa con permiso de Edmondson y Norris (2021)19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Curvas de crecimiento de T. pallidum cultivado con células Sf1Ep con medio TpCM-2. Se sembraron cultivos triplicados paralelos con T. pallidum. Se cosecharon réplicas en cada punto de tiempo; los resultados representan la media + SEM para estos cultivos. (A) Se muestran los cambios en T. pallidum por cultivo y (B) por ciento de motilidad. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Edmondson et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Ejemplo de paso de cultivo in vitro de T. pallidum, cepa de Nichols. Los cultivos triplicados paralelos se sembraron con T. pallidum y se pasaron semanalmente utilizando una dilución 1:20. El diagrama de dientes de sierra muestra el número de T. pallidum por cultivo y el número transferido a nuevos cultivos en cada punto de tiempo. Los resultados representan la media ± SEM para tres réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Volumen medio y proporciones de siembra para recipientes de cultivo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Medios para el cultivo de T. pallidum . Todos los medios deben esterilizarse con filtro después de la preparación. El medio Sf1Ep puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de dos meses. Por lo general, TpCM-2 se prepara un día antes de su uso. El medio de disociación debe ser alícuota y congelado. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El sistema Sf1Ep-TpCM-2 es el primer procedimiento disponible que promueve el cultivo continuo in vitro de T. pallidum. El sistema es complejo debido a los requisitos extremos de crecimiento de este organismo: 1) necesidades nutricionales complejas debido a las capacidades biosintéticas limitadas; 2) un requerimiento mal entendido de pequeñas cantidades de oxígeno, a pesar de la alta sensibilidad a las especies reactivas de oxígeno 9,10,16,36; y 3) la necesidad actual de la presencia de células Sf1Ep. Si bien es tentador "tomar atajos" en el procedimiento, se recomienda que los pasos se sigan cuidadosamente hasta que se logre una cultura exitosa a largo plazo antes de intentar modificaciones. A medida que se acumula información adicional sobre los requisitos metabólicos de T. pallidum, puede ser posible desarrollar condiciones axénicas que no requieran la presencia de células Sf1Ep. Sin embargo, es probable que la tasa de crecimiento in vitro siga siendo lenta (con un tiempo mínimo de duplicación de 33 h a 46 h, dependiendo de la cepa)17,18, dado que T. pallidum se multiplica a un tiempo de duplicación estimado de 30 h a 33 h incluso durante la infección en mamíferos37,38. Al igual que con cualquier cultivo bacteriano, se recomienda que se mantengan las existencias de paso bajas y que se lleven a cabo experimentos con cultivos de T. pallidum que estén a menos de 10 pasos de estas existencias para evitar la "deriva genética" y los cambios fenotípicos asociados debido a las mutaciones.

Las células Sf1Ep aparentemente proporcionan nutrientes esenciales o actividades enzimáticas a los treponemas. Sin embargo, también consumen nutrientes (como glucosa y oxígeno) y pueden producir condiciones tóxicas como pH bajo 9,16,39. Por lo tanto, existe un acto de equilibrio entre tener suficientes células Sf1Ep para apoyar la multiplicación de T. pallidum y prevenir el sobrecrecimiento y la toxicidad de las células de mamíferos. Los números altos de paso de las células Sf1Ep tienden a crecer más rápido y, a veces, pierden la capacidad de apoyar la multiplicación de T. pallidum. Como tal, se debe monitorear el número de paso de Sf1Ep y las existencias de celdas deben reemplazarse periódicamente con preparaciones congeladas de paso bajo. La presencia de células Sf1Ep también complica el estudio de las propiedades de T. pallidum, como el contenido de ADN, ARN y proteínas, y las actividades enzimáticas. La eliminación de las células de conejo es posible hasta cierto punto utilizando centrifugación repetida a baja velocidad (100 x g durante 5 min) o, más eficazmente, utilizando gradientes de Percoll o Hypaque40,41. Sin embargo, los métodos de centrifugación en gradiente generalmente solo son efectivos con un alto número de T. pallidum. Los métodos alternativos para propagar T. pallidum se limitan a la infección de animales de laboratorio como los conejos13,14. Este enfoque tiene consideraciones éticas y se ha vuelto cada vez más costoso; sin embargo, el modelo de conejo es muy útil para estudiar la patogénesis de T. pallidum y las respuestas inmunitarias del huésped. Además, es probable que existan algunas diferencias en la expresión génica, el crecimiento o el comportamiento de T. pallidum durante el cultivo in vitro y la infección en conejo27.

En el momento de este informe, el sistema Sf1Ep-TpCM-2 se ha establecido en al menos 6 grupos de investigación en los Estados Unidos y Europa y ha dado lugar a 16 publicaciones con temas que van desde la biología básica y la genética de T. pallidum hasta la susceptibilidad a los antimicrobianos. Es probable que el valor del cultivo in vitro en el estudio de este enigmático patógeno aumente con la expansión del uso y las mejoras futuras.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención R01 AI141958 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos/NIAID. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Sigma E8008
10x Earle’s Balanced Salts, w/o Mg2+, Ca2+Gibco14155063
15 and 50 mL conical sterile disposable centrifuge tubes N/AN/A
2 mL cryogenic vials Corning430659
6-well cell culture plates for T. pallidum cultivation Falcon353046The plates must have low evaporation lids.
70% ethanolN/AN/A
75 cm2 tissue culture flasks with vented capsCorning43061U
93.5% nitrogen, 5% CO2, and 1.5% oxygen for pre-equilibrating medium and culturesN/AN/A
95% nitrogen and 5% CO2 for pre-equilibrating medium and culturesN/AN/A
96-well low evaporation clear, flat-bottom tissue culture-treated microplatesCorning Falcon353072
Adjustable multi-channel pipette with 200 ul capacity N/AN/AOptional, but very helpful for cloning
Cell culture grade waterSigmaW3500
CMRL 1066 without L-Glutamine or Phenol RedUS BiologicalC5900-03A
CO2 for tri-gas and tissue culture incubators N/AN/A
Cryogenic liquid nitrogen cell culture storage tankN/AN/A
D-glucoseSigma-AldrichG6152
Disposable filter units, 0.2 µm , > 100 mL capacityN/AN/A
Disposable pipets: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspiratingN/AN/A
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD9779
D-Mannitol Sigma-AldrichM1902
DMSO (sterile cell culture grade )Sigma-AldrichD2650
Eagle’s MEMSigma-AldrichM4655
Fetal bovine serum, heat inactivated Sigma-AldrichF4135We highly recommend this product. Must pre-screen for T. pallidum culture compatibility if using a different brand or catalog number.
Freezer with capability of maintaining -70 °C or -80 °CN/AN/AFor storage of T. pallidum; liquid nitrogen storage may be used instead
Freezing medium (Sf1Ep medium + 10% [v/v] DMSO)N/AN/A
Gas cylinders with appropriate fittingsN/AN/A
GasPak 150 vented anaerobic jar (Brewer Jar)Fisher Scientific11-816
GlycerolN/AN/A
Helber counting chambers with Thoma rulingsHawksley Medical and Laboratory EquipmentFor quantitating T. pallidum
HemocytometerN/AN/A For Sf1Ep cell quantitation
Incubator tank switchNuAire NU-1550 TankGuard Automatic CO2 Incubator Tank SwitchOptional, but very helpful in maintaining appropriate O2 conditions.
Inverted microscope with phase contrast opticsN/AN/AFor viewing Sf1Ep cell cultures
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
L-Histidine Sigma-AldrichH6034
MEM Non-Essential Amino AcidsGibco11140-050
Microscope with darkfield condensorN/AN/AThe microscope should have a 40x objective and 15x eyepieces.
MOPSSigma-AldrichM3183
Multi-channel adapter for aspirator Integra155520Optional, but useful for cloning
NaHCO3 (7.5%)Sigma-AldrichS8761
Nitrogen for tri-gas incubatorN/AN/A
ResazurinSigma-AldrichR7017
Sf1Ep (NBL-11) cellsAmerican Type Culture CollectionCCL-68
Sodium pyruvateSigma-AldrichS8636
Sterile PBS (without calcium chloride and magnesium chloride) Sigma-AldrichD8537
Sterile reagent reservoirs, 50 or 100 mL sizeN/AN/A
T. pallidum sample, frozen or fresh from a rabbit infection or in vitro culture
Tissue culture incubator maintained at 37 °C, 5% CO2N/AN/A
Tri-gas tissue culture incubator maintained at 34 °C, 5% CO2, 1.5% O2ThermofisherHeracell™ VIOS 160i Tri-Gas CO2 IncubatorOptional; anaerobic jars may be used instead (see Ref. 17)
Trypsin-EDTA solution Sigma-AldrichT4049
Vacuum source (e.g. house vacuum), vacuum tubing, vacuum gauge, and connectorsN/AN/A
Water, suitable for cell culture, filter-sterilized, purifiedSigma-AldrichW3500Recommended for medium preparation; decreases culture variability

Referencias

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