Este protocolo describe el cultivo in vitro del patógeno de la sífilis Treponema pallidum subsp. pallidum en cocultivo con células de mamíferos. El método es escalable; se puede utilizar para producir grandes cantidades de T. pallidum y para generar cultivos clonales.
Durante más de un siglo, Treponema pallidum subsp. pallidum, la bacteria en forma de espiral que causa la sífilis, solo pudo propagarse mediante la inoculación y la recolección de los organismos de los testículos de conejo. En 2018, describimos un método para cultivar continuamente T. pallidumin vitro. Este sistema utiliza el cocultivo con células epiteliales de conejo (células Sf1Ep) en un medio de cultivo de tejidos que contiene suero llamado TpCM-2. El tiempo de duplicación de T. pallidum en cultivo es similar al que se estima que ocurre durante la infección natural (alrededor de 33-45 h). El organismo puede cultivarse de forma continua con un tiempo de paso estándar de 1 semana en un ambiente con bajo contenido de oxígeno (1,5%) a 34 °C. Este artículo contiene los protocolos para el cultivo de T. pallidum, los métodos para cultivar y mantener las células de cultivo de tejidos requeridas y la técnica para generar cepas isogénicas mediante la limitación de la dilución. La capacidad de cultivar T. pallidum in vitro proporciona nuevas vías experimentales para estudiar y comprender este enigmático organismo.
Treponema pallidum es una especie de bacteria en forma de espiral (llamada espiroquetas) que causa sífilis e infecciones relacionadas en humanos y otros primates. La sífilis es una enfermedad grave con efectos a largo plazo en las personas infectadas, y se estima que cada año se producen más de 8 millones de nuevos casos de sífilis en todo el mundo1. T. pallidum se ha subdividido en tres subespecies en función de las enfermedades que causan en los seres humanos, así como de pequeñas diferencias genéticas: subespecie pallidum (que causa la enfermedad de transmisión sexual sífilis), subespecie pertenue (pian) y subespecie endémico (causante de la sífilis endémica)2,3. Pertenue también causa infecciones en babuinos, chimpancés y otros primates. Un microorganismo estrechamente relacionado llamado Treponema paraluiscuniculi (también llamado Treponema paraluisleporidarum) causa una infección en conejos y liebres 4,5. Todas estas bacterias están estrechamente relacionadas, con más del 98% de identidad de secuencia de ADN a nivel del genoma 6,7,8. Cada uno de ellos tiene un solo cromosoma circular pequeño, de aproximadamente 1,14 millones de pares de bases (Mb) de tamaño. Los miembros de este grupo de T. pallidum se encuentran solo en asociación con sus huéspedes mamíferos; Como tales, son patógenos obligados que dependen de su especie huésped para sobrevivir y crecer 9,10.
Los intentos de cultivar T. pallidum in vitro comenzaron poco después de su identificación por Schaudinn y Hoffman en 190511,12. Sin embargo, estos esfuerzos no lograron conducir a un crecimiento consistente y reproducible del organismo. Como resultado, los estudios de investigación de T. pallidum requirieron la propagación del organismo a través de la infección experimental de animales de laboratorio, más comúnmente el conejo13,14. En 1981, Fieldsteel et al.15 introdujeron un sistema de cultivo de tejidos que promovía la multiplicación de cepas de T. pallidum durante un período de hasta 2 semanas. Este sistema implicó el cocultivo de T. pallidum con células epiteliales de conejo de cola de algodón Sf1Ep en un medio de cultivo de tejidos modificado (T. pallidum Culture Medium 1, TpCM-1) basado en el Medio Esencial Mínimo (MEM) de Eagle y un 20% de suero fetal bovino (FBS). Otras condiciones de cultivo requeridas fueron la incubación a 34 °C en una atmósfera que contuviera 1,5% deO2 y 5% de CO2 9,16. En este sistema, T. pallidum se adhiere a las células Sf1Ep y se multiplica cuando está en estrecha asociación con la superficie celular de los mamíferos. A pesar de muchos intentos de subcultivo y otras modificaciones, el sistema de Fieldsteel et al. no logró promover el crecimiento continuo in vitro.
En 2018, nuestro laboratorio informó que el uso de un medio modificado llamado TpCM-2 (en el que el MEM de Eagle se reemplazó por un medio de cultivo de tejidos más complejo, CMRL 1066) proporcionó a T. pallidum los nutrientes necesarios para permitir un cultivo consistente a largo plazo17. Hasta la fecha, esta modificación ha llevado a un cultivo consistente y continuo de al menos 5 cepas de T. pallidum subsp. pallidum (Nichols, SS14, México A, UW231B y UW249B) y una cepa de T. pallidum subsp. endemicum (Bosnia A)18,19. A modo de ejemplo, la cepa de Nichols se ha cultivado de forma continua in vitro durante más de 6 años. Hasta el momento, los intentos de cultivar aislados de pian (T. pallidum subsp. pertenue) o T. paraluiscuniculiin vitro han sido infructuosos18. El sistema TpCM-2 aún requiere la presencia de células Sf1Ep, bajas concentraciones de oxígeno e incubación a 34 °C, lo que hace que el sistema sea más complejo que la mayoría de las técnicas de cultivo bacteriano. Sin embargo, este sistema de cultivo modificado de T. pallidum ha sido útil para definir mejor los requisitos de crecimiento de la bacteria18, determinar las concentraciones inhibitorias mínimas (CMI) de compuestos antimicrobianos y péptidos 20,21,22,23,24,25, propagar nuevas cepas a partir de aspirados de tejido paciente 26, aislar poblaciones clonales de la organismo27, caracterizando el sistema de variación antigénica tprK 27,28, examinando la expresión génica29 y realizando análisis mutacionales 30,31,32.
En este trabajo describimos los métodos actuales de cultivo in vitro de T. pallidum. Esperamos que esta información ayude a facilitar la aplicación más generalizada de esta técnica de cultivo in vitro para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de la sífilis y las infecciones treponémicas relacionadas.
NOTA: Todos los pasos requieren el uso de una técnica aséptica y materiales y reactivos estériles. Se recomienda el uso de una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos para reducir a) la exposición del personal a material infeccioso y b) la posibilidad de contaminación microbiana de los cultivos.
1. Establecimiento de existencias de células Sf1Ep
NOTA: Las células epiteliales de conejo de cola de algodón Sf1Ep se pueden comprar como existencias congeladas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ver Tabla de Materiales). La naturaleza de crecimiento lento y la baja tasa metabólica de las células Sf1Ep parecen ser clave para su capacidad para apoyar la supervivencia y el crecimiento a largo plazo de T. pallidum33; por lo tanto, no se recomienda la sustitución por otros cultivos de células de mamíferos. Las células Sf1Ep no son una línea celular inmortalizada y solo se pueden mantener durante 25-30 pasajes en cultivo. Por lo tanto, es importante mantener un stock congelado de células Sf1Ep de paso bajo para su uso futuro. Las líneas de Sf1Ep inmortalizadas surgen ocasionalmente durante el cultivo a largo plazo de células Sf1Ep. (observaciones inéditas). Estas líneas a menudo crecen más rápido y son más fáciles de manejar; sin embargo, a veces, pierden la capacidad de soportar el crecimiento de T. pallidum . Las líneas Sf1Ep inmortalizadas se pueden usar y luego reemplazar cuando las espiroquetas comienzan a crecer lentamente.
2. Paso de células Sf1Ep
NOTA: El crecimiento del cultivo de células Sf1Ep se monitorea con un microscopio invertido utilizando óptica de contraste de fase. Por lo general, las células tardan alrededor de una semana en alcanzar casi la confluencia. Cuando las células alcanzan ~90% de confluencia, pueden pasarse, utilizarse para el cultivo de T. pallidum o para la preparación de existencias congeladas. La vida del cultivo puede prolongarse a dos semanas mediante la sustitución de la mitad del medio de cultivo después de una semana de cultivo.
3. Cultivo de T. pallidum
PRECAUCIÓN: Todas las subespecies y cepas de T. pallidum son patógenas para los seres humanos y están clasificadas como patógenos de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2)34. Son necesarias medidas adecuadas para proteger al personal; estos incluyen el uso de guantes y otros equipos de protección personal (EPP), así como la desinfección de superficies, materiales y líquidos potencialmente expuestos a T. pallidum. T. pallidum se inactiva fácilmente mediante la exposición a etanol al 70% o a desinfectantes disponibles comercialmente. Se recomienda el uso constante de campanas de flujo laminar para el manejo de muestras que contengan T. pallidum .
NOTA: T. pallidum es un organismo microaerófilo que puede ser eliminado por unas pocas horas de exposición a los niveles atmosféricos de oxígeno 9,16,35. Por lo tanto, se recomienda que la manipulación de T. pallidum en el aire se limite a menos de una hora si es posible. Además, el medio TpCM-2 debe estar preequilibrado en 1.5% O2, 5% CO2, equilibrio N2 y se debe limitar la agitación vigorosa (por ejemplo, el uso de un vórtice). Debido a que el cultivo de T. pallidum generalmente se lleva a cabo en ausencia de antibióticos, se necesita cuidado adicional para evitar la contaminación con bacterias u hongos. El procedimiento de Sf1Ep-TpCM-2 para el cultivo de T. pallidum se resume en la Figura 1 e implica múltiples pasos, incluida la siembra de los recipientes de cultivo con células Sf1Ep, la preparación del medio TpCM-2 y la inoculación de los cultivos con T. pallidum. El suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor es un componente crítico del medio, y su eficacia varía según los diferentes proveedores y lotes19. Es necesario el precribado de la eficacia de los lotes de FBS.
4. Cosecha y paso de cultivos de T. pallidum
NOTA: Debido a que la mayoría de T. pallidum en cultivo está adherida a la superficie de las células Sf1Ep, es necesario disociar los treponemas de las células de mamíferos para recuperarlos y obtener un recuento preciso de los organismos. Dicha "cosecha" y paso a cultivos frescos se realiza típicamente el día 7 de cultivo. El procedimiento descrito aquí es para placas de 6 pocillos; la cantidad de solución de tripsina-EDTA utilizada se ajusta hacia arriba o hacia abajo dependiendo del tamaño del formato de cultivo 17,19,27.
5. Congelación y almacenamiento de cultivos de T. pallidum
NOTA: T. pallidum puede almacenarse indefinidamente a -70 °C o menos, con una viabilidad tras la descongelación que suele ser del 50% al 90%.
6. Generación de clones isogénicos de T. pallidum
NOTA: Este procedimiento se describe en detalle en un estudio previo27.
Usando las condiciones descritas, T. pallidum típicamente retiene >90% de motilidad y se multiplica logarítmicamente con un tiempo de duplicación de 33 h a 45 h durante aproximadamente 7 días antes de entrar en la fase estacionaria (Figura 3). En el transcurso de 1 semana, las espiroquetas se someten a aproximadamente 4-5 duplicaciones (Figura 4). ). Además, las diferentes cepas de T. pallidum pueden crecer a diferentes ritmos. Las cepas del grupo SS14 de T. pallidum tienden a tener tiempos de duplicación más lentos que las del grupo Nichols17.
La alimentación de los cultivos puede prolongar el tiempo de cultivo varios días, pero la capa de células Sf1Ep a menudo falla después de una semana de cultivo. Además, los treponemas alcanzan un límite superior de organismos de aproximadamente 5 x 107/mL. Los cultivos transferidos a intervalos de 7 días generalmente continúan la multiplicación logarítmica con poca o ninguna fase de retraso. Los organismos en la fase estacionaria a menudo se vuelven difíciles de pasar.
La mayoría de los T. pallidum están unidos a las células Sf1Ep. Sin embargo, queda suficiente T. pallidum en el sobrenadante para que las muestras de medio puedan extraerse periódicamente para comprobar su viabilidad y multiplicación. Si se requiere una cuantificación cuidadosa, se debe medir el volumen del medio extraído, cuantificar el número de T. pallidum y agregar el número total de organismos extraídos a los recuentos finales en la cosecha.
En estudios previos, la eficiencia de clonación (número de cultivos positivos por organismo inoculado) fue de 12,5% para 2 T. pallidum inoculados por pocillo y de 6,7% para 0,5 T. pallidum inoculados por pocillo27. Por lo tanto, es probable que cualquier pozo positivo represente el crecimiento de un solo organismo en cualquiera de estos inóculos. Sin embargo, la clonalidad de las poblaciones resultantes debe verificarse examinando la homogeneidad del cultivo en sitios que son heterogéneos en el cultivo original. La forma más definitiva de demostrar que el cultivo es isogénico es a través de la secuenciación del genoma completo27.
Figura 1: Diagrama de flujo del procedimiento de cultivo in vitro de T. pallidum. Esta figura ha sido reimpresa con permiso de Edmondson y Norris (2021)19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama del sistema para equilibrar los reactivos de cultivo de T. pallidum en un entorno con poco oxígeno. Un respiradero de jarra de cerveza está conectado a través de una junta en T a una fuente de vacío (como una aspiradora doméstica) y a cilindros de gas que contienen mezclas de gases personalizadas (5% de CO2, nitrógeno de equilibrio y 1,5% de O2, 5% de CO2, nitrógeno de equilibrio). Un vacuómetro en línea mide el vacío aspirado en el tarro. El vacío se extrae en el frasco a aproximadamente -58 kPa. A continuación, el frasco evacuado se vuelve a llenar lentamente con las mezclas de gases. El frasco de cerveza se rellena tres veces con 5% de CO2, equilibra el nitrógeno antes de una evacuación final y se rellena con 95% de N2, 5% de CO2, 1,5% de O2. A continuación, los cultivos o medios se retiran del frasco y se transfieren rápidamente a la incubadora de bajo oxígeno. Alternativamente, el tubo entre el frasco de cerveza y la primera junta en T se puede sujetar firmemente, el tubo se puede desconectar de la junta en T y todo el frasco de cerveza se puede transferir a una incubadora a 34 °C. Esta figura ha sido reimpresa con permiso de Edmondson y Norris (2021)19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Curvas de crecimiento de T. pallidum cultivado con células Sf1Ep con medio TpCM-2. Se sembraron cultivos triplicados paralelos con T. pallidum. Se cosecharon réplicas en cada punto de tiempo; los resultados representan la media + SEM para estos cultivos. (A) Se muestran los cambios en T. pallidum por cultivo y (B) por ciento de motilidad. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Edmondson et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de paso de cultivo in vitro de T. pallidum, cepa de Nichols. Los cultivos triplicados paralelos se sembraron con T. pallidum y se pasaron semanalmente utilizando una dilución 1:20. El diagrama de dientes de sierra muestra el número de T. pallidum por cultivo y el número transferido a nuevos cultivos en cada punto de tiempo. Los resultados representan la media ± SEM para tres réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Volumen medio y proporciones de siembra para recipientes de cultivo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Medios para el cultivo de T. pallidum . Todos los medios deben esterilizarse con filtro después de la preparación. El medio Sf1Ep puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de dos meses. Por lo general, TpCM-2 se prepara un día antes de su uso. El medio de disociación debe ser alícuota y congelado. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
El sistema Sf1Ep-TpCM-2 es el primer procedimiento disponible que promueve el cultivo continuo in vitro de T. pallidum. El sistema es complejo debido a los requisitos extremos de crecimiento de este organismo: 1) necesidades nutricionales complejas debido a las capacidades biosintéticas limitadas; 2) un requerimiento mal entendido de pequeñas cantidades de oxígeno, a pesar de la alta sensibilidad a las especies reactivas de oxígeno 9,10,16,36; y 3) la necesidad actual de la presencia de células Sf1Ep. Si bien es tentador "tomar atajos" en el procedimiento, se recomienda que los pasos se sigan cuidadosamente hasta que se logre una cultura exitosa a largo plazo antes de intentar modificaciones. A medida que se acumula información adicional sobre los requisitos metabólicos de T. pallidum, puede ser posible desarrollar condiciones axénicas que no requieran la presencia de células Sf1Ep. Sin embargo, es probable que la tasa de crecimiento in vitro siga siendo lenta (con un tiempo mínimo de duplicación de 33 h a 46 h, dependiendo de la cepa)17,18, dado que T. pallidum se multiplica a un tiempo de duplicación estimado de 30 h a 33 h incluso durante la infección en mamíferos37,38. Al igual que con cualquier cultivo bacteriano, se recomienda que se mantengan las existencias de paso bajas y que se lleven a cabo experimentos con cultivos de T. pallidum que estén a menos de 10 pasos de estas existencias para evitar la "deriva genética" y los cambios fenotípicos asociados debido a las mutaciones.
Las células Sf1Ep aparentemente proporcionan nutrientes esenciales o actividades enzimáticas a los treponemas. Sin embargo, también consumen nutrientes (como glucosa y oxígeno) y pueden producir condiciones tóxicas como pH bajo 9,16,39. Por lo tanto, existe un acto de equilibrio entre tener suficientes células Sf1Ep para apoyar la multiplicación de T. pallidum y prevenir el sobrecrecimiento y la toxicidad de las células de mamíferos. Los números altos de paso de las células Sf1Ep tienden a crecer más rápido y, a veces, pierden la capacidad de apoyar la multiplicación de T. pallidum. Como tal, se debe monitorear el número de paso de Sf1Ep y las existencias de celdas deben reemplazarse periódicamente con preparaciones congeladas de paso bajo. La presencia de células Sf1Ep también complica el estudio de las propiedades de T. pallidum, como el contenido de ADN, ARN y proteínas, y las actividades enzimáticas. La eliminación de las células de conejo es posible hasta cierto punto utilizando centrifugación repetida a baja velocidad (100 x g durante 5 min) o, más eficazmente, utilizando gradientes de Percoll o Hypaque40,41. Sin embargo, los métodos de centrifugación en gradiente generalmente solo son efectivos con un alto número de T. pallidum. Los métodos alternativos para propagar T. pallidum se limitan a la infección de animales de laboratorio como los conejos13,14. Este enfoque tiene consideraciones éticas y se ha vuelto cada vez más costoso; sin embargo, el modelo de conejo es muy útil para estudiar la patogénesis de T. pallidum y las respuestas inmunitarias del huésped. Además, es probable que existan algunas diferencias en la expresión génica, el crecimiento o el comportamiento de T. pallidum durante el cultivo in vitro y la infección en conejo27.
En el momento de este informe, el sistema Sf1Ep-TpCM-2 se ha establecido en al menos 6 grupos de investigación en los Estados Unidos y Europa y ha dado lugar a 16 publicaciones con temas que van desde la biología básica y la genética de T. pallidum hasta la susceptibilidad a los antimicrobianos. Es probable que el valor del cultivo in vitro en el estudio de este enigmático patógeno aumente con la expansión del uso y las mejoras futuras.
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Este trabajo fue apoyado por la subvención R01 AI141958 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos/NIAID. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E8008 | |
10x Earle’s Balanced Salts, w/o Mg2+, Ca2+ | Gibco | 14155063 | |
15 and 50 mL conical sterile disposable centrifuge tubes | N/A | N/A | |
2 mL cryogenic vials | Corning | 430659 | |
6-well cell culture plates for T. pallidum cultivation | Falcon | 353046 | The plates must have low evaporation lids. |
70% ethanol | N/A | N/A | |
75 cm2 tissue culture flasks with vented caps | Corning | 43061U | |
93.5% nitrogen, 5% CO2, and 1.5% oxygen for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
95% nitrogen and 5% CO2 for pre-equilibrating medium and cultures | N/A | N/A | |
96-well low evaporation clear, flat-bottom tissue culture-treated microplates | Corning Falcon | 353072 | |
Adjustable multi-channel pipette with 200 ul capacity | N/A | N/A | Optional, but very helpful for cloning |
Cell culture grade water | Sigma | W3500 | |
CMRL 1066 without L-Glutamine or Phenol Red | US Biological | C5900-03A | |
CO2 for tri-gas and tissue culture incubators | N/A | N/A | |
Cryogenic liquid nitrogen cell culture storage tank | N/A | N/A | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
Disposable filter units, 0.2 µm , > 100 mL capacity | N/A | N/A | |
Disposable pipets: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspirating | N/A | N/A | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M1902 | |
DMSO (sterile cell culture grade ) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Eagle’s MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
Fetal bovine serum, heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | We highly recommend this product. Must pre-screen for T. pallidum culture compatibility if using a different brand or catalog number. |
Freezer with capability of maintaining -70 °C or -80 °C | N/A | N/A | For storage of T. pallidum; liquid nitrogen storage may be used instead |
Freezing medium (Sf1Ep medium + 10% [v/v] DMSO) | N/A | N/A | |
Gas cylinders with appropriate fittings | N/A | N/A | |
GasPak 150 vented anaerobic jar (Brewer Jar) | Fisher Scientific | 11-816 | |
Glycerol | N/A | N/A | |
Helber counting chambers with Thoma rulings | Hawksley Medical and Laboratory Equipment | For quantitating T. pallidum | |
Hemocytometer | N/A | N/A | For Sf1Ep cell quantitation |
Incubator tank switch | NuAire | NU-1550 TankGuard Automatic CO2 Incubator Tank Switch | Optional, but very helpful in maintaining appropriate O2 conditions. |
Inverted microscope with phase contrast optics | N/A | N/A | For viewing Sf1Ep cell cultures |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
Microscope with darkfield condensor | N/A | N/A | The microscope should have a 40x objective and 15x eyepieces. |
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
Multi-channel adapter for aspirator | Integra | 155520 | Optional, but useful for cloning |
NaHCO3 (7.5%) | Sigma-Aldrich | S8761 | |
Nitrogen for tri-gas incubator | N/A | N/A | |
Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Sf1Ep (NBL-11) cells | American Type Culture Collection | CCL-68 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Sterile PBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sterile reagent reservoirs, 50 or 100 mL size | N/A | N/A | |
T. pallidum sample, frozen or fresh | from a rabbit infection or in vitro culture | ||
Tissue culture incubator maintained at 37 °C, 5% CO2 | N/A | N/A | |
Tri-gas tissue culture incubator maintained at 34 °C, 5% CO2, 1.5% O2 | Thermofisher | Heracell™ VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator | Optional; anaerobic jars may be used instead (see Ref. 17) |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Vacuum source (e.g. house vacuum), vacuum tubing, vacuum gauge, and connectors | N/A | N/A | |
Water, suitable for cell culture, filter-sterilized, purified | Sigma-Aldrich | W3500 | Recommended for medium preparation; decreases culture variability |
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