توليد وتحليل صور الأنسجة عالية المعلمات باستخدام قياس التدفق الخلوي

Summary

الموصوفة هنا هي طريقة يمكن استخدامها لتصوير خمسة أو أكثر من المعلمات الفلورية بواسطة المجهر المناعي. تم تحديد خط أنابيب تحليل لاستخراج الخلايا المفردة من هذه الصور وإجراء تحليل الخلية الواحدة من خلال استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي ، والتي يمكنها تحديد مجموعات فرعية من الخلايا في أقسام الأنسجة.

Abstract

إن استخدام علم الأنسجة للتحقيق في تنوع الخلايا المناعية في أقسام الأنسجة مثل تلك المشتقة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) محدود للغاية بسبب عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد. تم تعريف معظم المجموعات الفرعية للخلايا المناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي باستخدام مجموعات معقدة من علامات البروتين ، وغالبا ما تتطلب أربعة معلمات أو أكثر لتحديدها بشكل قاطع ، وهو ما يتجاوز قدرات معظم المجاهر التقليدية. نظرا لأن قياس التدفق الخلوي يفصل الأنسجة ويفقد المعلومات المكانية ، فهناك حاجة إلى تقنيات يمكنها الاحتفاظ بالمعلومات المكانية أثناء استجواب أدوار أنواع الخلايا المعقدة. تتم معالجة هذه القضايا هنا من خلال إنشاء طريقة لتوسيع عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها عن طريق جمع إشارات الفلوروفورات المتداخلة طيفيا واستخدام عدم الخلط الطيفي لفصل إشارات كل فلوروفور على حدة. ثم تتم معالجة هذه الصور باستخدام خط أنابيب تحليل لالتقاط صور الأنسجة عالية المعلمات واستخراج خلايا مفردة من هذه الصور بحيث يمكن تحليل خصائص الفلورسنت الفريدة لكل خلية على مستوى خلية واحدة. باستخدام استراتيجيات البوابات الشبيهة بقياس التدفق الخلوي ، يمكن بعد ذلك تحديد ملامح الخلايا في مجموعات فرعية وتعيينها مرة أخرى على أقسام الأنسجة ليس فقط لتحديد وفرتها ، ولكن أيضا لتحديد كيفية تفاعلها مع بيئة الأنسجة. بشكل عام ، تم إثبات بساطة وإمكانية استخدام قياس التدفق الخلوي النسيجي لدراسة مجموعات المناعة المعقدة في أقسام الأنسجة.

Introduction

يمكن أن يساهم الالتهاب الناجم عن خلايا الجهاز المناعي والخلايا الدبقية في الاضطرابات المزمنة في الجهاز العصبي المركزي حيث يمكن لكل مجموعة تعزيز نشاط^1،2،3 الأخرى. إن فهم كيفية تفاعل الجهاز المناعي مع هذه العناصر من الجهاز العصبي المركزي لتعزيز التهاب الجهاز العصبي المركزي هو حاليا موضوع رئيسي للاهتمام وقد تم تسهيله إلى حد كبير من خلال التقنيات عالية المعلمات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، اكتشفنا أن هناك اتصالا مكثفا يحدث بين الخلايا الدبقية والجهاز المناعي في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي

Protocol

لا يغطي هذا البروتوكول تقسيم الأنسجة للأنسجة. يرجى الاطلاع على Jain et ^al.18 أو¹⁹ للحصول على أوصاف لكيفية تقسيم الأنسجة للأنسجة. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع أي مناديل مقسمة على شرائح زجاجية. تستخدم هذه المقالة الغدد الليمفاوية الأربية المعزولة من محصن كما هو موضح سابقا¹⁸. يتم تلخيص الإجراء والجدول الزمني لهذا البروتوكول في الشكل 1. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تلطيخ أقسام الأنسجة

ملاحظة: بالإضافة إلى تلطيخ الأنسجة بجميع ملصقات الأجسام....

النتائج

الشكل 1: سير عمل قياس التدفق الخلوي للنسيج. أقسام الأنسجة ملطخة بأصباغ متداخلة طيفيا (الخطوة 1). يتم جمع الصور عبر ليزر الإثارة الفردي المقترن بمرشحات تمرير النطاق القابلة للضبط لتقليل النزيف ال?.......

Discussion

هنا ، يتم وصف استخدام قياس التدفق الخلوي النسيجي ، وهي تقنية تم التحقق من صحتها سابقا¹⁸. ثبت أنه عند تلطيخ أقسام الأنسجة بأصباغ متداخلة طيفيا ، يمكن إزالة هذا النزيف عبر القنوات باستخدام التعويض الطيفي ، مما يؤدي إلى حل عدد أكبر من معلمات الفلورسنت بوضوح أكثر مما هو ممكن عادة م?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42