Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

Özet

Burada açıklanan, immünofloresan mikroskobu ile beş veya daha fazla floresan parametreyi görüntülemek için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu görüntülerden tek hücrelerin çıkarılması ve doku bölümlerindeki hücre alt kümelerini tanımlayabilen akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yoluyla tek hücre analizi yapmak için bir analiz boru hattı ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Özet

Merkezi sinir sisteminden (CNS) türetilenler gibi doku kesitlerinde bağışıklık hücresi çeşitliliğini araştırmak için histolojinin kullanımı, tek bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısı ile kritik bir şekilde sınırlıdır. Çoğu bağışıklık hücresi alt kümesi, protein belirteçlerinin karmaşık kombinasyonları kullanılarak akış sitometrisi kullanılarak tanımlanmıştır, bu genellikle kesin olarak tanımlamak için dört veya daha fazla parametre gerektirir, bu da çoğu geleneksel mikroskobun yeteneklerinin ötesindedir. Akış sitometrisi dokuları ayrıştırdığından ve uzamsal bilgiyi kaybettiğinden, karmaşık hücre tiplerinin rollerini sorgularken uzamsal bilgiyi koruyabilen tekniklere ihtiyaç vardır. Bu sorunlar burada, spektral olarak örtüşen floroforların sinyallerini toplayarak ve her bir ayrı floroforun sinyallerini ayırmak için spektral karıştırma kullanarak görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişletmek için bir yöntem oluşturularak ele alınmaktadır. Bu görüntüler daha sonra yüksek parametreli histoloji görüntüleri almak ve bu görüntülerden tek hücreleri çıkarmak için bir analiz hattı kullanılarak işlenir, böylece her hücrenin benzersiz floresan özellikleri tek hücre düzeyinde analiz edilebilir. Akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanılarak, hücreler daha sonra alt kümelere ayrılabilir ve yalnızca bolluklarını ölçmekle kalmayıp aynı zamanda doku ortamıyla nasıl etkileşime girdiklerini belirlemek için histoloji bölümlerine geri eşlenebilir. Genel olarak, histoloji bölümlerinde karmaşık immün popülasyonları incelemek için histoflow sitometri kullanmanın basitliği ve potansiyeli gösterilmiştir.

Giriş

Bağışıklık sistemi hücreleri ve glial hücreler tarafından yönlendirilen iltihaplanma, her bir popülasyonun diğer ^1,2,3'ün aktivitesini teşvik edebileceği CNS'nin kronik bozukluklarına katkıda bulunabilir. Bağışıklık sisteminin, CNS inflamasyonunu teşvik etmek için CNS'nin bu unsurları ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak şu anda önemli bir ilgi konusudur ve tek hücreli RNA dizilimi gibi yüksek parametreli tekniklerle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Tek hücreli RNA dizilimi sayesinde, çeşitli CNS bozukluklarında^glial hücreler ve bağışıklık sistemi a....

Protokol

Bu protokol histoloji için dokuların kesitini kapsamaz; histoloji için dokuların nasıl kesileceğine dair açıklamalar için lütfen Jain ve ^ark.18 veya^19'a bakınız. Bu protokol, cam slaytlar üzerindeki herhangi bir kesitli doku ile kullanılabilir. Bu makale, daha önce tarif edildiği gibi aşılanmış bir hayvandan izole edilen kasık lenf nodlarını kullanır¹⁸. Bu protokolün prosedürü ve zaman çizelgesi Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

....

Tartışmalar

Burada, daha önce doğrulanmış bir teknik olan histoflow sitometrisinin kullanımı açıklanmaktadır¹⁸. Doku kesitlerini spektral olarak örtüşen boyalarla boyarken, kanallar arasındaki kanamanın spektral kompanzasyon kullanılarak giderilebileceği ve bunun sonucunda normalde geleneksel yöntemlerle mümkün olandan daha fazla sayıda floresan parametresinin net bir şekilde çözüldüğü gösterilmiştir. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin geleneksel yöntemler kullanıla.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42