Gerando e analisando imagens histológicas de alto parâmetro com citometria de histofluxo

Resumo

Aqui está descrito um método que pode ser usado para obter imagens de cinco ou mais parâmetros fluorescentes por microscopia imunofluorescente. Um pipeline de análise para extrair células únicas dessas imagens e conduzir análises de células únicas por meio de estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo é delineado, o que pode identificar subconjuntos de células em seções de tecido.

Resumo

O uso da histologia para investigar a diversidade de células imunes em seções de tecido, como as derivadas do sistema nervoso central (SNC), é criticamente limitado pelo número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados de uma só vez. A maioria dos subconjuntos de células imunes foi definida usando citometria de fluxo usando combinações complexas de marcadores de proteínas, muitas vezes exigindo quatro ou mais parâmetros para serem identificados de forma conclusiva, o que está além das capacidades da maioria dos microscópios convencionais. Como a citometria de fluxo dissocia os tecidos e perde informações espaciais, há necessidade de técnicas que possam reter informações espaciais enquanto interrogam os papéis de tipos de células complexas. Essas questões são abordadas aqui criando um método para expandir o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados coletando os sinais de fluoróforos espectralmente sobrepostos e usando a separação espectral para separar os sinais de cada fluoróforo individual. Essas imagens são então processadas usando um pipeline de análise para obter imagens histológicas de alto parâmetro e extrair células únicas dessas imagens para que as propriedades fluorescentes exclusivas de cada célula possam ser analisadas em um nível de célula única. Usando estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo, as células podem ser perfiladas em subconjuntos e mapeadas de volta para as seções de histologia para não apenas quantificar sua abundância, mas também estabelecer como elas interagem com o ambiente do tecido. No geral, a simplicidade e o potencial do uso da citometria de histofluxo para estudar populações imunes complexas em seções de histologia são demonstradas.

Introdução

A inflamação impulsionada por células do sistema imunológico e células gliais pode contribuir para distúrbios crônicos do SNC, onde cada população pode promover a atividade da outra ^1,2,3. Compreender como o sistema imunológico interage com esses elementos do SNC para promover a inflamação do SNC é atualmente um grande tópico de interesse e tem sido muito facilitado por técnicas de alto parâmetro, como o sequenciamento de RNA de célula única. Por meio do sequenciamento de RNA de célula única, descobrimos que há uma extensa comunicação ocorrendo entre as células gliais e o sis....

Protocolo

Este protocolo não cobre a secção de tecidos para histologia; consulte Jain et ^al.18 ou¹⁹ para obter descrições de como seccionar tecidos para histologia. Este protocolo pode ser usado com qualquer tecido seccionado em lâminas de vidro. Este artigo utiliza linfonodos inguinais isolados de um animal imunizado, conforme descrito anteriormente¹⁸. O procedimento e o cronograma para este protocolo estão resumidos na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

Discussão

Descreve-se aqui o uso da citometria de histofluxo, técnica validada anteriormente¹⁸. Está demonstrado que, ao corar seções de tecido com corantes espectralmente sobrepostos, esse sangramento através dos canais pode ser removido usando compensação espectral, resultando em um número maior de parâmetros fluorescentes sendo claramente resolvidos do que normalmente seria possível através de métodos convencionais. Como as imagens histológicas de alto parâmetro são difíceis de analisar u.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42