Generación y análisis de imágenes histológicas de alto parámetro con citometría de histoflujo

Resumen

Aquí se describe un método que se puede utilizar para obtener imágenes de cinco o más parámetros fluorescentes mediante microscopía inmunofluorescente. Se describe una línea de análisis para extraer células individuales de estas imágenes y realizar análisis de células individuales a través de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, que pueden identificar subconjuntos de células en secciones de tejido.

Resumen

El uso de la histología para investigar la diversidad de células inmunitarias en secciones de tejido, como las derivadas del sistema nervioso central (SNC), está críticamente limitado por el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez. La mayoría de los subconjuntos de células inmunitarias se han definido mediante citometría de flujo mediante el uso de combinaciones complejas de marcadores de proteínas, que a menudo requieren cuatro o más parámetros para identificarlos de manera concluyente, lo que está más allá de las capacidades de la mayoría de los microscopios convencionales. A medida que la citometría de flujo disocia los tejidos y pierde información espacial, existe la necesidad de técnicas que puedan retener la información espacial mientras interrogan las funciones de los tipos de células complejas. Estos problemas se abordan aquí mediante la creación de un método para ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden visualizar mediante la recopilación de las señales de fluoróforos superpuestos espectralmente y el uso de la desmezcla espectral para separar las señales de cada fluoróforo individual. A continuación, estas imágenes se procesan mediante una canalización de análisis para tomar imágenes histológicas de alto parámetro y extraer células individuales de estas imágenes para que las propiedades fluorescentes únicas de cada célula se puedan analizar a nivel de una sola célula. Mediante el uso de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, las células se pueden perfilar en subconjuntos y mapear de nuevo en las secciones de histología no solo para cuantificar su abundancia, sino también para establecer cómo interactúan con el entorno tisular. En general, se demuestra la simplicidad y el potencial del uso de la citometría de histoflujo para estudiar poblaciones inmunitarias complejas en secciones de histología.

Introducción

La inflamación impulsada por las células del sistema inmunitario y las células gliales puede contribuir a trastornos crónicos del SNC en los que cada población puede promover la actividad de la otra ^1,2,3. La comprensión de cómo el sistema inmunitario interactúa con estos elementos del SNC para promover la inflamación del SNC es actualmente un tema de interés importante y se ha visto facilitado en gran medida por técnicas de alto parámetro, como la secuenciación de ARN unicelular. A través de la secuenciación de ARN unicelular, hemos descubierto que existe una amplia comunica....

Protocolo

Este protocolo no cubre la sección de tejidos para histología; consulte Jain et ^al.18 o¹⁹ para obtener descripciones de cómo seccionar tejidos para histología. Este protocolo se puede utilizar con cualquier tejido seccionado en portaobjetos de vidrio. En este artículo se utilizan ganglios linfáticos inguinales aislados de un animal inmunizado, tal como se describió anteriormente¹⁸. El procedimiento y el cronograma de este protocolo se resumen en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Material....

Discusión

Aquí se describe el uso de la citometría de histoflujo, técnica que ha sido validada previamente¹⁸. Se demuestra que cuando se tiñen secciones de tejido con colorantes superpuestos espectralmente, ese sangrado a través de los canales se puede eliminar mediante compensación espectral, lo que da como resultado un mayor número de parámetros fluorescentes que se resuelven claramente de lo que normalmente sería posible con métodos convencionales. Dado que las imágenes histológicas de alto p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42