הפקה וניתוח של תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים באמצעות ציטומטריה של Histoflow

Summary

המתוארת כאן היא שיטה שניתן להשתמש בה כדי לצלם חמישה פרמטרים פלואורסצנטיים או יותר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent. מתואר צינור ניתוח לחילוץ תאים בודדים מתמונות אלה ולביצוע אנליזה של תא בודד באמצעות אסטרטגיות gating דמויות ציטומטריה של זרימה, אשר יכולות לזהות תת-קבוצות תאים במקטעי רקמות.

Abstract

השימוש בהיסטולוגיה כדי לחקור את מגוון תאי החיסון בחלקי רקמות, כגון אלה הנגזרים ממערכת העצבים המרכזית (CNS), מוגבל באופן קריטי על ידי מספר הפרמטרים הפלואורסצנטיים שניתן לצלם בו זמנית. רוב תת-הקבוצות של תאי מערכת החיסון הוגדרו באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות שילובים מורכבים של סמני חלבון, שלעתים קרובות דורשים ארבעה פרמטרים או יותר כדי לזהות באופן חד-משמעי, וזה מעבר ליכולות של רוב המיקרוסקופים הקונבנציונליים. כאשר ציטומטריית זרימה מנתקת רקמות ומאבדת מידע מרחבי, יש צורך בטכניקות שיכולות לשמור מידע מרחבי תוך חקירת תפקידיהם של סוגי תאים מורכבים. בעיות אלה מטופלות כאן על ידי יצירת שיטה להרחבת מספר הפרמטרים הפלואורסצנטיים שניתן לצלם על ידי איסוף האותות של פלואורופורים חופפים ספקטרלית ושימוש בפירוק ספקטרלי כדי להפריד את האותות של כל פלואורופור בודד. תמונות אלה מעובדות לאחר מכן באמצעות צינור ניתוח כדי לצלם תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים ולחלץ תאים בודדים מתמונות אלה, כך שניתן יהיה לנתח את התכונות הפלואורסצנטיות הייחודיות של כל תא ברמת תא יחיד. באמצעות שימוש באסטרטגיות gating דמויות ציטומטריית זרימה, ניתן ליצור פרופיל של תאים לתת-קבוצות ולמפות אותם בחזרה לקטעי ההיסטולוגיה כדי לא רק לכמת את השפע שלהם, אלא גם לקבוע כיצד הם מתקשרים עם סביבת הרקמה. בסך הכל, הודגמה הפשטות והפוטנציאל של שימוש בציטומטריה של היסטופלואו לחקר אוכלוסיות חיסוניות מורכבות במדורי היסטולוגיה.

Introduction

דלקת המונעת על ידי תאים של מערכת החיסון ותאי גלייה יכולה לתרום להפרעות כרוניות של מערכת העצבים המרכזית, כאשר כל אוכלוסייה יכולה לקדם את הפעילות של ^1,2,3 האחרים. הבנת האופן שבו מערכת החיסון מתקשרת עם אלמנטים אלה של מערכת העצבים המרכזית כדי לקדם דלקת במערכת העצבים המרכזית היא כיום נושא מרכזי של עניין, וזה כבר הקל מאוד על ידי טכניקות פרמטרים גבוהים כגון ריצוף RNA תא יחיד. באמצעות ריצוף RNA חד-תאי, גילינו כי קיימת תקשורת נרחבת בין תאי גלייה לבין מערכת החיסון במספר הפרעות במערכת העצבים המרכזית ^4,5,6

Protocol

פרוטוקול זה אינו מכסה חיתוך רקמות להיסטולוגיה; אנא ראה Jain et ^al.18 או¹⁹ לתיאורים כיצד לחתוך רקמות להיסטולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש עם כל רקמות חתך על שקופיות זכוכית. מאמר זה משתמש בבלוטות לימפה מפשעתיות שבודדו מבעל חיים מחוסן כפי שתואר קודם לכן¹⁸. ההליך וציר הזמן עבור פרוטוקול זה מסוכמים באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. צביעת קטעי רקמות

הערה: בנוסף להכתמת רקמות עם כל תוויות הנוגדנים שהחוקר מעוניין בהן, על החוקר להכין גם פקדי צבע בודדים (אח....

תוצאות

איור 1: זרימת עבודה של ציטומטריה של Histoflow. חלקי הרקמה מוכתמים בצבעים חופפים ספקטרלית (שלב 1). התמונות נאספות בלייזרים נפרדים של עירור בשילוב עם מסנני פסים מתכווננים כדי למזער את הדימום הספקטרלי ב?.......

Discussion

כאן מתואר השימוש בציטומטריה של היסטופלו, טכניקה שאומתה בעבר¹⁸. הוכח כי בעת צביעת קטעי רקמה בצבעים חופפים ספקטרלית, ניתן להסיר את הדימום דרך ערוצים באמצעות פיצוי ספקטרלי, וכתוצאה מכך מספר רב יותר של פרמטרים פלואורסצנטיים נפתרים בבירור מאשר בדרך כלל מתאפשר בשיטות קונבנציונליות.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentration
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentration
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentration
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentration
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentration
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42