Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول الإجراءات المستخدمة لدراسة وتوصيف الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية ، وخاصة β-1،3-glucanase و peroxidase ، في نباتات القمح. تزداد مستويات نشاطها أثناء تفاعل القمح و RWA وتشارك في استجابة دفاع النبات من خلال تعزيز جدار الخلية ، مما يردع تغذية المن.

Abstract

تحفز نباتات القمح الموبوءة بحشرات من القمح الروسي (RWA) سلسلة من الاستجابات الدفاعية ، بما في ذلك الاستجابات شديدة الحساسية (HR) وتحريض البروتينات المرتبطة بالإمراض (PR) ، مثل β-1،3-glucanase و peroxidase (POD). تهدف هذه الدراسة إلى توصيف الخواص الفيزيائية والكيميائية لجدار الخلية المرتبطة ب POD و β-1،3-glucanase وتحديد تآزرها على تعديل جدار الخلية أثناء تفاعل RWASA2-wheat. تم إنبات أصناف Tugela-Dn1 الحساسة ، و Tugela-Dn1 المقاومة بشكل معتدل ، وأصناف Tugela-Dn5 المقاومة مسبقا وزرعها في ظروف الدفيئة ، وتم تخصيبها بعد 14 يوما من الزراعة ، وتم ريها كل 3 أيام. كانت النباتات موبوءة ب 20 فردا بارثينوجينيا من نفس استنساخ RWASA2 في مرحلة 3 أوراق ، وتم حصاد الأوراق في 1 إلى 14 يوما بعد الإصابة. تم استخراج سائل الغسيل بين الخلايا (IWF) باستخدام الترشيح الفراغي وتخزينه عند -20 درجة مئوية. تم سحق بقايا الأوراق إلى مسحوق واستخدامها لمكونات جدار الخلية. تم تحديد نشاط وتوصيف POD باستخدام ركيزة 5 mM guaiacol و H2O2 ، ومراقبة التغير في الامتصاص عند 470 نانومتر. تم إثبات نشاط β-1،3-glucanase ودرجة الحموضة والظروف المثلى لدرجة الحرارة من خلال قياس إجمالي السكريات المختزلة في التحلل المائي باستخدام كاشف DNS باستخدام ركائز β-1،3-glucan و β-1،3-1،4-glucan ، وقياس الامتصاص عند 540 نانومتر ، واستخدام منحنى الجلوكوز القياسي. تم تحديد الأس الهيدروجيني الأمثل بين الرقم الهيدروجيني 4 إلى 9 ، ودرجة الحرارة المثلى بين 25 و 50 درجة مئوية ، والاستقرار الحراري بين 30 درجة مئوية و 70 درجة مئوية. تم تحديد خصوصية ركيزة β-1،3-glucanase عند 25 درجة مئوية و 40 درجة مئوية باستخدام ركائز curdlan و barley β-1،3-1،4-glucan. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد طريقة عمل β-1،3-glucanase باستخدام laminaribiose إلى laminaripentaose. تم تحليل أنماط منتجات التحلل المائي قليل السكاريد نوعيا باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) وتحليلها كميا باستخدام HPLC. توضح الطريقة المقدمة في هذه الدراسة نهجا قويا لغزو القمح ب RWA ، واستخراج البيروكسيديز و β-1،3-glucanase من منطقة جدار الخلية وتوصيفها الكيميائي الحيوي الشامل.

Introduction

تصيب حشرات من القمح الروسي (RWA) القمح والشعير ، مما يتسبب في خسارة كبيرة في المحصول أو انخفاض جودة الحبوب. يستجيب القمح للإصابة عن طريق إحداث العديد من الاستجابات الدفاعية ، بما في ذلك زيادة مستويات نشاط β-1،3-glucanase و peroxidase في الأصناف المقاومة ، بينما تقلل الأصناف الحساسة من نشاط هذه الإنزيمات في فترة الإصابة المبكرة1،2،3،4. تضمنت الوظائف الرئيسية ل β-1،3-glucanase و POD في نبات القمح تنظيم تراكم الكالوز في الصنف المقاوم وتبريد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في جدار الخلية والمناطق الأوسترية أثناء الإصابة ب RWA1،3،5،6،7. أظهر Mafa et al.6 أن هناك علاقة قوية بين زيادة نشاط POD وزيادة محتوى اللجنين في صنف القمح المقاوم عند الإصابة ب RWASA2. بالإضافة إلى ذلك ، تشير زيادة محتوى اللجنين إلى تعزيز الجدار الخلوي لصنف القمح المقاوم المصاب ، مما أدى إلى انخفاض تغذية RWA.

قامت معظم مجموعات الباحثين باستخراج ودراسة apoplastic β-1،3-glucanase و POD أثناء تفاعل القمح / الشعير - RWA. بالإضافة إلى ذلك ، ادعت معظم هذه الدراسات أن هذه الإنزيمات تؤثر على جدار الخلية في نبات القمح المصاب ب RWA دون قياس وجود الإنزيم في منطقة جدار الخلية. استخدمت دراسات قليلة فقط التقنيات المجهرية لإظهار أن مستويات نشاط β-1،3-glucanase كانت مرتبطة بتنظيم الكالوز7،8،9 أو استخرجت مكونات جدار الخلية الرئيسية لإثبات العلاقة بين أنشطة POD وتعديل جدار الخلية في المقاومة6،10. يشير عدم فحص ارتباط β-1،3-glucanase و POD بجدار الخلية إلى الحاجة إلى تطوير طرق تسمح للباحثين بقياس الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية مباشرة.

تقترح الطريقة الحالية أن إزالة السائل الأوسلجي من أنسجة الأوراق قبل استخراج الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية أمر ضروري. يجب إجراء عملية استخراج السائل apoplastic مرتين من أنسجة الأوراق ، والتي تستخدم لاستخراج الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية. تقلل هذه العملية من تلوث وارتباك الإنزيمات apoplastic مع تلك الموجودة في مناطق جدار الخلية. وهكذا ، في هذه الدراسة ، استخلصنا POD المرتبط بجدار الخلية ، β-1،3-glucanase ، و MLG الخاص ب β-glucanase وأجرينا توصيفها الكيميائي الحيوي.

Protocol

أجريت الدراسة بموافقة وإذن من لجنة أخلاقيات البحوث البيئية والسلامة البيولوجية بجامعة فري ستيت (UFS-ESD2022/0131/22). تفاصيل الكواشف والمعدات هنا مذكورة في جدول المواد.

1. ظروف نمو النبات

  1. تنبت 250 بذرة من كل صنف قمح ، أي توجيلا حساسة ، وتوجيلا-Dn1 مقاومة بشكل معتدل ، وتوجيلا-Dn5 مقاومة ، في أطباق بتري منفصلة.
  2. أضف 5 مل من الماء المقطر في كل طبق بتري ، وأغلقه بغشاء بارافين ، واحتضانه في غرفة الإنبات عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.
  3. زرع البذور النابتة لكل صنف في أواني 15 سم تحتوي على 1: 1 تربة وطحلب (15 نبتة لكل وعاء) في ظل ظروف الدفيئة الخاضعة للرقابة.
  4. اضبط أنظمة درجة الحرارة على 18 درجة مئوية و 24 درجة مئوية أثناء الليل والنهار على التوالي.
  5. ري النباتات كل 3 أيام باستخدام ماء الصنبور وتزويدها ب 2 جم / لتر سماد بعد 14 يوما من الإنبات.
  6. ضع النباتات في أقفاص مغطاة بالشباك واتركها تنمو إلى مرحلة الورقة الثالثة 2,6 (مع أربع نسخ بيولوجية لكل صنف).

2. إصابة أصناف القمح ب RWASA2

  1. تصيب أصناف القمح Tugela و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn5 مع RWASA2 وفقا ل Jimoh et al.11 و Mohase و Taiwe12.
  2. الحفاظ على النباتات في مجموعتين منفصلتين في أقفاص. قم بغزو مجموعة واحدة مع 20 فردا بارثينوجينيا من نفس استنساخ RWASA2 لكل نبات في كل وعاء في غرف النمو المغطاة بالشباك. احتفظ بمجموعة أخرى من نباتات القمح في غرفة منفصلة أسفل غرفة النمو بشبكات نظيفة وعاملها كعناصر تحكم.
    ملاحظة: احتفظ بالعلاجين في غرف منفصلة وقم بتغطية النباتات في أقفاص مغطاة بالشباك. أيضا ، في حالة استخدام نمطين حيويين مختلفين من RWA في دراسة ، احتفظ بالنباتات الموبوءة بنمط حيوي واحد من RWA من تلك المصابة بالنمط الحيوي الثاني قدر الإمكان أو في غرف منفصلة تحت غرف النمو المغطاة بشبكات لتجنب أي تلوث متبادل محتمل ل RWASA2.
  3. للحصاد ، حدد الأوراق الثانية والثالثة في نظامين زمنيين مختلفين ، فترة تغذية قصيرة الأجل (1 و 2 و 3 أيام) وفترة تغذية طويلة الأجل (7 و 14 يوما) ، ولفها في مناشف ورقية رطبة.
  4. انقل الأوراق المحصودة على الفور إلى صندوق يحتوي على ثلج لتقليل استقلاب الأوراق قبل استخراج سائل الغسيل بين الخلايا (IWF).

3. استخراج سائل الغسيل بين الخلايا (IWF) من apoplast

  1. قطع الأوراق المحصودة من حوالي ثلاثة أصناف من القمح إلى قطع 7 سم.
  2. اشطف قطع الأوراق مرتين في الماء المقطر لإزالة أي تلوث خلوي من الأطراف المقطوعة 6,13.
  3. أدخل قطع الأوراق في أنبوب زجاجي سميك الجدران واغمر العينات في محلول الاستخراج (50 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.8).
  4. ضع تسلل الفراغ لمدة 5 دقائق باستخدام مضخة نفاثة مائية لتشريب الأوراق بمحلول الاستخراج.
  5. بعد ذلك ، قم بإزالة قطع الأوراق من الأنبوب الزجاجي وجففها بمنشفة ورقية.
  6. أدخل قطع الأوراق المجففة عموديا في أنابيب الطرد المركزي المبردة مسبقا المزودة بأقراص مثقبة وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. استخدم ماصة 100 ميكرولتر لتجميع المادة الطافية في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل مبردة مسبقا.
  8. كرر إجراء الاستخراج بالكامل بنفس مادة الورقة.
  9. الجمع بين طاف جمعها وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم التعامل مع الحصص الطافية كمصدر لمحتوى apoplast أو IWF. لم يتم استخدام IWF في الدراسة الحالية ، ولكن كان من المهم إزالته من أنسجة الأوراق قبل أن نستخرج جدار الخلية المرتبط بجدار الخلية β-1،3-glucanase و Peroxidase (POD).

4. استخراج جدار الخلية المرتبطة β-1،3-الجلوكاناز و POD

ملاحظة: تم استخدام بقايا الأوراق المتبقية بعد استخراج IWF لاستخراج بروتين جدار الخلية الكلي.

  1. سحق بقايا الأوراق إلى مسحوق ناعم مع النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة.
  2. نقل ما يقرب من 200 ملغ من أنسجة الأوراق المسحوقة إلى ملاط يحتوي على 4 مل من محلول الاستخراج (50 مللي متر فوسفات الصوديوم مع 1٪ (وزن / حجم) بولي فينيل بولي بيروليدون (PVPP) ؛ درجة الحموضة 5.0) متبوعا بالطحن بمدقة إلى عجينة ناعمة ، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
  3. احتضان الخليط في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمدة 3 دقائق على الجليد ثم جهاز الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. اجمع المادة الطافية (مستخلصات البروتين الكلية) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (حصص 2 مل) واستخدمها كمصدر ل β-1،3-glucanase و POD للدراسة بأكملها.

5. تحديد معيار البروتين

  1. حدد تركيز البروتين الكلي للمستخلصات باتباع طريقة برادفورد14.
  2. تحضير محاليل ألبومين مصل الأبقار (BSA) بتركيزات 0.0 مجم / مل ، 0.1 مجم / مل ، 0.2 مجم / مل ، 0.3 مجم / مل ، 0.4 مجم / مل ، 0.5 مجم / مل ، 0.6 مجم / مل ، 0.7 مجم / مل ، 0.8 مجم / مل ، 0.9 مجم / مل و 1.0 مجم / مل مذاب في 50 ملي مول فوسفات الصوديوم المخزن المؤقت لتوليد معيار البروتين.
  3. قم بإعداد المعيار عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كل محلول BSA إلى الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا مع 190 ميكرولتر (0.25٪ v / v) من كاشف برادفورد (انظر جدول المواد).
  4. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وقياس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة واستخدم قيم الامتصاص لإعداد المنحنى القياسي لقياس تركيز البروتين.
  5. تحديد تركيز البروتين
    1. أضف 10 ميكرولتر من الإنزيم المستخرج (الخطوة 4) إلى صفيحة مجهرية ذات 96 بئرا مع 190 ميكرولتر (0.25٪ v / v) من كاشف برادفورد في ثلاث نسخ.
    2. احتضان في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    3. قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي مع قارئ الصفيحة الدقيقة واستخدم قيم الامتصاص لتحديد تركيز البروتين باستخدام BSA كمعيار للبروتين (تم إعداده في الخطوة 5.4).

6. إعداد معيار الجلوكوز لنشاط β-1،3-الجلوكاناز

  1. تحضير المحاليل القياسية بتركيزات تتراوح بين 0.00 مجم / مل و 1.0 مجم / مل (0.0 مجم / مل ، 0.1 مجم / مل ، 0.2 مجم / مل ، 0.3 مجم / مل ، 0.4 مجم / مل ، 0.5 مجم / مل ، 0.6 مجم / مل ، 0.7 مجم / مل ، 0.8 مجم / مل ، 0.9 مجم / مل ، 1.0 مجم / مل) مع الجلوكوز المذاب في الماء المقطر.
  2. أضف 300 ميكرولتر من كل محلول جلوكوز و 600 ميكرولتر من كاشف حمض 3,5-Dinitrosalicylic (DNS) بنسبة 1: 2 إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة 1.5 مل واحتضان التفاعلات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (انظر جدول المواد لكواشف DNS) (Miller et al.15).
  3. اترك الخليط يبرد في درجة حرارة الغرفة قبل قياس الامتصاص عند 540 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  4. استخدم متوسط قيم الامتصاص لتطوير المنحنى القياسي لتحديد نشاط إنزيم β-1،3-glucanase.

7. تحديد مقايسة نشاط β-1،3-جلوكاناز

ملاحظة: تم تحديد نشاط الإنزيم لركائز β-1،3-glucanase المرتبطة بجدار الخلية المستخرجة من Tugela و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn5 من خلال كمية السكريات المختزلة الكلية المنبعثة من التحلل المائي بنسبة 0.5٪ (وزن / حجم) مختلطة مرتبطة β-1،3-1،4-جلوكان (MLG) و 0.4٪ (وزن / حجم) ركائز β-1،3-جلوكان باستخدام طريقة معدلة كما وصفها Miller et al.15. احتفظ دائما بالأنابيب التي تحتوي على قسمة البروتين على الجليد. إذا تم تجميد العينات ، قم بإذابتها على الجليد واستمر فورا بعد الذوبان.

  1. أضف 200 ميكرولتر من مستخلص الإنزيم (حافظ على تركيز البروتين بين 20 ميكروغرام / مل إلى 90 ميكروغرام / مل في جميع التفاعلات ، ما لم ينص على خلاف ذلك) و 300 ميكرولتر من الركيزة المذابة في 50 مللي متر عازلة سترات الصوديوم (درجة الحموضة 5.0) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
    ملاحظة: قم بتشغيل تفاعل فارغ متوازي بدون مستخلص الإنزيم لجميع الركائز (الفراغ الأول) ، ويتكون الإنزيم الفارغ من مستخلص الإنزيم بدون ركيزة (الفراغ الثاني). تم استبدال كل من الركيزة ومستخلص الإنزيم بالمخزن المؤقت في السود الأول والثاني ، على التوالي.
  2. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة وإنهاء التفاعل عن طريق التسخين عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. امزج 300 ميكرولتر من المادة الطافية مع كاشف DNS 600 ميكرولتر (نسبة 1: 2) في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 مل واغليها عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. اترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وقم بقياس الامتصاص عند 540 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    ملاحظة: إذا كان تركيز السكريات المختزلة الكلية مرتفعا في الخليط ، فسيؤدي ذلك إلى محلول بني داكن ، يصعب قراءته باستخدام مقياس الطيف الضوئي. لذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التخفيف للعينات قبل قراءة الامتصاص.
  5. استخدم منحنى الجلوكوز القياسي الموضح في الخطوة 6.4 أعلاه لتحديد نشاط الإنزيم في وحدات النظام الدولي للمنحنى القياسي.
  6. لتحويل النشاط إلى نشاط معين يتم التعبير عنه ببروتين الجلوكوز / h / mg ، استخدم المعادلة أدناه:
    النشاط النوعي = [(نشاط الإنزيم / 180.16) * 1000] / الوقت / تركيز البروتين
    ملاحظة: تحويل نشاط الانزيم في ملغ / مل إلى غرام / مل. 180.16 جم / مول هو الوزن الجزيئي للجلوكوز ، و 1000 هو عامل يحول M إلى ميكرومول ، والوقت هو فترة التفاعل ، ويمثل تركيز مستخلص البروتين بالملغم / مل. يتم تعريف وحدة واحدة من نشاط β-1،3-glucanase على أنها 1 μmol من الجلوكوز المنطلق من الركيزة خلال فترة تفاعل مدتها 1 ساعة.

8. تحديد نشاط البيروكسيديز (POD)

ملاحظة: تم تحديد نشاط البيروكسيديز المرتبط بجدار الخلية لأصناف القمح Tugela و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn5 من خلال تحديد تكوين رباعي guaiacol المنتج لكل وحدة زمنية من guaiacol16.

  1. أضف 30 ميكرولتر من مستخلص الإنزيم ، 30 ميكرولتر 1٪ (v / v) H2O 2 ، و 970 ميكرولتر من 5 mM guaiacol في cuvettes عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: قم بعمل تفاعل فارغ بدون مستخلص الإنزيم (الفراغ الأول) ، وآخر فارغ لعينات الإنزيم بدون الركيزة (الفراغ الثاني). تم استبدال عينات الإنزيم أو الركيزة بمحلول فوسفات الصوديوم 50 mM في الفراغات الأولى والثانية ، على التوالي.
  2. استخدم الوضع الحركي لمقياس الطيف الضوئي لمراقبة التغير في الامتصاص عند 470 نانومتر.
  3. حدد الميل الذي كان فيه التمثيل البياني خطيا واستخدمه كقيمة امتصاص.
  4. احسب متوسط الامتصاص واستخدمه في حساب نشاط POD.
  5. احسب نشاط البيروكسيديز باستخدام معامل الانقراض المولي ل guaiacol (26.6 mM-1 cm-1) وعبر عن النشاط في بروتين μmol tetra-guaiacol / min / mg.
  6. احسب نشاط POD باستخدام المعادلة المستخدمة بواسطة Mafa et al.6:
    نشاط جراب = [(ΔABS × DF) ÷ تركيز البروتين] × 26.6 مللي مول -1سم -1 × 1 سم
    ملاحظة: حيث ΔABS = متوسط الامتصاص. DF = عامل التخفيف ؛ 26.6 mM-1 cm-1 = معامل انقراض Guaiacol.

9. توصيف POD

ملاحظة: تم إجراء فحوصات توصيف POD باستخدام مستخلصات إنزيم بعد 3 أيام من الإصابة (dpi) من Tugela و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn5 باتباع طرق مماثلة موصوفة في الخطوة 8 ، مع تغييرات طفيفة في مخازن التفاعل ودرجات الحرارة. كانت عينات الإنزيم تحفظ دائما على الجليد أثناء إجراء التجارب. قم بتشغيل التفاعلات في أربع نسخ مع تفاعل فارغ متوازي.

  1. للحصول على فحوصات الأس الهيدروجيني المثلى ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. قم بإذابة ركيزة guaiacol في مخازن 50 mM (سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 4 و 5) ، فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 6 و 7) ، و Tris-HCl (درجة الحموضة 8 و 9) (انظر جدول المواد).
    2. قم بتشغيل التفاعلات عند 25 درجة مئوية كما هو موضح في الخطوة 8.
  2. للحصول على فحوصات درجة الحرارة المثلى ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. قم بتشغيل التفاعلات عند 25 درجة مئوية و 30 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 50 درجة مئوية على التوالي.
    2. استخدم ركيزة guaiacol المذابة في المخزن المؤقت pH 5 (الرقم الهيدروجيني الأمثل) وقم بتشغيل التفاعلات كما هو موضح في الخطوة 8.
  3. لمقايسات الثبات الحراري ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. قبل بدء التفاعلات، احتضان الإنزيم عند 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، و70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بتشغيل التفاعلات وفقا للطرق الموضحة في الخطوة 8 باستخدام محلول سترات الصوديوم 50 مللي متر (درجة الحموضة 5) وعند 40 درجة مئوية (درجة الحرارة المثلى).

10. توصيف β-1،3-جلوكاناز

ملاحظة: قم بإجراء مقايسات التوصيف باتباع الطريقة الموضحة في الخطوة 7 باستخدام مستخلصات إنزيم 3 نقطة في البوصة ، مع بعض التعديلات في مخازن التفاعل ودرجات الحرارة. قم بتشغيل التفاعلات في أربعة نسخ ، مع تفاعل فارغ مواز لكل ركيزة.

  1. للحصول على فحوصات الأس الهيدروجيني المثلى ، تابع ما يلي:
    1. قم بإذابة ركائز MLG و β-1،3-glucan في مخازن 50 mM (سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 4 و 5) ، فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 6 و 7) ، و Tris-HCl (درجة الحموضة 8 و 9).
    2. قم بتشغيل التفاعل كما هو موضح في الخطوة 7.
  2. للحصول على فحوصات درجة الحرارة المثلى ، تابع ما يلي:
    1. قم بتشغيل التفاعلات عند 25 درجة مئوية و 30 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 50 درجة مئوية على التوالي.
    2. استخدم ركائز MLG و β-1،3-glucan المذابة في محلول سترات الصوديوم 50 mM (pH 5) مع الرقم الهيدروجيني الأمثل (تم الحصول عليه في الخطوة 10.1) وقم بتشغيل التفاعلات كما هو موضح في الخطوة 7.
  3. لمقايسات الثبات الحراري ، تابع ما يلي:
    1. قبل بدء التفاعلات، احتضان الإنزيم عند 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، و70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بتشغيل التفاعلات باستخدام ركائز مذابة في محلول سترات الصوديوم 50 mM (pH 5) واحتضانها عند 25 درجة مئوية و 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

11. تقييم آلية عمل β-1،3-جلوكاناز على ركائز الجلوكان المختلفة

ملاحظة: تحتوي ركائز الجلوكان على نفس بقايا الجلوكوز في عمودها الفقري ، لكن الروابط الجليكوسيدية بين وحدات الجلوكوبيرانوز متنوعة ويمكن أن تأخذ اتجاه α أو β17. يمكن أن تتشكل الروابط الجليكوسيدية بين عدة ذرات كربون لجزيئات الجلوكوز ، تحدد تركيبها الكيميائي ، على سبيل المثال ، β-1،3-جلوكان ، β-1،4-جلوكان ، ومختلط مرتبط β-1،3-1،4-جلوكان (MLG) 18،19،20. تم تحديد آلية عمل β-1،3-glucanase باستخدام عينات Tugela و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn 5 المصابة ب RWASA2 (مصادر الإنزيم) والركائز التالية β-1،3-glucan (CM-curdlan) و MLG (من الشعير) و β-1،4-glucan (AZO-CM-Cellulose). يتم تحديد آلية العمل في ظل ظروف الفحص المثلى (25 درجة مئوية و 40 درجة مئوية ، درجة الحموضة 5.0) ، باستخدام 0.1٪ (وزن / حجم) β-1،4-جلوكان ، 0.4٪ (وزن / حجم) β-1،3-جلوكان ، أو 0.5٪ (وزن / حجم) ركائز MLG.

  1. حل الركائز في 50 مللي متر سيترات الصوديوم العازلة (درجة الحموضة 5).
  2. أضف 200 ميكرولتر من مستخلص الإنزيم و 300 ميكرولتر من الركيزة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
  3. احتضان التفاعلات عند درجتي حرارة منفصلتين ، 25 درجة مئوية و 40 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
  4. إنهاء التفاعلات عن طريق التسخين عند 100 درجة مئوية.
  5. قم بطرد خليط التفاعل من β-1،3-glucan و MLG عند 10000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واستمر كما هو موضح في الخطوة 7.3.
  6. بالنسبة إلى β-1،4-جلوكان ، بعد إنهاء التفاعل عند 100 درجة مئوية ، قم بتخفيف الخليط ب 800 ميكرولتر من الإيثانول المطلق وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 10000 × جم.
  7. نقل المادة الطافية إلى المنحنيات ، وقياس الامتصاص عند 590 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وحساب نشاط β-1،3-glucanase على β-1،4-glucan باستخدام إجراء الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) والتعبير عن النشاط في وحدات / ملغ بروتين.

12. تحديد طريقة عمل β-1،3-جلوكاناز

ملاحظة: تم فحص طريقة عمل Tugela-2 الموبوءة ب RWASA2 و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn5 المستحثة β-1،3-glucanase مع laminarin-oligosaccharides (LAMs) مع درجة البلمرة (DP) بين 5 و 2. استخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) ، وقياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، ومجموعة بيروكسيديز الجلوكوز أوكسيديز (GOPOD) لتحديد DP المطلوب ل β-1،3-glucanase لتحلل الركيزة. تم استخدام TLC للتحليل النوعي ، وتم استخدام LC-MS للتحليل الكمي ، والذي حدد تركيز السكريات قليلة السكاريد في التحلل المائي بعد التفاعل21.

  1. تحضير ردود فعل β-1،3-الجلوكاناز طريقة العمل
    ملاحظة: قم بإعداد مستخلص البروتين المركز باستخدام مرشح غشاء مركز للطرد المركزي 10 كيلو دالتون ، وبالتالي احصل على مستخلصات بروتين RWASA2 المركزة وغير المركزة للتجربة.
    1. لتركيز الإنزيمات المستخرجة من كل صنف ، انقل 5 مل من المستخلصات إلى مرشحات غشاء تركيز أجهزة الطرد المركزي 10 كيلو دالتون.
    2. أجهزة الطرد المركزي أنابيب تصفية الغشاء التي تحتوي على مستخلص عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بإذابة Laminaripentaose (LAM5) و Laminaritetraose (LAM4) و Laminaritriose (LAM3) و Laminaribiose (LAM2) (انظر جدول المواد) في سترات الصوديوم 50 mM (pH 5) لصنع 10 مجم / مل.
    4. لبدء التفاعل ، أضف 20 ميكرولتر من مستخلص البروتين و 40 ميكرولتر من Laminaripentaose (LAM5) ، Laminaritetraose (LAM4) ، Laminaritriose (LAM3) ، و Laminaribiose (LAM2).
    5. احتضان التفاعل عند 40 درجة مئوية لمدة 16 ساعة وانتهي بالغليان عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. إجراء كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)
    1. قطع 4 ألواح السيليكا إلى 10 سم2 قطعة ورسم خط واحد عبر سطح اللوحة ، وترك مساحة 1 سم من أسفل حافة واحدة.
    2. ضع علامة على النقاط فوق الخط وقم بتمييزها وفقا لأصناف مختلفة و DP من Laminarin-oligosaccharides ، على بعد 1 سم و. خذ لوحين من السيليكا لمستخلص البروتين المركز و 2 الآخرين للمستخلصات غير المركزة.
    3. أضف 3 ميكرولتر من مخاليط التفاعل من 3 إلى 5 مرات فوق البقع المحددة المقابلة على لوحة السيليكا واترك البقع على اللوحة تجف تماما قبل تكرار العملية.
    4. ضع ألواح السيليكا برفق في خزان TLC الذي يحتوي على المرحلة المتحركة من n-butanol: حمض الخليك: الماء (2: 1: 1 v / v / v) مع الجانب الذي يحتوي على بقع العينات في الأسفل.
    5. اسمح للطور المتحرك بالانتقال من أسفل اللوحة إلى أعلىها.
      ملاحظة: قد تستغرق هذه الخطوة حوالي 2 ساعة. لا تحرك الخزان أو تزعجه أثناء فصل العينات.
    6. قم بإزالة الألواح من المرحلة المتنقلة واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة.
    7. أضف محلول التلوين إلى الحاوية الصغيرة ، واغمر صفيحة السيليكا برفق في محلول تلطيخ 0.3٪ (وزن / حجم) نافثول في 95٪ (v / v) إيثانول باستخدام 5٪ (v / v) حمض الكبريتيك لمدة 5 ثوان ، قم بإزالته ، ثم اتركه يجف في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، قم بتشغيل كتلة التسخين / الفرن واضبط درجة الحرارة على 100 درجة مئوية.
    8. ضع ألواح السيليكا المجففة على كتلة التسخين وقم بتسخينها على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 7-10 دقائق أو حتى تظهر البقع الزرقاء البنفسجية. التقط صورا لألواح السيليكا التي تظهر البقع الزرقاء البنفسجية وقم بتوثيقها.
  3. تحديد تركيز تحلل اللامينارين-أوليغوساكاريدس
    ملاحظة: سيتم قياس تركيز تحلل LAM لكل من مستخلصات البروتين المركز وغير المركز21.
    1. أضف 20 ميكرولتر من كل عينة على عمود C18 (كربوهيدرات 4.6 × 250 مم) واتركه ينفصل بمعدل تدفق 500 ميكرولتر / دقيقة باستخدام تدرج الماء (المذيب أ) والأسيتونيتريل (المذيب ب) من 100٪ B إلى 60٪ B على مدى 10 دقائق متبوعا بخطوات إعادة توازن العمود مع إجمالي وقت تشغيل يبلغ 20 دقيقة للسماح بإعادة توازن العمود.
    2. قم بتأين التحليلات الملتقطة في وضع الرش الكهربائي السلبي في مصدر أيون قياس الطيف الكتلي بدرجة حرارة سخان 400 درجة مئوية لتبخير المذيب الزائد ، وغاز البخاخات 30 رطل لكل بوصة مربعة ، وغاز سخان 30 رطل لكل بوصة مربعة ، وغاز ستارة 20 رطل لكل بوصة مربعة.
    3. اضبط إمكانية إزالة التجميع على 350 فولت.
    4. تحليل التحليلات الملتقطة على مطياف الكتلة في وضع المسح Q1 الذي يتراوح من 150 Da إلى 1000 Da مع وقت سكون يبلغ 3 ثوان.
    5. سجل تركيزات المواد المراد تحليلها في جدول البيانات.
  4. تحديد تركيز الجلوكوز
    1. تحليل تركيز الجلوكوز الناتج عن التحلل المائي laminarin باستخدام كاشف GOPOD باتباع تعليمات الشركة المصنعة22,23.
    2. قم بقياس الامتصاص عند 510 نانومتر في وضع ثابت لمقياس الطيف الضوئي.

13. جمع البيانات وتحليلها

  1. قم بالتوزيع العشوائي لجميع التجارب لتجنب التحيز أثناء الإصابة أو جمع العينات وإجراء التحليل في أربعة أضعاف.
  2. ما لم ينص على خلاف ذلك ، استخدم وسائل الانحراف المعياري لتمثيل القيم في الرسوم البيانية والجداول الناتجة عن البيانات التجريبية التي تم جمعها ±.
  3. استخدم Microsoft Excel لتحليل كافة البيانات وإنشاء الرسوم البيانية.
  4. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج المتوافقة.
    ملاحظة: قم بإجراء تحليل متعدد العوامل للتباين (ANOVA) لاختبار الأهمية بين العلاجات و Fisher's LSD لاختبار المجموعات المتجانسة بقيمة ألفا 0.05.

النتائج

تم إصابة أربعة نسخ بيولوجية مكررة من أصناف القمح (Tugela و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn5) ب RWASA2 في مرحلة النمو المكونة من 3 أوراق. بعد الإصابة ، تم حصاد الأوراق بدقة 1 و 2 و 3 و 7 و 14 نقطة في البوصة. لم تكن معالجات التحكم موبوءة ب RWASA2 لجعل نتائج التجربة قابلة للمقارنة مع نباتات القمح غير المعرضة للإجهاد. أج...

Discussion

القمح والشعير من محاصيل الحبوب التي كثيرا ما تصيبها أنواع المن ، بما في ذلك حشرات من القمح الروسي (Diuraphis noxia)7,24. تحفز نباتات القمح المقاومة على تنظيم أنشطة POD و β-1،3-glucanase كاستجابات دفاعية طوال فترة الإصابة لتعديل جدار الخلية عن طريق تنظيم تراكم الكالوز و?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

تلقى M. Mafa تمويلا من NRF-Thuthuka (الرقم المرجعي: TTK2204102938). حصل S.N. Zondo على منحة الدراسات العليا لمؤسسة البحوث الوطنية للحصول على درجة الماجستير. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمجلس البحوث الزراعية - معهد الحبوب الصغيرة (ARC-SG) لتوفير البذور المستخدمة في هذه الدراسة. أي رأي ونتائج وتوصيات معبر عنها في هذه المادة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ، وبالتالي ، لا يتحمل الممولون أي مسؤولية فيما يتعلق بذلك.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane deviceSigma-AldrichR1NB84206For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g LaminaribioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM2High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM3High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acidSigma-AldrichD0550Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose Megazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM4High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM5High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanolSigma-Aldrich107017Ethanol absolute for analysis
acetic acidSigma-AldrichB00063Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-CelluloseMegazyme (Wicklow, Ireland)S-ACMCThe polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley) Megazyme (Wicklow, Ireland)G6513A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay DyeBio-Rad Laboratories, South africa500-0006Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II 
Bovine serum albumin (BSA)Gibco Europe810-1018For Laboratory use only
Citrate acidSigma-AldrichC0759For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan Megazyme (Wicklow, Ireland)P-CMCURPowdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-GlucoseSigma-AldrichG8270For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxideBDH Laboratory Supplies, England10366Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estonia)NIPeat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))Multifeed ClassicB1908248A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
NaphtholMerck, GermanyN2780Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
PhenolSigma-Aldrich33517Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)Sigma-AldrichS2377used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EASilica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxideSigma-AldrichS8045For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfiteSigma-Aldrich31448Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrateSigma-AldrichS9390Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrateSigma-Aldrich71500An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis softwareTIBCO Statisticaversion 13.1
Sulfuric acidMerck, Darmstadt, Germany30743Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible SpectrophotometerGENESYS 120 
 NI = not identified.

References

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582 (2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94 (2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394 (2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358 (2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747 (2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved