توضيح # 946 ؛ -1،3-الجلوكاناز والبيروكسيديز الخصائص الفيزيائية والكيميائية لآلية الدفاع عن جدار خلية القمح ضد الإصابة بالديورافيس نوكسيا

Summary

يصف هذا البروتوكول الإجراءات المستخدمة لدراسة وتوصيف الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية ، وخاصة β-1،3-glucanase و peroxidase ، في نباتات القمح. تزداد مستويات نشاطها أثناء تفاعل القمح و RWA وتشارك في استجابة دفاع النبات من خلال تعزيز جدار الخلية ، مما يردع تغذية المن.

Abstract

تحفز نباتات القمح الموبوءة بحشرات من القمح الروسي (RWA) سلسلة من الاستجابات الدفاعية ، بما في ذلك الاستجابات شديدة الحساسية (HR) وتحريض البروتينات المرتبطة بالإمراض (PR) ، مثل β-1،3-glucanase و peroxidase (POD). تهدف هذه الدراسة إلى توصيف الخواص الفيزيائية والكيميائية لجدار الخلية المرتبطة ب POD و β-1،3-glucanase وتحديد تآزرها على تعديل جدار الخلية أثناء تفاعل RWASA2-wheat. تم إنبات أصناف Tugela-Dn1 الحساسة ، و Tugela-Dn1 المقاومة بشكل معتدل ، وأصناف Tugela-Dn5 المقاومة مسبقا وزرعها في ظروف الدفيئة ، وتم تخصيبها بعد 14 يوما من الزراعة ، وتم ريها كل 3 أيام. كانت النباتات موبوءة ب 20 فردا بارثينوجينيا من نفس استنساخ RWASA2 في مرحلة 3 أوراق ، وتم حصاد الأوراق في 1 إلى 14 يوما بعد الإصابة. تم استخراج سائل الغسيل بين الخلايا (IWF) باستخدام الترشيح الفراغي وتخزينه عند -20 درجة مئوية. تم سحق بقايا الأوراق إلى مسحوق واستخدامها لمكونات جدار الخلية. تم تحديد نشاط وتوصيف POD باستخدام ركيزة 5 mM guaiacol و H₂O₂ ، ومراقبة التغير في الامتصاص عند 470 نانومتر. تم إثبات نشاط β-1،3-glucanase ودرجة الحموضة والظروف المثلى لدرجة الحرارة من خلال قياس إجمالي السكريات المختزلة في التحلل المائي باستخدام كاشف DNS باستخدام ركائز β-1،3-glucan و β-1،3-1،4-glucan ، وقياس الامتصاص عند 540 نانومتر ، واستخدام منحنى الجلوكوز القياسي. تم تحديد الأس الهيدروجيني الأمثل بين الرقم الهيدروجيني 4 إلى 9 ، ودرجة الحرارة المثلى بين 25 و 50 درجة مئوية ، والاستقرار الحراري بين 30 درجة مئوية و 70 درجة مئوية. تم تحديد خصوصية ركيزة β-1،3-glucanase عند 25 درجة مئوية و 40 درجة مئوية باستخدام ركائز curdlan و barley β-1،3-1،4-glucan. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد طريقة عمل β-1،3-glucanase باستخدام laminaribiose إلى laminaripentaose. تم تحليل أنماط منتجات التحلل المائي قليل السكاريد نوعيا باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) وتحليلها كميا باستخدام HPLC. توضح الطريقة المقدمة في هذه الدراسة نهجا قويا لغزو القمح ب RWA ، واستخراج البيروكسيديز و β-1،3-glucanase من منطقة جدار الخلية وتوصيفها الكيميائي الحيوي الشامل.

Introduction

تصيب حشرات من القمح الروسي (RWA) القمح والشعير ، مما يتسبب في خسارة كبيرة في المحصول أو انخفاض جودة الحبوب. يستجيب القمح للإصابة عن طريق إحداث العديد من الاستجابات الدفاعية ، بما في ذلك زيادة مستويات نشاط β-1،3-glucanase و peroxidase في الأصناف المقاومة ، بينما تقلل الأصناف الحساسة من نشاط هذه الإنزيمات في فترة الإصابة المبكرة^1،2،3،4. تضمنت الوظائف الرئيسية ل β-1،3-glucanase و POD في نبات القمح تنظيم تراكم الكالوز في الصنف المقاوم وتبريد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في جدار الخلية والمناطق الأوسترية أثناء الإصابة ب RWA¹

Protocol

أجريت الدراسة بموافقة وإذن من لجنة أخلاقيات البحوث البيئية والسلامة البيولوجية بجامعة فري ستيت (UFS-ESD2022/0131/22). تفاصيل الكواشف والمعدات هنا مذكورة في جدول المواد.

1. ظروف نمو النبات

1. تنبت 250 بذرة من كل صنف قمح ، أي توجيلا حساسة ، وتوجيلا-Dn1 مقاومة بشكل معتدل ، وتوجيلا-Dn5 مقاومة ، في أطباق بتري منفصلة.
2. أضف 5 مل من الماء المقطر في كل طبق بتري ، وأغلقه بغشاء بارافين ، واحتضانه في غرفة الإنبات عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.
3. زرع البذور النابتة لكل صنف في أواني 15 سم تحتوي على 1: 1 تربة وطحلب (15 نبتة لكل وعاء) في ظل ظروف الدفيئة الخاضعة للرقابة.
4. اض....

النتائج

تم إصابة أربعة نسخ بيولوجية مكررة من أصناف القمح (Tugela و Tugela-Dn1 و Tugela-Dn5) ب RWASA2 في مرحلة النمو المكونة من 3 أوراق. بعد الإصابة ، تم حصاد الأوراق بدقة 1 و 2 و 3 و 7 و 14 نقطة في البوصة. لم تكن معالجات التحكم موبوءة ب RWASA2 لجعل نتائج التجربة قابلة للمقارنة مع نباتات القمح غير المعرضة للإجهاد. أج.......

Discussion

القمح والشعير من محاصيل الحبوب التي كثيرا ما تصيبها أنواع المن ، بما في ذلك حشرات من القمح الروسي (Diuraphis noxia)^7,24. تحفز نباتات القمح المقاومة على تنظيم أنشطة POD و β-1،3-glucanase كاستجابات دفاعية طوال فترة الإصابة لتعديل جدار الخلية عن طريق تنظيم تراكم الكالوز و?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.