Elucidando #946;-1,3-glucanasa y peroxidasa, propiedades fisicoquímicas del mecanismo de defensa de la pared celular del trigo contra la infestación por Diuraphis noxia

Resumen

El presente protocolo describe los procedimientos utilizados para estudiar y caracterizar las enzimas relacionadas con la pared celular, principalmente la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa, en plantas de trigo. Sus niveles de actividad aumentan durante la interacción trigo-RWA y están involucrados en la respuesta de defensa de la planta a través del refuerzo de la pared celular, lo que disuade la alimentación de pulgones.

Resumen

Las plantas de trigo infestadas por pulgones rusos del trigo (RWA) inducen una cascada de respuestas de defensa, incluidas las respuestas de hipersensibilidad (HR) y la inducción de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), como la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa (POD). Este estudio tiene como objetivo caracterizar las propiedades fisicoquímicas de la POD y la β-1,3-glucanasa asociadas a la pared celular y determinar su sinergia en la modificación de la pared celular durante la interacción RWASA2-trigo. Los cultivares Tugela susceptible, Tugela-Dn1 moderadamente resistente y Tugela-Dn5 resistente se pregerminaron y plantaron en condiciones de invernadero, se fertilizaron 14 días después de la siembra y se regaron cada 3 días. Las plantas se infestaron con 20 individuos partenogenéticos del mismo clon RWASA2 en la etapa de 3 hojas, y las hojas se cosecharon de 1 a 14 días después de la infestación. El fluido de lavado intercelular (IWF) se extrajo mediante filtración al vacío y se almacenó a -20 °C. Los residuos de las hojas se trituraron hasta convertirlos en polvo y se utilizaron para los componentes de la pared celular. La actividad y caracterización de POD se determinó utilizando sustrato de guayacol 5 mM y_H2O2, monitoreando el cambio en la absorbancia a 470 nm. La actividad de la β-1,3-glucanasa, el pH y las condiciones óptimas de temperatura se demostraron midiendo los azúcares reductores totales en el hidrolizado con reactivo DNS utilizando sustratos de β-1,3-glucano y β-1,3-1,4-glucano, midiendo la absorbancia a 540 nm y utilizando la curva estándar de glucosa. El pH óptimo se determinó entre pH 4 a 9, la temperatura óptima entre 25 y 50 °C y la estabilidad térmica entre 30 °C y 70 °C. La especificidad del sustrato de β-1,3-glucanasa se determinó a 25 °C y 40 °C utilizando sustratos de curdlan y cebada β-1,3-1,4-glucano. Además, se determinó el modo de acción de la β-1,3-glucanasa utilizando laminaribiosa a laminaripentaosa. Los patrones de productos de hidrólisis de oligosacáridos se analizaron cualitativamente con cromatografía en capa fina (TLC) y cuantitativamente con HPLC. El método presentado en este estudio demuestra un enfoque robusto para infestar trigo con RWA, extrayendo peroxidasa y β-1,3-glucanasa de la región de la pared celular y su caracterización bioquímica integral.

Introducción

Los pulgones rusos del trigo (APR) infestan el trigo y la cebada, causando una pérdida significativa de rendimiento o una reducción de la calidad del grano. El trigo responde a la infestación induciendo varias respuestas de defensa, incluyendo el aumento de los niveles de actividad de la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa en los cultivares resistentes, mientras que los cultivares susceptibles reducen la actividad de estas enzimas en el período de infestación temprano 1,2,3,4. Las funciones clave de la β-1,3-glucanasa y la POD en la planta de trigo incluyeron la regulación de la acumulación de calosa en el cultivar resistente y el enfriamiento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la pared celular y las regiones apoplásticas durante la infestación por RWA 1,3,5,6,7. Mafa et ^al.6 demostraron que había una fuerte correlación entre el aumento de la actividad de POD y el aumento del contenido de lignina en el cultivar de trigo resistente tras las infestaciones de RWASA2. Además, el aumento del contenido de lignina indicó que la pared celular del cultivar de trigo resistente infestado se reforzó, lo que llevó a una reducción de la alimentación con RWA.

La mayoría de los grupos de investigación extrajeron y estudiaron la β-1,3-glucanasa apoplástica y la POD durante la interacción trigo/cebada-RWA; además, la mayoría de estos estudios afirmaron que estas enzimas influyen en la pared celular de la planta de trigo infestada con RWA sin medir la presencia de la enzima en la región de la pared celular. Solo unos pocos estudios han utilizado técnicas microscópicas para demostrar que los niveles de actividad de la β-1,3-glucanasa estaban relacionados con la regulación de la calosa ^7,8,9 o han extraído los principales componentes de la pared celular para demostrar la correlación entre las actividades de POD y la modificación de la pared celular en los resistentes ^6,10. La falta de sondeo de la asociación de la β-1,3-glucanasa y la POD con la pared celular indica la necesidad de desarrollar métodos que permitan a los investigadores medir directamente las enzimas unidas a la pared celular.

El método actual propone que es necesario eliminar el líquido apoplástico del tejido de la hoja antes de extraer las enzimas unidas a la pared celular. El procedimiento de extracción del líquido apoplástico debe realizarse dos veces del tejido de la hoja, que se utiliza para extraer las enzimas unidas a la pared celular. Este proceso reduce la contaminación y la confusión de las enzimas apoplásticas con las que se encuentran en las regiones de la pared celular. Por lo tanto, en este estudio, extrajimos POD unidos a la pared celular, β-1,3-glucanasa y β-glucanasa específicos de MLG y realizamos su caracterización bioquímica.

Protocolo

El estudio se realizó con la aprobación y permiso del Comité de Ética en Investigación en Medio Ambiente y Bioseguridad de la Universidad del Estado Libre (UFS-ESD2022/0131/22). Los detalles de los reactivos y el equipo aquí se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Condiciones de crecimiento de las plantas

1. Germinar 250 semillas de cada cultivar de trigo, es decir, Tugela susceptible, Tugela-Dn1 moderadamente resistente y Tugela-Dn5 resistente, en placas de Petri separadas.
2. Añadir 5 mL de agua destilada en cada placa de Petri, sellar con una película de parafina e incubar en la cámara de germinación a 25 °C durante 2 días.
3. Trasplante las semillas germinadas de cada cultivar en macetas de 15 cm que contengan tierra 1:1 y turba (15 plantas por maceta) en condiciones controladas de invernadero.
4. Ajuste los regímenes de temperatura a 18 °C y 24 °C durante la noche y el día, respectivamente.
5. Riegue las plantas cada 3 días con agua del grifo y proporciónelas con 2 g / L de fertilizante 14 días después de la germinación.
6. Coloque las plantas en jaulas encerradas en redes y déjelas crecer hasta la etapa de la tercera hoja ^2,6 (con cuatro réplicas biológicas de cada cultivar).

2. Infestación de cultivares de trigo con RWASA2

1. Infestar los cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 con RWASA2 según Jimoh et ^al.11 y Mohase y Taiwe¹².
2. Mantenga las plantas en dos conjuntos separados en jaulas; infestar un conjunto con 20 individuos partenogenéticos del mismo clon RWASA2 por planta en cada maceta en las cámaras de crecimiento cubiertas con redes. Mantenga otro conjunto de plantas de trigo en una habitación separada debajo de la cámara de crecimiento con redes limpias y trátelas como controles.
   NOTA: Mantenga los dos tratamientos en habitaciones separadas y cubra las plantas en jaulas encerradas en redes. Además, en el caso de que se utilicen dos biotipos diferentes de RWA en un estudio, mantenga las plantas infestadas con un biotipo de RWA de las infestadas con el segundo biotipo en la medida de lo posible o en salas separadas bajo cámaras de crecimiento cubiertas con redes para evitar cualquier posible contaminación cruzada de RWASA2.
3. Para la cosecha, seleccione la segunda y tercera hoja en dos regímenes de tiempo diferentes, período de alimentación a corto plazo (1, 2 y 3 días) y período de alimentación a largo plazo (7 y 14 días), y envuélvalas en toallas de papel húmedas.
4. Transfiera inmediatamente las hojas cosechadas a una caja que contenga hielo para reducir el metabolismo de las hojas antes de la extracción con líquido de lavado intercelular (IWF).

3. Extracción del líquido de lavado intercelular (IWF) del apoplasto

1. Corta las hojas cosechadas de unos tres cultivares de trigo en trozos de 7 cm.
2. Enjuague los trozos de hoja dos veces en agua destilada para eliminar cualquier contaminación citosólica de los extremos cortados ^6,13.
3. Inserte los trozos de hoja en un tubo de vidrio de paredes gruesas y sumerja las muestras en un tampón de extracción (50 mM de Tris-HCl, pH 7,8).
4. Aplique la infiltración al vacío durante 5 min con una bomba de chorro de agua para impregnar las hojas con el tampón de extracción.
5. A continuación, retire los trozos de hoja del tubo de vidrio y séquelos con una toalla de papel.
6. Inserte los trozos de hoja seca verticalmente en tubos de centrífuga preenfriados provistos de discos perforados y centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 °C.
7. Utilice una pipeta de 100 μL para recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL preenfriados.
8. Repita todo el procedimiento de extracción con el mismo material de hoja.
9. Combine el sobrenadante recolectado y guárdelo a -20° C.
   NOTA: Las alícuotas sobrenadantes se tratan como la fuente del contenido de apoplasto o IWF. La IWF no se utilizó en el estudio actual, pero era importante eliminarla de los tejidos de las hojas antes de extraer la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa (POD) unidas a la pared celular.

4. Extracción de la β-1,3-glucanasa y POD asociadas a la pared celular

NOTA: Los residuos de hojas que quedaron después de la extracción de IWF se utilizaron para extraer la proteína total de la pared celular.

1. Triture los residuos de las hojas hasta convertirlos en un polvo fino con nitrógeno líquido utilizando un mortero.
2. Transfiera aproximadamente 200 mg del tejido foliar en polvo a un mortero que contenga 4 mL de tampón de extracción (50 mM de fosfato de sodio con 1% (p/v) de polivinilpolipirrolidona (PVPP); pH 5.0) seguido de molienda con un mortero hasta obtener una pasta suave, que luego se transfiere a tubos de microcentrífuga.
3. Incubar la mezcla en los tubos de la microcentrífuga durante 3 min sobre hielo y luego centrifugar a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C.
4. Recoger el sobrenadante (extractos de proteínas totales) en tubos de microcentrífuga (alícuotas de 2 mL) y utilizarlo como fuente de β-1,3-glucanasa y POD durante todo el estudio.

5. Determinación del patrón proteico

1. Determinar la concentración total de proteínas de los extractos siguiendo el método de Bradford¹⁴.
2. Prepare las soluciones de albúmina sérica bovina (BSA) en las concentraciones de 0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL y 1,0 mg/mL disueltas en tampón de fosfato de sodio de 50 mM para generar el patrón de proteína.
3. Prepare el estándar añadiendo 10 μL de cada solución de BSA en la microplaca de 96 pocillos con 190 μL (0,25% v/v) de reactivo Bradford (consulte la Tabla de materiales).
4. Incubar a 25 °C durante 20 min y medir la absorbancia a 595 nm utilizando el lector de microplacas y utilizar los valores de absorbancia para preparar la curva estándar para cuantificar la concentración de proteínas.
5. Cuantificar la concentración de proteínas
   1. Añada 10 μL de la enzima extraída (paso 4) en una microplaca de 96 pocillos con 190 μL (0,25% v/v) de reactivo Bradford por triplicado.
   2. Incubar a temperatura ambiente (25 °C) durante 20 min.
   3. Mida la absorbancia a 595 nm utilizando el espectrofotómetro con un lector de microplacas y utilice los valores de absorbancia para determinar la concentración de proteínas utilizando BSA como patrón de proteínas (preparado en el paso 5.4).

6. Preparar el estándar de glucosa para la actividad de la β-1,3-glucanasa

1. Prepare las soluciones patrón con concentraciones entre 0,00 mg/mL y 1,0 mg/mL (0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL) con glucosa disuelta en agua destilada.
2. Añadir 300 μL de cada solución de glucosa y 600 μL de reactivo de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) en una proporción de 1:2 en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar las reacciones a 100 °C durante 5 min (ver Tabla de materiales para reactivos DNS) (Miller et al.15).
3. Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente antes de medir la absorbancia a 540 nm con el espectrofotómetro.
4. Utilice los valores medios de absorbancia para desarrollar la curva estándar para determinar la actividad de la enzima β-1,3-glucanasa.

7. Determinación de la actividad de la β-1,3-glucanasa

NOTA: La actividad enzimática de la β-1,3-glucanasa unida a la pared celular extraída de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 se determinó por la cantidad de azúcares reductores totales liberados de la hidrólisis de sustratos de β-1,3-4-glucano (MLG) y β-1,3-glucano (MLG) mixtos al 0,5% (p/v) utilizando un método modificado según lo descrito por Miller et ^al.15. Mantenga siempre los tubos con alícuotas de proteínas en el hielo. Si las muestras estaban congeladas, descongélelas en hielo y proceda inmediatamente después de descongelarlas.

1. Añadir 200 μL del extracto enzimático (mantener la concentración de proteína entre 20 μg/mL y 90 μg/mL en todas las reacciones, a menos que se indique lo contrario) y 300 μL del sustrato disuelto en 50 mM de tampón de citrato de sodio (pH 5,0) en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: Ejecute una reacción paralela en blanco sin el extracto enzimático para todos los sustratos (primer blanco), y el blanco enzimático consiste en extracto enzimático sin sustrato (segundo blanco). Tanto el sustrato como el extracto enzimático se reemplazaron con el tampón en el primer y segundo negro, respectivamente.
2. Incubar las reacciones a 37 °C durante 24 h y finalizar la reacción calentándola a 100 °C durante 5 min, luego centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
3. Mezclar 300 μL del sobrenadante con 600 μL de reactivo DNS (proporción 1:2) en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y hervir a 100 °C durante 5 min.
4. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y mida la absorbancia a 540 nm con el espectrofotómetro.
   NOTA: Si la concentración de azúcares reductores totales es alta en la mezcla, dará como resultado una solución de color marrón oscuro, que es difícil de leer con el espectrofotómetro. Por lo tanto, es necesaria una mayor dilución de las muestras antes de leer la absorbancia.
5. Utilice la curva estándar de glucosa desarrollada en el paso 6.4 anterior para determinar la actividad enzimática en las unidades SI de la curva estándar.
6. Para convertir la actividad en una actividad específica que se expresa en μmol de glucosa/h/mg de proteína, utilice la siguiente ecuación:
   Actividad específica = [(actividad enzimática/180.16)*1000]/tiempo/concentración de proteína
   NOTA: Convierta la actividad enzimática en mg/mL a g/mL; 180,16 g/mol es el peso molecular de la glucosa, 1000 es un factor que convierte M en micromoles, el tiempo es el período de reacción y la concentración de extracto de proteínas se representa en mg/mL. Una unidad de actividad de β-1,3-glucanasa se define como 1 μmol de glucosa liberada del sustrato en un período de reacción de 1 h.

8. Determinación de la actividad de la peroxidasa (POD)

NOTA: La actividad de la peroxidasa unida a la pared celular de los cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 se determinó cuantificando la formación del tetra-guayacol producido por unidad de tiempo a partir de guaiacol¹⁶.

1. Añadir 30 μL del extracto enzimático, 30 μL 1% (v/v) H₂O₂ y 970 μL de 5 mM de guayacol en las cubetas a 25 °C.
   NOTA: Realice la reacción en blanco sin el extracto enzimático (primer blanco), y otro blanco para muestras de enzimas sin sustrato (segundo blanco). Las muestras de enzima o sustrato se reemplazaron por 50 mM de tampón de fosfato de sodio en el primer y segundo blanco, respectivamente.
2. Utilice el modo cinético del espectrofotómetro para controlar el cambio en la absorbancia a 470 nm.
3. Determine la pendiente en la que el gráfico era lineal y utilícela como valor de absorbancia.
4. Calcule la absorbancia media y utilícela para calcular la actividad del POD.
5. Calcular la actividad de la peroxidasa utilizando el coeficiente de extinción molar del guayacol (26,6 ^{mM-1 cm-1}) y expresar la actividad en μmol de tetra-guayacol/min/mg de proteína.
6. Calcule la actividad de POD utilizando la ecuación utilizada por Mafa et ^al.6:
   ACTIVIDAD DEL POD = [(ΔABS × DF) ÷ concentración de proteína] × 26,6 ^{mM-1 cm-1} × 1 cm
   NOTA: Donde ΔABS = absorbancia media; DF = Factor de dilución; 26.6 ^{mM-1 cm-1} = Coeficiente de extinción de Guaiacol.

9. Caracterización de POD

NOTA: Los ensayos de caracterización de POD se llevaron a cabo utilizando extractos enzimáticos de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 después de 3 días después de la infestación siguiendo métodos similares a los descritos en el paso 8, con cambios menores en los tampones de reacción y las temperaturas. Las muestras de enzimas siempre se mantuvieron en hielo mientras se realizaban los experimentos. Ejecute las reacciones en cuadruplicados con una reacción en blanco paralela.

1. Para obtener ensayos de pH óptimo, realice los siguientes pasos.
   1. Disuelva el sustrato de guayacol en tampones de 50 mM (citrato de sodio, pH 4 y 5), fosfato de sodio (pH 6 y 7) y Tris-HCl (pH 8 y 9) (ver Tabla de Materiales).
   2. Ejecute las reacciones a 25 °C como se describe en el paso 8.
2. Para realizar ensayos de temperatura óptima, realice los siguientes pasos.
   1. Ejecute las reacciones a 25 °C, 30 °C, 40 °C y 50 °C, respectivamente.
   2. Utilice el sustrato de guaiacol disuelto en el tampón pH 5 (pH óptimo) y ejecute las reacciones como se describe en el paso 8.
3. Para los ensayos de termoestabilidad, realice los siguientes pasos.
   1. Antes de iniciar las reacciones, incubar la enzima a 37 °C, 50 °C y 70 °C durante 30 min.
   2. Ejecute las reacciones de acuerdo con los métodos descritos en el paso 8 utilizando 50 mM de tampón de citrato de sodio (pH 5) y a 40 °C (temperatura óptima).

10. Caracterización de la β-1,3-glucanasa

NOTA: Realice los ensayos de caracterización siguiendo el método descrito en el paso 7 utilizando extractos enzimáticos de 3 dpi, con algunas modificaciones en los tampones de reacción y las temperaturas. Ejecute las reacciones en cuadruplicados, con una reacción en blanco paralela para cada sustrato.

1. Para obtener ensayos de pH óptimo, proceda de la siguiente manera:
   1. Disuelva los sustratos de MLG y β-1,3-glucano en tampones de 50 mM (citrato de sodio, pH 4 y 5), fosfato de sodio (pH 6 y 7) y Tris-HCl (pH 8 y 9).
   2. Ejecute la reacción como se describe en el paso 7.
2. Para los ensayos de temperatura óptima, proceda de la siguiente manera:
   1. Ejecute las reacciones a 25 °C, 30 °C, 40 °C y 50 °C, respectivamente.
   2. Utilice sustratos de MLG y β-1,3-glucano disueltos en el tampón de citrato de sodio de 50 mM (pH 5) con un pH óptimo (obtenido en el paso 10.1) y ejecute las reacciones como se describe en el paso 7.
3. Para los ensayos de termoestabilidad, proceda de la siguiente manera:
   1. Antes de iniciar las reacciones, incubar la enzima a 37 °C, 50 °C y 70 °C durante 30 min.
   2. Ejecutar las reacciones utilizando sustratos disueltos en 50 mM de tampón de citrato sódico (pH 5) e incubar a 25 °C y 40 °C durante 24 h.

11. Evaluación del mecanismo de acción de la β-1,3-glucanasa en diferentes sustratos de glucano

NOTA: Los sustratos de glucano contienen el mismo residuo de glucosa en su columna vertebral, pero los enlaces glucosídicos entre las unidades de glucopiranosa son diversos y pueden tomar la orientación α o β¹⁷. Los enlaces glucosídicos pueden formarse entre varios átomos de carbono de moléculas de glucosa, definiendo su estructura química, por ejemplo, β-1,3-glucano, β-1,4-glucano y β-1,3-1,4-glucano (MLG)18,19,20. El mecanismo de acción de la β-1,3-glucanasa se determinó utilizando muestras de Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn 5 infestados por RWASA2 (fuentes enzimáticas) y los siguientes sustratos: β-1,3-glucano (CM-curdlan), MLG (de cebada) y β-1,4-glucano (AZO-CM-celulosa). El mecanismo de acción se determina en condiciones óptimas de ensayo (25 °C y 40 °C, pH 5,0), utilizando sustratos de β-1,4-glucano al 0,1% (p/v), β-1,3-glucano al 0,4% (p/v) o MLG al 0,5% (p/v).

1. Disolver los sustratos en 50 mM de tampón de citrato de sodio (pH 5).
2. Añada 200 μL del extracto enzimático y 300 μL del sustrato en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Incubar las reacciones a dos temperaturas distintas, 25 °C y 40 °C durante 8 h.
4. Terminación de las reacciones por calentamiento a 100 °C.
5. Centrifugar la mezcla de reacción de β-1,3-glucano y MLG a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C y proceder como se describe en el paso 7.3.
6. Para β-1,4-glucano, después de terminar la reacción a 100 °C, diluir la mezcla con 800 μL de etanol absoluto y centrifugar a 4 °C durante 10 min a 10.000 x g.
7. Transfiera el sobrenadante a las curvas, mida la absorbancia a 590 nm con el espectrofotómetro y calcule la actividad de la β-1,3-glucanasa en el β-1,4-glucano utilizando el procedimiento del fabricante (consulte la tabla de materiales) y exprese la actividad en unidades/mg de proteína.

12. Determinación del modo de acción de la β-1,3-glucanasa

NOTA: El modo de acción de la β-1,3-glucanasa inducido por Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5 infestado por RWASA2 con laminarina-oligosacáridos (LAM) con un grado de polimerización (DP) entre 5 y 2. Utilice el kit de cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) y peroxidasa de glucosa oxidasa (GOPOD) para determinar la DP necesaria para que la β-1,3-glucanasa hidrolice el sustrato. Para el análisis cualitativo se utilizó el TLC y para el análisis cuantitativo se utilizó el LC-MS, que determinó la concentración de los oligosacáridos en el hidrolizado después de la reacción²¹.

1. Preparar las reacciones del modo de acción de la β-1,3-glucanasa
   NOTA: Prepare el extracto de proteína concentrada con un filtro de membrana concentradora centrífuga de 10 kDa y, por lo tanto, tenga extractos de proteína infestados de RWASA2 concentrados y no concentrados para el experimento.
   1. Para concentrar las enzimas extraídas de cada cultivar, transfiera 5 mL de los extractos a los filtros de membrana concentradores centrífugos de 10 kDa.
   2. Centrifugar los tubos del filtro de membrana que contienen el extracto a 15.000 x g durante 30 min a 4 °C.
   3. Disuelva la laminaripentaosa (LAM5), la laminaritetraosa (LAM4), la laminaritriosa (LAM3) y la laminaribiosa (LAM2) (consulte la tabla de materiales) en 50 mM de citrato de sodio (pH 5) para obtener 10 mg/mL.
   4. Para iniciar la reacción, agregue 20 μL del extracto de proteína y 40 μL de Laminaripentaosa (LAM5), Laminaritetraosa (LAM4), Laminaritriosa (LAM3) y Laminaribiosa (LAM2).
   5. Incubar la reacción a 40 °C durante 16 h y terminar hirviendo a 100 °C durante 5 min.
2. Realizar cromatografía en capa fina (TLC)
   1. Corta 4 placas de sílice en^{trozos de 10} cm y 2 y dibuja una línea a través de la superficie de la placa, dejando un espacio de 1 cm desde la parte inferior de un borde.
   2. Marque los puntos sobre la línea y márquelos de acuerdo con los diferentes cultivares y DP de los Oligosacáridos de laminarina, a 1 cm de distancia y. Tome 2 placas de sílice para el extracto de proteína concentrada y las otras 2 para extractos no concentrados.
   3. Agregue 3 μL de las mezclas de reacción de 3 a 5 veces sobre los puntos marcados correspondientes en la placa de sílice y deje que los puntos de la placa se sequen completamente antes de repetir el proceso.
   4. Coloque suavemente las placas de sílice en el tanque TLC que contiene la fase móvil de n-butanol: ácido acético: agua (2:1:1 v/v/v) con el lado que contiene las manchas de las muestras en el fondo.
   5. Permita que la fase móvil se mueva de la parte inferior a la parte superior de la placa.
      NOTA: Este paso puede tardar aproximadamente 2 h. No mueva ni moleste el tanque mientras las muestras se están separando.
   6. Retire las placas de la fase móvil y déjelas secar a temperatura ambiente.
   7. Agregue la solución de tinción en el recipiente pequeño, sumerja suavemente la placa de sílice en la solución de tinción de naftol al 0,3% (p/v) en etanol al 95% (v/v) usando ácido sulfúrico al 5% (v/v) durante 5 s, retírela y luego déjela secar a temperatura ambiente.
      NOTA: En este paso, encienda el bloque calefactor/horno y ajuste la temperatura a 100 °C.
   8. Coloque las placas de sílice seca en el bloque calefactor y caliente a 100 °C durante 7-10 minutos o hasta que aparezcan las manchas azul-violetas. Tome fotos de las placas de sílice que muestran las manchas azul-violetas y documéntelas.
3. Cuantificar la concentración de hidrolizados de laminarina-oligosacáridos
   NOTA: La concentración de los hidrolizados de LAM se cuantificará tanto para los extractos de proteínas concentrados como para los no concentrados²¹.
   1. Añada 20 μL de cada muestra en una columna C18 (Hidratos de carbono 4,6 × 250 mm) y deje separar a un caudal de 500 μL/min utilizando un gradiente de agua (disolvente A) y acetonitrilo (Disolvente B) de 100% B a 60% B durante 10 minutos, seguido de pasos de reequilibrio de la columna con un tiempo total de ejecución de 20 min para permitir el reequilibrio de la columna.
   2. Ionizar los analitos eluyentes en modo de electrospray negativo en la fuente de iones de espectrometría de masas con una temperatura de calentamiento de 400 °C para evaporar el exceso de solvente, gas de nebulizador de 30 psi, gas de calentador de 30 psi y gas de cortina de 20 psi.
   3. Ajuste el potencial de desagrupación a 350 V.
   4. Analice los analitos eluyentes en el espectrómetro de masas en un modo de escaneo Q1 que oscila entre 150 Da y 1000 Da con un tiempo de permanencia de 3 s.
   5. Registre las concentraciones de los analitos en la hoja de cálculo.
4. Cuantificar la concentración de glucosa
   1. Analice la concentración de glucosa producida por hidrólisis de laminarina utilizando el reactivo GOPOD siguiendo las instrucciones del fabricante^22,23.
   2. Mida la absorbancia a 510 nm en un modo fijo del espectrofotómetro.

13. Recopilación y análisis de datos

1. Aleatorice todos los experimentos para evitar sesgos durante la infestación o la recolección de muestras y realice el análisis por cuadruplicados.
2. A menos que se indique lo contrario, utilice la media ± la desviación estándar para representar los valores en los gráficos y tablas generados a partir de los datos experimentales recopilados.
3. Utilice Microsoft Excel para analizar todos los datos y generar gráficos.
4. Realizar análisis estadísticos con software compatible.
   NOTA: Realice un análisis multifactorial de la varianza (ANOVA) para probar la significación entre los tratamientos y el LSD de Fisher para probar grupos homogéneos con un valor alfa de 0,05.

Resultados

Cuatro réplicas biológicas de cultivares de trigo (Tugela, Tugela-Dn1 y Tugela-Dn5) fueron infestadas con RWASA2 en la etapa de crecimiento de 3 hojas. Después de la infestación, las hojas se cosecharon a 1, 2, 3, 7 y 14 ppp. Los tratamientos de control no estaban infestados con RWASA2 para que los resultados del experimento fueran comparables a los de las plantas de trigo no expuestas al estrés. Los experimentos se realizaron por cuadruplicados y los resultados se presentaron como valores medios.<...

Discusión

El trigo y la cebada son cultivos de cereales frecuentemente infestados por especies de pulgones, incluyendo el pulgón ruso del trigo (Diuraphis noxia)^7,24. Las plantas de trigo resistentes inducen la regulación positiva de las actividades de POD y β-1,3-glucanasa como respuestas de defensa durante todo el período de infestación para modificar la pared celular mediante la regulación de la acumulación de calosa y lignina

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.