Elucidando #946;-1,3-glucanasa y peroxidasa, propiedades fisicoquímicas del mecanismo de defensa de la pared celular del trigo contra la infestación por Diuraphis noxia

Resumen

El presente protocolo describe los procedimientos utilizados para estudiar y caracterizar las enzimas relacionadas con la pared celular, principalmente la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa, en plantas de trigo. Sus niveles de actividad aumentan durante la interacción trigo-RWA y están involucrados en la respuesta de defensa de la planta a través del refuerzo de la pared celular, lo que disuade la alimentación de pulgones.

Resumen

Las plantas de trigo infestadas por pulgones rusos del trigo (RWA) inducen una cascada de respuestas de defensa, incluidas las respuestas de hipersensibilidad (HR) y la inducción de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), como la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa (POD). Este estudio tiene como objetivo caracterizar las propiedades fisicoquímicas de la POD y la β-1,3-glucanasa asociadas a la pared celular y determinar su sinergia en la modificación de la pared celular durante la interacción RWASA2-trigo. Los cultivares Tugela susceptible, Tugela-Dn1 moderadamente resistente y Tugela-Dn5 resistente se pregerminaron y plantaron en condiciones de invernadero, se fertilizaron 14 días después de la siembra y se regaron cada 3 días. Las plantas se infestaron con 20 individuos partenogenéticos del mismo clon RWASA2 en la etapa de 3 hojas, y las hojas se cosecharon de 1 a 14 días después de la infestación. El fluido de lavado intercelular (IWF) se extrajo mediante filtración al vacío y se almacenó a -20 °C. Los residuos de las hojas se trituraron hasta convertirlos en polvo y se utilizaron para los componentes de la pared celular. La actividad y caracterización de POD se determinó utilizando sustrato de guayacol 5 mM y_H2O2, monitoreando el cambio en la absorbancia a 470 nm. La actividad de la β-1,3-glucanasa, el pH y las condiciones óptimas de temperatura se demostraron midiendo los azúcares reductores totales en el hidrolizado con reactivo DNS utilizando sustratos de β-1,3-glucano y β-1,3-1,4-glucano, midiendo la absorbancia a 540 nm y utilizando la curva estándar de glucosa. El pH óptimo se determinó entre pH 4 a 9, la temperatura óptima entre 25 y 50 °C y la estabilidad térmica entre 30 °C y 70 °C. La especificidad del sustrato de β-1,3-glucanasa se determinó a 25 °C y 40 °C utilizando sustratos de curdlan y cebada β-1,3-1,4-glucano. Además, se determinó el modo de acción de la β-1,3-glucanasa utilizando laminaribiosa a laminaripentaosa. Los patrones de productos de hidrólisis de oligosacáridos se analizaron cualitativamente con cromatografía en capa fina (TLC) y cuantitativamente con HPLC. El método presentado en este estudio demuestra un enfoque robusto para infestar trigo con RWA, extrayendo peroxidasa y β-1,3-glucanasa de la región de la pared celular y su caracterización bioquímica integral.

Introducción

Los pulgones rusos del trigo (APR) infestan el trigo y la cebada, causando una pérdida significativa de rendimiento o una reducción de la calidad del grano. El trigo responde a la infestación induciendo varias respuestas de defensa, incluyendo el aumento de los niveles de actividad de la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa en los cultivares resistentes, mientras que los cultivares susceptibles reducen la actividad de estas enzimas en el período de infestación temprano 1,2,3,4. Las funciones clave de la β-1,3-glucanasa y la POD en la planta de tr....

Protocolo

El estudio se realizó con la aprobación y permiso del Comité de Ética en Investigación en Medio Ambiente y Bioseguridad de la Universidad del Estado Libre (UFS-ESD2022/0131/22). Los detalles de los reactivos y el equipo aquí se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Condiciones de crecimiento de las plantas

1. Germinar 250 semillas de cada cultivar de trigo, es decir, Tugela susceptible, Tugela-Dn1 moderadamente resistente y Tugela-Dn5 resistente, en placas de Petri separadas.
2. Añadir 5 mL de agua destilada en cada placa de Petri, sellar con una película de parafina e incub....

Discusión

El trigo y la cebada son cultivos de cereales frecuentemente infestados por especies de pulgones, incluyendo el pulgón ruso del trigo (Diuraphis noxia)^7,24. Las plantas de trigo resistentes inducen la regulación positiva de las actividades de POD y β-1,3-glucanasa como respuestas de defensa durante todo el período de infestación para modificar la pared celular mediante la regulación de la acumulación de calosa y lignina

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.