Выяснение #946;-1,3-глюканаза и пероксидаза физико-химических свойств защитного механизма клеточной стенки пшеницы против заражения Diuraphis noxia

Резюме

В настоящем протоколе описаны процедуры, используемые для изучения и характеристики ферментов, связанных с клеточной стенкой, главным образом β-1,3-глюканазы и пероксидазы, в растениях пшеницы. Уровень их активности увеличивается во время взаимодействия пшеницы и RWA и участвует в защитной реакции растений через укрепление клеточной стенки, что препятствует питанию тлей.

Аннотация

Растения пшеницы, зараженные российской пшеничной тлей (RWA), вызывают каскад защитных реакций, включая гиперчувствительные реакции (HR) и индукцию белков, связанных с патогенезом (PR), таких как β-1,3-глюканаза и пероксидаза (POD). Целью данного исследования является характеристика физико-химических свойств ассоциированных с клеточной стенкой POD и β-1,3-глюканазы и определение их синергизма на модификацию клеточной стенки при взаимодействии RWASA2-пшеницы. Восприимчивые сорта Tugela, умеренно устойчивые Tugela-Dn1 и устойчивые Tugela-Dn5 были предварительно проращены и высажены в тепличных условиях, удобрены через 14 дней после посадки и орошены каждые 3 дня. Растения были заражены 20 партеногенетическими особями того же клона RWASA2 на стадии 3 листьев, а листья были собраны через 1-14 дней после заражения. Межклеточную промывочную жидкость (IWF) экстрагировали с помощью вакуумной фильтрации и хранили при температуре -20 °C. Остатки листьев измельчали в порошок и использовали в качестве компонентов клеточной стенки. Активность и характеристика POD определяли с использованием субстрата гваякола 5 мМ и H₂O₂, отслеживая изменение абсорбции при длине волны 470 нм. Активность β-1,3-глюканазы, рН и оптимальные температурные условия были продемонстрированы путем измерения общего редуцирующих сахаров в гидролизате реагентом DNS с использованием субстратов β-1,3-глюкана и β-1,3-1,4-глюкана, измерения абсорбции при 540 нм и использования стандартной кривой глюкозы. Оптимум pH определяли в диапазоне от pH 4 до 9, температурный оптимум от 25 до 50 °C и термостабильность в диапазоне от 30 °C до 70 °C. Специфичность субстрата β-1,3-глюканазы определяли при 25 °C и 40 °C с использованием субстратов из творожного и ячменного β-1,3-1,4-глюкана. Кроме того, определяли механизм действия β-1,3-глюканазы с помощью ламинарибиозы к ламинарипентаозе. Картины продуктов гидролиза олигосахаридов были качественно проанализированы с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) и количественно проанализированы с помощью ВЭЖХ. Метод, представленный в данном исследовании, демонстрирует надежный подход к заражению пшеницы RWA, экстракцию пероксидазы и β-1,3-глюканазы из области клеточной стенки и их всестороннюю биохимическую характеристику.

Введение

Российская пшеничная тля (RWA) поражает пшеницу и ячмень, вызывая значительные потери урожая или снижение качества зерна. Пшеница реагирует на заражение, вызывая несколько защитных реакций, включая повышение уровня активности β-1,3-глюканазы и пероксидазы у устойчивых сортов, в то время как восприимчивые сорта снижают активность этих ферментов в ранний период заражения 1,2,3,4. Ключевыми функциями β-1,3-глюканазы и POD в растении пшеницы являлись регулирование накопления каллозы в устойчивых сортах и гашение активных форм кислорода (АФК) в к....

протокол

Исследование проводилось с одобрения и разрешения Комитета по этике исследований в области окружающей среды и биобезопасности Университета Фри-Стейт (UFS-ESD2022/0131/22). Подробная информация о реагентах и оборудовании здесь указана в Таблице материалов.

1. Условия роста растений

1. Прорастите по 250 семян каждого сорта пшеницы, т.е. восприимчивой Tugela, умеренно устойчивой Tugela-Dn1 и устойчивой Tugela-Dn5, в отдельных чашках Петри.
2. Добавьте 5 мл дистиллированной воды в каждую чашку Петри, запечатайте парафиновой пленкой и выдерживайте в камере для проращивания при тем....

Результаты

Четыре биологических репликатора сортов пшеницы (Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn5) были заражены RWASA2 на стадии роста трех листьев. После заражения листья собирали при 1-, 2-, 3-, 7- и 14 dpi. Контрольные обработки не были заражены RWASA2, что сделало результаты эксперимента сопоставимыми с растениями п.......

Обсуждение

Пшеница и ячмень – зерновые культуры, часто зараженные видами тлей, в том числе русской пшеничной тлей (Diuraphis noxia)^7,24. Устойчивые растения пшеницы индуцируют повышение активности POD и β-1,3-глюканазы в качестве защитных реакций на протяжении всего перио.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.