Elucidando # 946; -1,3-glucanase e propriedades físico-químicas da peroxidase do mecanismo de defesa da parede celular do trigo contra a infestação por Diuraphis noxia

Resumo

O presente protocolo descreve procedimentos utilizados para estudar e caracterizar enzimas relacionadas à parede celular, principalmente β-1,3-glucanase e peroxidase, em plantas de trigo. Seus níveis de atividade aumentam durante a interação trigo-RWA e estão envolvidos na resposta de defesa da planta por meio do reforço da parede celular, o que impede a alimentação de pulgões.

Resumo

Plantas de trigo infestadas por pulgões do trigo russo (RWA) induzem uma cascata de respostas de defesa, incluindo as respostas de hipersensibilidade (HR) e indução de proteínas relacionadas à patogênese (PR), como β-1,3-glucanase e peroxidase (POD). Este estudo tem como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas do POD associado à parede celular e da β-1,3-glucanase e determinar seu sinergismo na modificação da parede celular durante a interação RWASA2-trigo. As cultivares suscetíveis Tugela, moderadamente resistente Tugela-Dn1 e resistente Tugela-Dn5 foram pré-germinadas e plantadas em casa de vegetação, adubadas 14 dias após o plantio e irrigadas a cada 3 dias. As plantas foram infestadas com 20 indivíduos partenogenéticos do mesmo clone RWASA2 no estádio de 3 folhas, e as folhas foram colhidas de 1 a 14 dias após a infestação. O fluido de lavagem intercelular (IWF) foi extraído por filtração a vácuo e armazenado a -20 °C. Os resíduos das folhas foram triturados em pó e usados para componentes da parede celular. A atividade e caracterização do POD foram determinadas usando substrato de guaiacol 5 mM e H₂O₂, monitorando a mudança na absorbância a 470 nm. A atividade da β-1,3-glucanase, o pH e as condições ótimas de temperatura foram demonstrados medindo-se os açúcares redutores totais no hidrolisado com reagente DNS usando substratos de β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, medindo a absorbância a 540 nm e usando a curva padrão de glicose. O pH ótimo foi determinado entre pH 4 a 9, temperatura ótima entre 25 e 50 °C e estabilidade térmica entre 30 °C e 70 °C. A especificidade do substrato β-1,3-glucanase foi determinada a 25 °C e 40 °C usando substratos de coalhada e cevada β-1,3-1,4-glucana. Além disso, o modo de ação da β-1,3-glucanase foi determinado usando laminaribiose para laminaripentaose. Os padrões do produto de hidrólise de oligossacarídeos foram analisados qualitativamente com cromatografia em camada delgada (TLC) e quantitativamente analisados com HPLC. O método apresentado neste estudo demonstra uma abordagem robusta para infestar trigo com RWA, extração de peroxidase e β-1,3-glucanase da região da parede celular e sua caracterização bioquímica abrangente.

Introdução

Os pulgões do trigo russo (RWA) infestam o trigo e a cevada, causando perda significativa de rendimento ou redução da qualidade do grão. O trigo responde à infestação induzindo várias respostas de defesa, incluindo o aumento dos níveis de atividade da β-1,3-glucanase e peroxidase nas cultivares resistentes, enquanto as cultivares suscetíveis reduzem a atividade dessas enzimas no período inicial da infestação 1,2,3,4. As principais funções da β-1,3-glucanase e POD na planta de trigo incluíram a regulação do acúmulo de calose na cultivar resis....

Protocolo

O estudo foi conduzido com a aprovação e permissão do Comitê de Ética em Pesquisa Ambiental e de Biossegurança da Universidade do Estado Livre (UFS-ESD2022/0131/22). Os detalhes dos reagentes e do equipamento aqui estão listados na Tabela de Materiais.

1. Condições de crescimento das plantas

1. Germinar 250 sementes de cada cultivar de trigo, ou seja, Tugela suscetível, Tugela-Dn1 moderadamente resistente e Tugela-Dn5 resistente, em placas de Petri separadas.
2. Adicione 5 mL de água destilada em cada placa de Petri, sele com um filme de parafina e incube na câmara de germina....

Discussão

O trigo e a cevada são culturas de cereais frequentemente infestadas por espécies de pulgões, incluindo pulgões russos do trigo (Diuraphis noxia)^7,24. Plantas de trigo resistentes induzem a regulação positiva das atividades de POD e β-1,3-glucanase como respostas de defesa durante todo o período de infestação para modificar a parede celular regulando o acúmulo de calose e lignina 6,25,.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.