Elucidando # 946; -1,3-glucanase e propriedades físico-químicas da peroxidase do mecanismo de defesa da parede celular do trigo contra a infestação por Diuraphis noxia

Resumo

O presente protocolo descreve procedimentos utilizados para estudar e caracterizar enzimas relacionadas à parede celular, principalmente β-1,3-glucanase e peroxidase, em plantas de trigo. Seus níveis de atividade aumentam durante a interação trigo-RWA e estão envolvidos na resposta de defesa da planta por meio do reforço da parede celular, o que impede a alimentação de pulgões.

Resumo

Plantas de trigo infestadas por pulgões do trigo russo (RWA) induzem uma cascata de respostas de defesa, incluindo as respostas de hipersensibilidade (HR) e indução de proteínas relacionadas à patogênese (PR), como β-1,3-glucanase e peroxidase (POD). Este estudo tem como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas do POD associado à parede celular e da β-1,3-glucanase e determinar seu sinergismo na modificação da parede celular durante a interação RWASA2-trigo. As cultivares suscetíveis Tugela, moderadamente resistente Tugela-Dn1 e resistente Tugela-Dn5 foram pré-germinadas e plantadas em casa de vegetação, adubadas 14 dias após o plantio e irrigadas a cada 3 dias. As plantas foram infestadas com 20 indivíduos partenogenéticos do mesmo clone RWASA2 no estádio de 3 folhas, e as folhas foram colhidas de 1 a 14 dias após a infestação. O fluido de lavagem intercelular (IWF) foi extraído por filtração a vácuo e armazenado a -20 °C. Os resíduos das folhas foram triturados em pó e usados para componentes da parede celular. A atividade e caracterização do POD foram determinadas usando substrato de guaiacol 5 mM e H₂O₂, monitorando a mudança na absorbância a 470 nm. A atividade da β-1,3-glucanase, o pH e as condições ótimas de temperatura foram demonstrados medindo-se os açúcares redutores totais no hidrolisado com reagente DNS usando substratos de β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, medindo a absorbância a 540 nm e usando a curva padrão de glicose. O pH ótimo foi determinado entre pH 4 a 9, temperatura ótima entre 25 e 50 °C e estabilidade térmica entre 30 °C e 70 °C. A especificidade do substrato β-1,3-glucanase foi determinada a 25 °C e 40 °C usando substratos de coalhada e cevada β-1,3-1,4-glucana. Além disso, o modo de ação da β-1,3-glucanase foi determinado usando laminaribiose para laminaripentaose. Os padrões do produto de hidrólise de oligossacarídeos foram analisados qualitativamente com cromatografia em camada delgada (TLC) e quantitativamente analisados com HPLC. O método apresentado neste estudo demonstra uma abordagem robusta para infestar trigo com RWA, extração de peroxidase e β-1,3-glucanase da região da parede celular e sua caracterização bioquímica abrangente.

Introdução

Os pulgões do trigo russo (RWA) infestam o trigo e a cevada, causando perda significativa de rendimento ou redução da qualidade do grão. O trigo responde à infestação induzindo várias respostas de defesa, incluindo o aumento dos níveis de atividade da β-1,3-glucanase e peroxidase nas cultivares resistentes, enquanto as cultivares suscetíveis reduzem a atividade dessas enzimas no período inicial da infestação 1,2,3,4. As principais funções da β-1,3-glucanase e POD na planta de trigo incluíram a regulação do acúmulo de calose na cultivar resistente e a extinção de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular e regiões apoplásticas durante a infestação por RWA 1,3,5,6,7. Mafa et ^al.6 demonstraram que houve uma forte correlação entre o aumento da atividade do POD e o aumento do teor de lignina na cultivar de trigo resistente após infestações por RWASA2. Além disso, o aumento do teor de lignina indicou que a parede celular da cultivar de trigo resistente infestada foi reforçada, levando à redução da alimentação com RWA.

A maioria dos grupos de pesquisadores extraiu e estudou a β-1,3-glucanase apoplástica e a POD durante a interação trigo/cevada-RWA; além disso, a maioria desses estudos afirmou que essas enzimas influenciam a parede celular da planta de trigo infestada com RWA sem medir a presença da enzima na região da parede celular. Apenas alguns estudos usaram técnicas microscópicas para mostrar que os níveis de atividade da β-1,3-glucanase estavam ligados à regulação da calose ^7,8,9 ou extraíram os principais componentes da parede celular para demonstrar a correlação entre as atividades do POD e a modificação da parede celular no resistente ^6,10. A falta de sondagem da associação β-1,3-glucanase e POD à parede celular indica a necessidade de desenvolver métodos que permitam aos pesquisadores medir diretamente as enzimas ligadas à parede celular.

O método atual propõe que é necessário remover o fluido apoplástico do tecido foliar antes de extrair as enzimas ligadas à parede celular. O procedimento de extração do fluido apoplástico deve ser realizado duas vezes do tecido foliar, que é usado para extrair as enzimas ligadas à parede celular. Esse processo reduz a contaminação e a confusão das enzimas apoplásticas com as encontradas nas regiões da parede celular. Assim, neste estudo, extraímos POD ligado à parede celular, β-1,3-glucanase e β-glucanase específica para MLG e realizamos sua caracterização bioquímica.

Protocolo

O estudo foi conduzido com a aprovação e permissão do Comitê de Ética em Pesquisa Ambiental e de Biossegurança da Universidade do Estado Livre (UFS-ESD2022/0131/22). Os detalhes dos reagentes e do equipamento aqui estão listados na Tabela de Materiais.

1. Condições de crescimento das plantas

1. Germinar 250 sementes de cada cultivar de trigo, ou seja, Tugela suscetível, Tugela-Dn1 moderadamente resistente e Tugela-Dn5 resistente, em placas de Petri separadas.
2. Adicione 5 mL de água destilada em cada placa de Petri, sele com um filme de parafina e incube na câmara de germinação regulada a 25 ° C por 2 dias.
3. Transplante as sementes germinadas de cada cultivar em vasos de 15 cm contendo solo 1:1 e turfa (15 plantas por vaso) em condições controladas de estufa.
4. Defina os regimes de temperatura em 18 °C e 24 °C durante a noite e o dia, respectivamente.
5. Irrigue as plantas a cada 3 dias com água da torneira e forneça 2 g/L de fertilizante 14 dias após a germinação.
6. Colocar as plantas em gaiolas envoltas em redes e deixá-las crescer até ao estágio ^2,6 da terceira folha (com quatro repetições biológicas de cada cultivar).

2. Infestação de cultivares de trigo com RWASA2

1. Infestar as cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 com RWASA2 de acordo com Jimoh et ^al.11 e Mohase e Taiwe¹².
2. Mantenha as plantas em dois conjuntos separados em gaiolas; infestar um conjunto com 20 indivíduos partenogenéticos do mesmo clone RWASA2 por planta em cada vaso nas câmaras de crescimento cobertas com redes. Mantenha outro conjunto de plantas de trigo em uma sala separada sob a câmara de crescimento com redes limpas e trate-as como controles.
   NOTA: Mantenha os dois tratamentos em salas separadas e cubra as plantas em gaiolas envoltas em redes. Além disso, no caso de dois biótipos diferentes de RWA serem usados em um estudo, manter as plantas infestadas com um biótipo RWA daquelas infestadas com o segundo biótipo, tanto quanto possível ou em salas separadas sob câmaras de crescimento cobertas com redes para evitar qualquer possível contaminação cruzada do RWASA2.
3. Para a colheita, selecione a segunda e a terceira folhas em dois regimes de tempo diferentes, período de alimentação de curto prazo (1, 2 e 3 dias) e período de alimentação de longo prazo (7 e 14 dias), e embrulhe-as em papel toalha úmido.
4. Transfira imediatamente as folhas colhidas para uma caixa contendo gelo para reduzir o metabolismo das folhas antes da extração do fluido de lavagem intercelular (IWF).

3. Extração do fluido de lavagem intercelular (IWF) do apoplasto

1. Corte as folhas colhidas de cerca de três cultivares de trigo em pedaços de 7 cm.
2. Enxágue os pedaços de folhas duas vezes em água destilada para remover qualquer contaminação citosólica das extremidades cortadas ^6,13.
3. Insira os pedaços de folha em um tubo de vidro de parede espessa e mergulhe as amostras em tampão de extração (50 mM Tris-HCl, pH 7,8).
4. Aplique a infiltração a vácuo por 5 min usando uma bomba de jato de água para impregnar as folhas com o tampão de extração.
5. Em seguida, remova os pedaços de folhas do tubo de vidro e seque-os com uma toalha de papel.
6. Inserir os pedaços de folhas secas verticalmente em tubos de centrifugação pré-arrefecidos equipados com discos perfurados e centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 °C.
7. Use uma pipeta de 100 μL para coletar o sobrenadante em tubos de microcentrífuga pré-resfriados de 1,5 mL.
8. Repita todo o procedimento de extração com o mesmo material foliar.
9. Combine o sobrenadante coletado e armazene-o a -20 ° C.
   NOTA: As alíquotas sobrenadantes são tratadas como a fonte do conteúdo de apoplast ou IWF. A IWF não foi usada no presente estudo, mas foi importante removê-la dos tecidos foliares antes de extrairmos a β-1,3-glucanase e peroxidase (POD) ligadas à parede celular.

4. Extração da β-1,3-glucanase associada à parede celular e POD

NOTA: Os resíduos foliares deixados após a extração da IWF foram utilizados para extrair a proteína total da parede celular.

1. Esmague os resíduos das folhas até formar um pó fino com nitrogênio líquido usando um almofariz e pilão.
2. Transferir aproximadamente 200 mg do tecido foliar em pó para um almofariz contendo 4 mL de tampão de extração (fosfato de sódio 50 mM com 1% (p/v) de polivinilpolipirrolidona (PVPP); pH 5,0) seguido de moagem com um pilão até obter uma pasta lisa, que é então transferida para tubos de microcentrífuga.
3. Incube a mistura nos tubos de microcentrífuga por 3 min em gelo e depois centrifugue a 10.000 x g por 15 min a 4 °C.
4. Colete o sobrenadante (extratos de proteínas totais) em tubos de microcentrífuga (alíquotas de 2 mL) e use-o como fonte de β-1,3-glucanase e POD para todo o estudo.

5. Determinação do padrão proteico

1. Determinar a concentração total de proteínas dos extractos segundo o método de Bradford¹⁴.
2. Preparar as soluções de albumina de soro bovino (BSA) nas concentrações de 0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml e 1,0 mg/ml dissolvidos em tampão fosfato de sódio 50 mM para gerar o padrão proteico.
3. Prepare o padrão adicionando 10 μL de cada solução BSA na microplaca de 96 poços com 190 μL (0,25% v/v) de reagente de Bradford (consulte a Tabela de Materiais).
4. Incubar a 25 °C durante 20 min e medir a absorvância a 595 nm utilizando o leitor de microplacas e utilizar os valores de absorvância para preparar a curva-padrão para quantificar a concentração de proteínas.
5. Quantifique a concentração de proteína
   1. Adicione 10 μL da enzima extraída (etapa 4) em uma microplaca de 96 poços com 190 μL (0,25% v / v) de reagente de Bradford em triplicatas.
   2. Incubar à temperatura ambiente (25 °C) durante 20 min.
   3. Medir a absorvância a 595 nm utilizando o espectrofotómetro com um leitor de microplacas e utilizar os valores de absorvância para determinar a concentração de proteínas utilizando a BSA como padrão de proteínas (preparada no passo 5.4).

6. Prepare o padrão de glicose para a atividade da β-1,3-glucanase

1. Prepare as soluções-padrão com concentrações entre 0,00 mg/ml e 1,0 mg/ml (0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml) com glicose dissolvida em água destilada.
2. Adicione 300 μL de cada solução de glicose e 600 μL de reagente de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) na proporção de 1:2 em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e incube as reações a 100 °C por 5 min (ver Tabela de Materiais para reagentes DNS) (Miller et al.15).
3. Deixar arrefecer a mistura à temperatura ambiente antes de medir a absorvância a 540 nm com o espectrofotómetro.
4. Utilizar os valores médios de absorvância para desenvolver a curva-padrão para determinar a actividade da enzima β-1,3-glucanase.

7. Determinação do ensaio de atividade da β-1,3-glucanase

NOTA: A atividade enzimática da β-1,3-glucanase ligada à parede celular extraída de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 foi determinada pela quantidade de açúcares redutores totais liberados da hidrólise de 0,5% (p/v) de substratos ligados a 0,5% (p/v) de β-1,3-1,4-glucano (MLG) e 0,4% (p/v) de β-1,3-glucano usando um método modificado conforme descrito por Miller et ^al.15. Mantenha sempre os tubos com alíquotas de proteína no gelo. Se as amostras foram congeladas, descongele-as no gelo e proceda imediatamente após o descongelamento.

1. Adicionar 200 μL do extrato enzimático (manter a concentração proteica entre 20 μg/ml e 90 μg/ml em todas as reações, salvo indicação em contrário) e 300 μL do substrato dissolvido em tampão citrato de sódio 50 mM (pH 5,0) nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Execute uma reação paralela em branco sem o extrato enzimático para todos os substratos (primeiro branco), e o branco da enzima consiste em extrato enzimático sem substrato (segundo branco). Tanto o substrato quanto o extrato enzimático foram substituídos pelo tampão no primeiro e segundo negros, respectivamente.
2. Incubar as reações a 37 °C por 24 h e encerrar a reação aquecendo a 100 °C por 5 min, depois centrifugar a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
3. Misture 300 μL do sobrenadante com 600 μL de reagente DNS (proporção 1:2) em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e ferva a 100 °C por 5 min.
4. Deixar arrefecer a solução até à temperatura ambiente e medir a absorvância a 540 nm com o espectrofotómetro.
   NOTA: Se a concentração de açúcares redutores totais for alta na mistura, isso resultará em uma solução marrom-escura, que é difícil de ler usando o espectrofotômetro. Portanto, é necessária uma diluição adicional das amostras antes da leitura da absorbância.
5. Use a curva padrão de glicose desenvolvida na etapa 6.4 acima para determinar a atividade enzimática nas unidades SI da curva padrão.
6. Para converter a atividade em uma atividade específica que é expressa em μmol glicose/h/mg de proteína, use a equação abaixo:
   Atividade específica = [(atividade enzimática/180.16)*1000]/tempo/concentração de proteína
   NOTA: Converta a atividade enzimática em mg/mL em g/mL; 180,16 g/mol é o peso molecular da glicose, 1000 é um fator que converte M em micromoles, o tempo é o período de reação e a concentração do extrato proteico é representada em mg/mL. Uma unidade de atividade da β-1,3-glucanase é definida como 1 μmol de glicose liberada do substrato dentro de um período de reação de 1 h.

8. Determinando a atividade da peroxidase (POD)

NOTA: A atividade da peroxidase ligada à parede celular das cultivares de trigo Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 foi determinada quantificando a formação do tetra-guaiacol produzido por unidade de tempo a partir do guaiacol¹⁶.

1. Adicionar 30 μL do extracto enzimático, 30 μL 1% (v/v) H₂O₂ e 970 μL de guaiacol 5 mM nas cubetas a 25 °C.
   NOTA: Faça a reação em branco sem o extrato enzimático (primeiro branco) e outra em branco para amostras de enzimas sem substrato (segundo branco). As amostras de enzima ou substrato foram substituídas por tampão fosfato de sódio 50 mM no primeiro e segundo brancos, respectivamente.
2. Utilizar o modo cinético do espectrofotómetro para monitorizar a variação da absorvância a 470 nm.
3. Determine a inclinação onde o gráfico era linear e use-o como o valor de absorbância.
4. Calcule a absorbância média e use-a no cálculo da atividade do POD.
5. Calcular a atividade da peroxidase utilizando o coeficiente de extinção molar do guaiacol (26,6 ^{mM-1 cm-1}) e expressar a atividade em μmol tetra-guaiacol/min/mg de proteína.
6. Calcule a atividade do POD usando a equação usada por Mafa et ^al.6:
   ATIVIDADE DA CÁPSULA = [(ΔABS × DF) ÷ Concentração de proteína] × 26,6 ^{mM-1 cm-1} × 1 cm
   NOTA: Onde ΔABS = absorbância média; DF = Factor de diluição; 26,6 ^{mM-1 cm-1} = coeficiente de extinção do guaiacol.

9. Caracterização do POD

NOTA: Os ensaios de caracterização de POD foram conduzidos usando extratos enzimáticos 3 dias pós-infestação (dpi) de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 seguindo métodos semelhantes descritos na etapa 8, com pequenas alterações nos tampões de reação e temperaturas. As amostras de enzimas foram sempre mantidas no gelo enquanto os experimentos estavam sendo conduzidos. Execute as reações em quadruplicados com uma reação paralela em branco.

1. Para ensaios de pH ideais, execute as etapas a seguir.
   1. Dissolva o substrato de guaiacol em tampões de 50 mM (citrato de sódio, pH 4 e 5), fosfato de sódio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9) (ver Tabela de Materiais).
   2. Execute as reações a 25 °C conforme descrito na etapa 8.
2. Para ensaios de temperatura ideais, execute as etapas a seguir.
   1. Execute as reações a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C, respectivamente.
   2. Use substrato de guaiacol dissolvido no tampão pH 5 (pH ótimo) e execute as reações conforme descrito na etapa 8.
3. Para ensaios de termoestabilidade, execute as etapas a seguir.
   1. Antes de iniciar as reações, incube a enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C por 30 min.
   2. Executar as reacções de acordo com os métodos descritos na etapa 8, utilizando tampão citrato de sódio a 50 mM (pH 5) e a 40 °C (temperatura ótima).

10. Caracterização da β-1,3-glucanase

NOTA: Realizar os ensaios de caracterização seguindo o método descrito na etapa 7 usando extratos enzimáticos de 3 dpi, com algumas modificações nos tampões de reação e temperaturas. Execute as reações em quadruplicados, com uma reação em branco paralela para cada substrato.

1. Para ensaios de pH ideais, proceda da seguinte forma:
   1. Dissolva os substratos MLG e β-1,3-glucano em tampões 50 mM (citrato de sódio, pH 4 e 5), fosfato de sódio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9).
   2. Execute a reação conforme descrito na etapa 7.
2. Para ensaios de temperatura óptimos, proceda da seguinte forma:
   1. Execute as reações a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C, respectivamente.
   2. Utilizar substratos MLG e β-1,3-glucano dissolvidos no tampão citrato de sódio 50 mM (pH 5) com pH óptimo (obtido no passo 10.1) e executar as reacções como descrito no passo 7.
3. Para os ensaios de termoestabilidade, proceder da seguinte forma:
   1. Antes de iniciar as reações, incube a enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C por 30 min.
   2. Executar as reacções utilizando substratos dissolvidos em tampão citrato de sódio a 50 mM (pH 5) e incubar a 25 °C e 40 °C durante 24 h.

11. Avaliação do mecanismo de ação da β-1,3-glucanase em diferentes substratos de glucano

NOTA: Os substratos de glucano contêm o mesmo resíduo de glicose em sua espinha dorsal, mas as ligações glicosídicas entre as unidades de glicopiranose são diversas e podem assumir a orientação α ou β¹⁷. As ligações glicosídicas podem se formar entre vários átomos de carbono de moléculas de glicose, definindo sua estrutura química, por exemplo, β-1,3-glucano, β-1,4-glucano e β-1,3-1,4-glucano ligado misto (MLG) ^{18 , 19 , 20} . O mecanismo de ação da β-1,3-glucanase foi determinado usando amostras de Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn 5 infestadas por RWASA2 (fontes de enzimas) e os seguintes substratos β-1,3-glucano (CM-coalhada), MLG (de cevada) e β-1,4-glucano (AZO-CM-Celulose). O mecanismo de ação é determinado em condições ótimas de ensaio (25 °C e 40 °C, pH 5,0), usando 0,1% (p/v) β-1,4-glucano, 0,4% (p/v) β-1,3-glucano ou 0,5% (p/v) substratos MLG.

1. Dissolver os substratos em tampão citrato de sódio a 50 mM (pH 5).
2. Adicione 200 μL do extrato enzimático e 300 μL do substrato nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Incubar as reações em duas temperaturas separadas, 25 °C e 40 °C por 8 h.
4. Término das reações por aquecimento a 100 °C.
5. Centrifugue a mistura de reação de β-1,3-glucano e MLG a 10.000 x g por 10 min a 4 °C e proceda conforme descrito na etapa 7.3.
6. Para β-1,4-glucano, após terminar a reação a 100 °C, diluir a mistura com 800 μL de etanol absoluto e centrifugar a 4 °C por 10 min a 10.000 x g.
7. Transferir o sobrenadante para as curvas, medir a absorvância a 590 nm com o espectrofotómetro e calcular a actividade da β-1,3-glucanase no β-1,4-glucano utilizando o procedimento do fabricante (ver quadro de materiais) e exprimir a actividade em unidades/mg de proteína.

12. Determinando o modo de ação da β-1,3-glucanase

NOTA: O modo de ação da β-1,3-glucanase induzido por Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestado com RWASA2 foi testado com laminarina-oligossacarídeos (LAMs) com o grau de polimerização (DP) entre 5 e 2. Use cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) e kit de glicose oxidase peroxidase (GOPOD) para determinar o DP necessário para que a β-1,3-glucanase hidrolise o substrato. A CCD foi utilizada para análise qualitativa e a LC-MS para análise quantitativa, que determinou a concentração dos oligossacarídeos no hidrolisado após a reação²¹.

1. Prepare as reações do modo de ação β-1,3-glucanase
   NOTA: Prepare o extrato de proteína concentrado com um filtro de membrana concentrador de centrífuga de 10 kDa e, portanto, tenha extratos de proteína infestados de RWASA2 concentrados e não concentrados para o experimento.
   1. Para concentrar as enzimas extraídas de cada cultivar, transferir 5 mL dos extratos para os filtros de membrana concentradores centrífuga de 10 kDa.
   2. Centrifugar os tubos filtrantes de membrana contendo o extracto a 15.000 x g durante 30 min a 4 °C.
   3. Dissolva a laminaripentaose (LAM5), a laminaritetraose (LAM4), a laminaritriose (LAM3) e a laminaribiose (LAM2) (consulte a Tabela de Materiais) em citrato de sódio 50 mM (pH 5) para fazer 10 mg / mL.
   4. Para iniciar a reação, adicione 20 μL do extrato proteico e 40 μL de Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3) e Laminaribiose (LAM2).
   5. Incubar a reação a 40 °C durante 16 h e terminar fervendo a 100 °C durante 5 min.
2. Realize cromatografia em camada fina (TLC)
   1. Corte 4 placas de sílica em pedaços de 10 cm² e desenhe uma linha na superfície da placa, deixando 1 cm de espaço na parte inferior de uma das bordas.
   2. Marque os pontos sobre a linha e marque-os de acordo com diferentes cultivares e DP dos oligossacarídeos laminarinos, separados por 1 cm e. Pegue 2 placas de sílica para extrato de proteína concentrado e as outras 2 para extratos não concentrados.
   3. Adicione 3 μL das misturas de reação 3 a 5 vezes sobre os pontos marcados correspondentes na placa de sílica e deixe os pontos na placa secarem completamente antes de repetir o processo.
   4. Coloque delicadamente as placas de sílica no tanque de TLC contendo a fase móvel de n-butanol: ácido acético: água (2:1:1 v/v/v) com o lado contendo as manchas das amostras na parte inferior.
   5. Deixe a fase móvel se mover da parte inferior para a parte superior da placa.
      NOTA: Esta etapa pode levar aproximadamente 2 h. Não mova ou perturbe o tanque enquanto as amostras estiverem se separando.
   6. Retire as placas da fase móvel e deixe-as secar à temperatura ambiente.
   7. Adicione a solução de coloração no recipiente pequeno, mergulhe suavemente a placa de sílica na solução de coloração de naftol a 0,3% (p / v) em etanol a 95% (v / v) usando ácido sulfúrico a 5% (v / v) por 5 s, remova-o e deixe-o secar em temperatura ambiente.
      NOTA: Nesta etapa, ligue o bloco de aquecimento/forno e ajuste a temperatura para 100 °C.
   8. Coloque as placas de sílica secas no bloco de aquecimento e aqueça a 100 °C por 7-10 min ou até que as manchas azul-violeta apareçam. Tire fotos das placas de sílica mostrando as manchas azul-violeta e documente-as.
3. Quantificar a concentração de hidrolisados de oligossacarídeos laminarinos
   NOTA: A concentração dos hidrolisados de LAM será quantificada para extratos proteicos concentrados e não concentrados²¹.
   1. Adicionar 20 μL de cada amostra numa coluna de C18 (hidratos de carbono 4,6 × 250 mm) e deixar separar a um caudal de 500 μL/min utilizando um gradiente de água (solvente A) e acetonitrila (solvente B) de 100% B a 60% B durante 10 min, seguido de etapas de reequilíbrio da coluna com um tempo total de execução de 20 min para permitir o reequilíbrio da coluna.
   2. Ionizar as substâncias a analisar em modo de eletropulverização negativo na fonte iónica de espectrometria de massa com uma temperatura de aquecimento de 400 °C para evaporar o excesso de solvente, gás nebulizador de 30 psi, gás aquecedor de 30 psi e gás de cortina de 20 psi.
   3. Defina o potencial de desagrupamento em 350 V.
   4. Analisar as substâncias a analisar no espectrómetro de massa num modo de varrimento Q1 que varia entre 150 Da e 1000 Da com um tempo de permanência de 3 s.
   5. Registar as concentrações das substâncias a analisar na folha de cálculo.
4. Quantifique a concentração de glicose
   1. Analisar a concentração de glicose produzida pela hidrólise da laminarina utilizando o reagente GOPOD, seguindo as instruções do fabricante^22,23.
   2. Medir a absorvância a 510 nm num modo fixo do espectrofotómetro.

13. Coleta e análise dos dados

1. Randomize todos os experimentos para evitar viés durante a infestação ou coleta de amostras e conduza a análise em quadruplicados.
2. Salvo indicação em contrário, use as médias ± desvio padrão para representar os valores nos gráficos e tabelas gerados a partir dos dados experimentais coletados.
3. Use o Microsoft Excel para analisar todos os dados e gerar gráficos.
4. Realize análises estatísticas com software compatível.
   NOTA: Realize a Análise Multifatorial de Variância (ANOVA) para testar a significância entre os tratamentos e o LSD de Fisher para testar grupos homogêneos em um valor alfa de 0,05.

Resultados

Quatro repetições biológicas de cultivares de trigo (Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5) foram infestadas com RWASA2 no estádio de crescimento de 3 folhas. Após a infestação, as folhas foram colhidas em 1, 2, 3, 7 e 14 dpi. Os tratamentos controle não foram infestados com RWASA2 para tornar os resultados do experimento comparáveis aos de plantas de trigo não expostas ao estresse. Os experimentos foram conduzidos em quadruplicados, e os resultados foram apresentados como valores médios.

Discussão

O trigo e a cevada são culturas de cereais frequentemente infestadas por espécies de pulgões, incluindo pulgões russos do trigo (Diuraphis noxia)^7,24. Plantas de trigo resistentes induzem a regulação positiva das atividades de POD e β-1,3-glucanase como respostas de defesa durante todo o período de infestação para modificar a parede celular regulando o acúmulo de calose e lignina 6,25,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.