Élucidation des propriétés physicochimiques de la #946 ;-1,3-glucanase et de la peroxydase du mécanisme de défense de la paroi cellulaire du blé contre l’infestation par Diuraphis noxia

Résumé

Le présent protocole décrit les procédures utilisées pour étudier et caractériser les enzymes liées à la paroi cellulaire, principalement la β-1,3-glucanase et la peroxydase, chez les plants de blé. Leurs niveaux d’activité augmentent lors de l’interaction blé-RWA et sont impliqués dans la réponse de défense des plantes par le renforcement de la paroi cellulaire, ce qui dissuade l’alimentation des pucerons.

Résumé

Les plants de blé infestés par des pucerons russes du blé (RWA) induisent une cascade de réponses de défense, y compris les réponses d’hypersensibilité (HR) et l’induction de protéines liées à la pathogenèse (PR), telles que la β-1,3-glucanase et la peroxydase (POD). Cette étude vise à caractériser les propriétés physicochimiques de la POD et de la β-1,3-glucanase associées à la paroi cellulaire et à déterminer leur synergie sur la modification de la paroi cellulaire lors de l’interaction RWASA2-blé. Les cultivars sensibles Tugela, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant ont été prégermés et plantés en serre, fertilisés 14 jours après la plantation et irrigués tous les 3 jours. Les plantes ont été infestées de 20 individus parthénogénétiques du même clone RWASA2 au stade 3 feuilles, et les feuilles ont été récoltées 1 à 14 jours après l’infestation. Le liquide de lavage intercellulaire (IWF) a été extrait par filtration sous vide et stocké à -20 °C. Les résidus foliaires ont été broyés en poudre et utilisés pour les composants de la paroi cellulaire. L’activité et la caractérisation du POD ont été déterminées à l’aide d’un substrat de gaïacol de 5 mM et de H₂O₂, en surveillant la variation de l’absorbance à 470 nm. L’activité de la β-1,3-glucanase, le pH et les conditions optimales de température ont été démontrés en mesurant les sucres réducteurs totaux dans l’hydrolysat avec le réactif DNS à l’aide de substrats β-1,3-glucane et β-1,3-1,4-glucane, en mesurant l’absorbance à 540 nm et en utilisant la courbe étalon du glucose. Le pH optimal a été déterminé entre 4 et 9, la température optimale entre 25 et 50 °C et la stabilité thermique entre 30 °C et 70 °C. La spécificité du substrat de β-1,3-glucanase a été déterminée à 25 °C et 40 °C à l’aide de substrats de β-1,3-1,4-glucane de curdlan et d’orge. De plus, le mode d’action de la β-1,3-glucanase a été déterminé à l’aide de la laminaribiose à la laminaripentaose. Les profils de produits d’hydrolyse des oligosaccharides ont été analysés qualitativement par chromatographie sur couche mince (CCM) et quantitativement par HPLC. La méthode présentée dans cette étude démontre une approche robuste pour infester le blé avec des actifs pondérés en roturier la rose, extraire la peroxydase et la β-1,3-glucanase de la région de la paroi cellulaire et leur caractérisation biochimique complète.

Introduction

Les pucerons russes du blé infestent le blé et l’orge, causant des pertes de rendement importantes ou une réduction de la qualité des grains. Le blé réagit à l’infestation en induisant plusieurs réponses de défense, notamment l’augmentation des niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase et de la peroxydase chez les cultivars résistants, tandis que les cultivars sensibles réduisent l’activité de ces enzymes au début de la période d’infestation 1,2,3,4. Les principales fonctions de la β-1,3-glucanase et du POD dans la plante de blé comprenaient....

Protocole

L’étude a été menée avec l’approbation et la permission du Comité d’éthique de la recherche sur l’environnement et la biosécurité de l’Université de l’État libre (UFS-ESD2022/0131/22). Les détails des réactifs et de l’équipement ici sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conditions de croissance des plantes

1. Faites germer 250 graines de chaque cultivar de blé, c’est-à-dire Tugela, Tugela-Dn1 sensible, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant, dans des boîtes de Pétri séparées.
2. Ajoutez 5 ml d’eau distillée dans chaque boîte de Pétri, scellez-la av....

Discussion

Le blé et l’orge sont des cultures céréalières fréquemment infestées par des espèces de pucerons, y compris les pucerons russes du blé (Diuraphis noxia)^7,24. Les plants de blé résistants induisent la régulation positive des activités POD et β-1,3-glucanase en tant que réponses de défense tout au long de la période d’infestation pour modifier la paroi cellulaire en régulant l’accumulation de callose et de lignine

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.