Élucidation des propriétés physicochimiques de la #946 ;-1,3-glucanase et de la peroxydase du mécanisme de défense de la paroi cellulaire du blé contre l’infestation par Diuraphis noxia

Résumé

Le présent protocole décrit les procédures utilisées pour étudier et caractériser les enzymes liées à la paroi cellulaire, principalement la β-1,3-glucanase et la peroxydase, chez les plants de blé. Leurs niveaux d’activité augmentent lors de l’interaction blé-RWA et sont impliqués dans la réponse de défense des plantes par le renforcement de la paroi cellulaire, ce qui dissuade l’alimentation des pucerons.

Résumé

Les plants de blé infestés par des pucerons russes du blé (RWA) induisent une cascade de réponses de défense, y compris les réponses d’hypersensibilité (HR) et l’induction de protéines liées à la pathogenèse (PR), telles que la β-1,3-glucanase et la peroxydase (POD). Cette étude vise à caractériser les propriétés physicochimiques de la POD et de la β-1,3-glucanase associées à la paroi cellulaire et à déterminer leur synergie sur la modification de la paroi cellulaire lors de l’interaction RWASA2-blé. Les cultivars sensibles Tugela, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant ont été prégermés et plantés en serre, fertilisés 14 jours après la plantation et irrigués tous les 3 jours. Les plantes ont été infestées de 20 individus parthénogénétiques du même clone RWASA2 au stade 3 feuilles, et les feuilles ont été récoltées 1 à 14 jours après l’infestation. Le liquide de lavage intercellulaire (IWF) a été extrait par filtration sous vide et stocké à -20 °C. Les résidus foliaires ont été broyés en poudre et utilisés pour les composants de la paroi cellulaire. L’activité et la caractérisation du POD ont été déterminées à l’aide d’un substrat de gaïacol de 5 mM et de H₂O₂, en surveillant la variation de l’absorbance à 470 nm. L’activité de la β-1,3-glucanase, le pH et les conditions optimales de température ont été démontrés en mesurant les sucres réducteurs totaux dans l’hydrolysat avec le réactif DNS à l’aide de substrats β-1,3-glucane et β-1,3-1,4-glucane, en mesurant l’absorbance à 540 nm et en utilisant la courbe étalon du glucose. Le pH optimal a été déterminé entre 4 et 9, la température optimale entre 25 et 50 °C et la stabilité thermique entre 30 °C et 70 °C. La spécificité du substrat de β-1,3-glucanase a été déterminée à 25 °C et 40 °C à l’aide de substrats de β-1,3-1,4-glucane de curdlan et d’orge. De plus, le mode d’action de la β-1,3-glucanase a été déterminé à l’aide de la laminaribiose à la laminaripentaose. Les profils de produits d’hydrolyse des oligosaccharides ont été analysés qualitativement par chromatographie sur couche mince (CCM) et quantitativement par HPLC. La méthode présentée dans cette étude démontre une approche robuste pour infester le blé avec des actifs pondérés en roturier la rose, extraire la peroxydase et la β-1,3-glucanase de la région de la paroi cellulaire et leur caractérisation biochimique complète.

Introduction

Les pucerons russes du blé infestent le blé et l’orge, causant des pertes de rendement importantes ou une réduction de la qualité des grains. Le blé réagit à l’infestation en induisant plusieurs réponses de défense, notamment l’augmentation des niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase et de la peroxydase chez les cultivars résistants, tandis que les cultivars sensibles réduisent l’activité de ces enzymes au début de la période d’infestation 1,2,3,4. Les principales fonctions de la β-1,3-glucanase et du POD dans la plante de blé comprenaient la régulation de l’accumulation de callose dans le cultivar résistant et l’extinction des espèces réactives de l’oxygène (ROS) au niveau de la paroi cellulaire et des régions apoplasiques lors de l’infestation par les RWA 1,3,5,6,7. Mafa et ^al.6 ont démontré qu’il y avait une forte corrélation entre l’augmentation de l’activité du POD et l’augmentation de la teneur en lignine dans le cultivar de blé résistant lors d’infestations par RWASA2. De plus, l’augmentation de la teneur en lignine indique que la paroi cellulaire du cultivar de blé résistant infesté a été renforcée, ce qui a entraîné une réduction de l’alimentation en actifs pondérés en eau.

La plupart des groupes de chercheurs ont extrait et étudié la β-1,3-glucanase apoplasique et le POD au cours de l’interaction blé/orge-APR ; De plus, la plupart de ces études ont affirmé que ces enzymes influencent la paroi cellulaire du plant de blé infesté d’APR sans mesurer la présence d’enzymes dans la région de la paroi cellulaire. Seules quelques études ont utilisé des techniques microscopiques pour montrer que les niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase étaient liés à la régulation de la callose ^7,8,9 ou ont extrait les principaux composants de la paroi cellulaire pour démontrer la corrélation entre les activités de la POD et la modification de la paroi cellulaire chez les ^6,10 résistants. L’absence de sonde de l’association de la β-1,3-glucanase et de la POD à la paroi cellulaire indique la nécessité de développer des méthodes permettant aux chercheurs de mesurer directement les enzymes liées à la paroi cellulaire.

La méthode actuelle propose qu’il soit nécessaire d’éliminer le liquide apoplasique du tissu foliaire avant d’extraire les enzymes liées à la paroi cellulaire. La procédure d’extraction du liquide apoplasique doit être effectuée deux fois à partir du tissu foliaire, qui est utilisé pour extraire les enzymes liées à la paroi cellulaire. Ce processus réduit la contamination et la confusion des enzymes apoplasiques avec celles trouvées dans les régions de la paroi cellulaire. Ainsi, dans cette étude, nous avons extrait la POD, la β-1,3-glucanase liée à la paroi cellulaire et la β-glucanase spécifique de la MLG et effectué leur caractérisation biochimique.

Protocole

L’étude a été menée avec l’approbation et la permission du Comité d’éthique de la recherche sur l’environnement et la biosécurité de l’Université de l’État libre (UFS-ESD2022/0131/22). Les détails des réactifs et de l’équipement ici sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conditions de croissance des plantes

1. Faites germer 250 graines de chaque cultivar de blé, c’est-à-dire Tugela, Tugela-Dn1 sensible, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant, dans des boîtes de Pétri séparées.
2. Ajoutez 5 ml d’eau distillée dans chaque boîte de Pétri, scellez-la avec un film de paraffine et incubez dans la chambre de germination réglée à 25 °C pendant 2 jours.
3. Repiquez les graines germées de chaque cultivar dans des pots de 15 cm contenant de la terre 1:1 et de la tourbe (15 plantes par pot) dans des conditions de serre contrôlées.
4. Réglez les régimes de température à 18 °C et 24 °C pendant la nuit et le jour, respectivement.
5. Irriguez les plantes tous les 3 jours avec de l’eau du robinet et apportez-leur 2 g/L d’engrais 14 jours après la germination.
6. Placez les plantes dans des cages enfermées dans des filets et laissez-les pousser jusqu’au stade ^2,6 de la troisième feuille (avec quatre réplicats biologiques de chaque cultivar).

2. Infestation de cultivars de blé par RWASA2

1. Infestez les cultivars de blé Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 avec RWASA2 selon Jimoh et ^al.11 et Mohase et Taiwe¹².
2. Gardez les plantes en deux ensembles séparés dans des cages ; Infester un ensemble avec 20 individus parthénogénétiques du même clone RWASA2 par plante dans chaque pot dans les chambres de culture recouvertes de filets. Gardez un autre ensemble de plants de blé dans une pièce séparée sous la chambre de croissance avec des filets propres et traitez-les comme des témoins.
   REMARQUE : Conservez les deux traitements dans des pièces séparées et couvrez les plantes dans des cages enfermées dans des filets. De plus, dans le cas où deux biotypes différents d’actifs pondérés en commun sont utilisés dans une étude, conservez autant que possible les plantes infestées par un biotype d’actifs pondérés en fonction des risques par rapport à celles infestées par le deuxième biotype ou dans des pièces séparées sous des chambres de culture recouvertes de filets pour éviter toute contamination croisée possible de l’hydrotype d’eau et d’assainissement de l’eau de type 2.
3. Pour la récolte, sélectionnez les deuxième et troisième feuilles à deux régimes temporels différents, période d’alimentation à court terme (1, 2 et 3 jours) et période d’alimentation à long terme (7 et 14 jours), et enveloppez-les dans du papier absorbant humide.
4. Transférez immédiatement les feuilles récoltées dans une boîte contenant de la glace pour réduire le métabolisme des feuilles avant l’extraction par liquide de lavage intercellulaire (IWF).

3. Extraction du liquide de lavage intercellulaire (IWF) de l’apoplast

1. Coupez les feuilles récoltées d’environ trois cultivars de blé en morceaux de 7 cm.
2. Rincez les morceaux de feuilles deux fois à l’eau distillée pour éliminer toute contamination cytosolique des extrémités coupées ^6,13.
3. Insérez les morceaux de feuilles dans un tube de verre à paroi épaisse et immergez les échantillons dans un tampon d’extraction (50 mM de Tris-HCl, pH 7,8).
4. Appliquer l’infiltration sous vide pendant 5 min à l’aide d’une pompe à jet d’eau pour imprégner les feuilles avec le tampon d’extraction.
5. Ensuite, retirez les morceaux de feuilles du tube en verre et séchez-les avec une serviette en papier.
6. Insérer les morceaux de feuilles séchées verticalement dans des tubes de centrifugation pré-refroidis équipés de disques perforés et centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
7. À l’aide d’une pipette de 100 μL, recueillir le surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL prérefroidis.
8. Répétez toute la procédure d’extraction avec le même matériau foliaire.
9. Combinez le surnageant recueilli et conservez-le à −20 °C.
   REMARQUE : Les aliquotes surnageantes sont traitées comme la source de la teneur en apoplaste ou IWF. L’IWF n’a pas été utilisé dans l’étude actuelle, mais il était important de l’éliminer des tissus foliaires avant d’extraire la β-1,3-glucanase et la peroxydase (POD) liées à la paroi cellulaire.

4. Extraction de la β-1,3-glucanase et du POD associés à la paroi cellulaire

REMARQUE : Les résidus foliaires laissés après l’extraction par l’IWF ont été utilisés pour extraire la protéine totale de la paroi cellulaire.

1. Broyez les résidus de feuilles en une fine poudre avec de l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon.
2. Transvaser environ 200 mg de tissu foliaire en poudre dans un mortier contenant 4 mL de tampon d’extraction (50 mM de phosphate de sodium avec 1 % (p/v) de polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) ; pH 5,0) suivi d’un broyage au pilon jusqu’à obtenir une pâte lisse, qui est ensuite transférée dans des tubes de microcentrifugation.
3. Incuber le mélange dans les tubes de microcentrifugation pendant 3 min sur de la glace, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
4. Prélever le surnageant (extraits protéiques totaux) dans des tubes de microcentrifugation (aliquotes de 2 mL) et l’utiliser comme source de β-1,3-glucanase et de POD pour toute l’étude.

5. Détermination de l’étalon protéique

1. Déterminer la concentration totale en protéines des extraits selon la méthode de Bradford¹⁴.
2. Préparer les solutions d’albumine sérique bovine (BSA) aux concentrations de 0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL et 1,0 mg/mL dissoutes dans un tampon de phosphate de sodium de 50 mM pour produire l’étalon de protéine.
3. Préparez l’étalon en ajoutant 10 μL de chaque solution BSA dans la microplaque à 96 puits avec 190 μL (0,25 % v/v) de réactif Bradford (voir le tableau des matériaux).
4. Incuber à 25 °C pendant 20 min et mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide du lecteur de microplaques et utiliser les valeurs d’absorbance pour préparer la courbe standard de quantification de la concentration en protéines.
5. Quantifier la concentration en protéines
   1. Ajouter 10 μL de l’enzyme extraite (étape 4) dans une microplaque à 96 puits avec 190 μL (0,25 % v/v) de réactif Bradford en trois exemplaires.
   2. Incuber à température ambiante (25 °C) pendant 20 min.
   3. Mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide du spectrophotomètre équipé d’un lecteur de microplaques et utiliser les valeurs d’absorbance pour déterminer la concentration en protéines à l’aide de l’étalon de protéines BSA (préparé à l’étape 5.4).

6. Préparez l’étalon de glucose pour l’activité de la β-1,3-glucanase

1. Préparez les solutions étalons à des concentrations comprises entre 0,00 mg/mL et 1,0 mg/mL (0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL) avec du glucose dissous dans de l’eau distillée.
2. Ajouter 300 μL de chaque solution de glucose et 600 μL de réactif d’acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS) dans un rapport de 1:2 dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et incuber les réactions à 100 °C pendant 5 minutes (voir le Tableau des matériaux pour les réactifs DNS) (Miller et ^coll.15).
3. Laissez le mélange refroidir à température ambiante avant de mesurer l’absorbance à 540 nm à l’aide du spectrophotomètre.
4. Utilisez les valeurs moyennes d’absorbance pour élaborer la courbe standard permettant de déterminer l’activité de l’enzyme β-1,3-glucanase.

7. Détermination de l’activité de la β-1,3-glucanase

REMARQUE : L’activité enzymatique de la β-1,3-glucanase liée à la paroi cellulaire extraite de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 a été déterminée par la quantité de sucres réducteurs totaux libérés par l’hydrolyse de 0,5 % (p/v) de substrats de β-1,3-1,4-glucane liés mixtes (MLG) et de β-1,3-glucane à 0,4 % (p/v) à l’aide d’une méthode modifiée décrite par Miller et ^al.15. Gardez toujours les tubes avec des aliquotes de protéines sur la glace. Si les échantillons ont été congelés, décongelez-les sur de la glace et procédez immédiatement après la décongélation.

1. Ajouter 200 μL de l’extrait enzymatique (maintenir la concentration en protéines entre 20 μg/mL et 90 μg/mL dans toutes les réactions, sauf indication contraire) et 300 μL du substrat dissous dans un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5,0) dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
   REMARQUE : Exécutez une réaction à blanc parallèle sans l’extrait enzymatique pour tous les substrats (premier blanc), et le blanc enzymatique est constitué d’un extrait enzymatique sans substrat (deuxième blanc). Le substrat et l’extrait enzymatique ont été remplacés par le tampon dans le premier et le deuxième noir, respectivement.
2. Incuber les réactions à 37 °C pendant 24 h et terminer la réaction en chauffant à 100 °C pendant 5 min, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
3. Mélanger 300 μL de surnageant avec 600 μL de réactif DNS (rapport 1:2) dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et faire bouillir à 100 °C pendant 5 min.
4. Laissez la solution refroidir à température ambiante et mesurez l’absorbance à 540 nm à l’aide du spectrophotomètre.
   REMARQUE : Si la concentration de sucres réducteurs totaux est élevée dans le mélange, il en résultera une solution brun foncé, difficile à lire à l’aide du spectrophotomètre. Par conséquent, une dilution supplémentaire des échantillons est nécessaire avant de lire l’absorbance.
5. Utilisez la courbe étalon de glucose développée à l’étape 6.4 ci-dessus pour déterminer l’activité enzymatique dans les unités SI de la courbe standard.
6. Pour convertir l’activité en une activité spécifique exprimée en μmol de glucose/h/mg de protéine, utilisez l’équation ci-dessous :
   Activité spécifique = [(activité enzymatique/180,16)*1000]/temps/concentration en protéines
   REMARQUE : Convertir l’activité enzymatique en mg/mL en g/mL ; 180,16 g/mol est le poids moléculaire du glucose, 1000 est un facteur qui convertit M en micromoles, le temps est la période de réaction et la concentration de l’extrait de protéine est représentée en mg/mL. Une unité d’activité de la β-1,3-glucanase est définie comme 1 μmol de glucose libéré du substrat au cours d’une période de réaction de 1 h.

8. Détermination de l’activité de la peroxydase (PDD)

REMARQUE : L’activité de la peroxydase liée à la paroi cellulaire des cultivars de blé Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 a été déterminée en quantifiant la formation du tétra-gaïacol produit par unité de temps à partir du gaïacol¹⁶.

1. Ajouter 30 μL d’extrait enzymatique, 30 μL 1% (v/v) H₂O₂ et 970 μL de 5 mM de gaïacol dans les cuvettes à 25 °C.
   REMARQUE : Effectuez la réaction à blanc sans l’extrait enzymatique (premier blanc), et un autre blanc pour les échantillons d’enzymes sans substrat (deuxième blanc). Les échantillons d’enzyme ou de substrat ont été remplacés par un tampon de phosphate de sodium de 50 mM dans le premier et le deuxième blanc, respectivement.
2. Utilisez le mode cinétique du spectrophotomètre pour surveiller la variation de l’absorbance à 470 nm.
3. Déterminez la pente où le graphique était linéaire et utilisez-la comme valeur d’absorbance.
4. Calculez l’absorbance moyenne et utilisez-la pour calculer l’activité du PDO.
5. Calculer l’activité de la peroxydase à l’aide du coefficient d’extinction molaire du gaïacol (26,6 ^{mM-1 cm-1}) et exprimer l’activité en μmol tétra-gaïacol/min/mg de protéine.
6. Calculer l’activité du POD à l’aide de l’équation utilisée par Mafa et ^al.6 :
   ACTIVITÉ DU POD = [(ΔABS × DF) ÷ Concentration en protéines] × 26,6 ^{mM-1 cm-1} × 1 cm
   REMARQUE : où ΔABS = absorbance moyenne ; DF = Facteur de dilution ; 26,6 ^{mM-1 cm-1} = coefficient d’extinction du gaïacol.

9. Caractérisation du POD

REMARQUE : Des essais de caractérisation du POD ont été réalisés à l’aide d’extraits enzymatiques de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 3 jours après l’infestation, selon des méthodes similaires décrites à l’étape 8, avec des changements mineurs dans les tampons de réaction et les températures. Les échantillons d’enzymes étaient toujours conservés sur de la glace pendant que les expériences étaient menées. Exécutez les réactions en quadrilats avec une réaction à blanc parallèle.

1. Pour des dosages de pH optimaux, effectuez les étapes suivantes.
   1. Dissoudre le substrat de gaïacol dans des tampons de 50 mM (citrate de sodium, pH 4 et 5), du phosphate de sodium (pH 6 et 7) et du Tris-HCl (pH 8 et 9) (voir le tableau des matériaux).
   2. Exécutez les réactions à 25 °C comme décrit à l’étape 8.
2. Pour des dosages de température optimaux, effectuez les étapes suivantes.
   1. Exécutez les réactions à 25 °C, 30 °C, 40 °C et 50 °C, respectivement.
   2. Utilisez un substrat de gaïacol dissous dans le tampon pH 5 (pH optimum) et exécutez les réactions comme décrit à l’étape 8.
3. Pour les tests de thermostabilité, effectuez les étapes suivantes.
   1. Avant de commencer les réactions, incubez l’enzyme à 37 °C, 50 °C et 70 °C pendant 30 min.
   2. Exécutez les réactions selon les méthodes décrites à l’étape 8 à l’aide d’un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5) et à 40 °C (température optimale).

10. Caractérisation de la β-1,3-glucanase

REMARQUE : Effectuer les essais de caractérisation en suivant la méthode décrite à l’étape 7 en utilisant des extraits enzymatiques à 3 dpi, avec quelques modifications dans les tampons de réaction et les températures. Exécutez les réactions en quadrilicats, avec une réaction à blanc parallèle pour chaque substrat.

1. Pour des dosages de pH optimaux, procédez comme suit :
   1. Dissoudre les substrats MLG et β-1,3-glucane dans des tampons de 50 mM (citrate de sodium, pH 4 et 5), du phosphate de sodium (pH 6 et 7) et du Tris-HCl (pH 8 et 9).
   2. Exécutez la réaction comme décrit à l’étape 7.
2. Pour des dosages de température optimaux, procédez comme suit :
   1. Exécutez les réactions à 25 °C, 30 °C, 40 °C et 50 °C, respectivement.
   2. Utilisez des substrats MLG et β-1,3-glucane dissous dans le tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5) avec un pH optimal (obtenu à l’étape 10.1) et exécutez les réactions comme décrit à l’étape 7.
3. Pour les tests de thermostabilité, procédez comme suit :
   1. Avant de commencer les réactions, incubez l’enzyme à 37 °C, 50 °C et 70 °C pendant 30 min.
   2. Exécutez les réactions à l’aide de substrats dissous dans un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5) et incubez à 25 °C et 40 °C pendant 24 h.

11. Évaluation du mécanisme d’action de la β-1,3-glucanase sur différents substrats de glucane

REMARQUE : Les substrats glucaniques contiennent le même résidu de glucose dans leur squelette, mais les liaisons glycosidiques entre les unités de glucopyranose sont diverses et peuvent prendre la α ou β orientation¹⁷. Les liaisons glycosidiques peuvent se former entre plusieurs atomes de carbone de molécules de glucose, définissant leur structure chimique, par exemple, β-1,3-glucane, β-1,4-glucane et β-1,3-1,4-glucane lié mixte (MLG)18,19,20. Le mécanisme d’action de la β-1,3-glucanase a été déterminé à l’aide d’échantillons de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 (sources d’enzymes) et des substrats suivants β-1,3-glucane (CM-curdlan), MLG (d’orge) et β-1,4-glucane (AZO-CM-cellulose). Le mécanisme d’action est déterminé dans des conditions d’essai optimales (25 °C et 40 °C, pH 5,0), en utilisant des substrats β-1,4-glucane à 0,1 % (p/v), β-1,3-glucane à 0,1 % (p/v) ou 0,5 % (p/v) de GRM.

1. Dissoudre les substrats dans un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5).
2. Ajouter 200 μL de l’extrait enzymatique et 300 μL du substrat dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
3. Incuber les réactions à deux températures distinctes, 25 °C et 40 °C pendant 8 h.
4. Fin des réactions par chauffage à 100 °C.
5. Centrifuger le mélange réactionnel de β-1,3-glucane et de MLG à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C et procéder comme décrit à l’étape 7.3.
6. Pour le β-1,4-glucane, après avoir terminé la réaction à 100 °C, diluer le mélange avec 800 μL d’éthanol absolu et centrifuger à 4 °C pendant 10 min à 10 000 x g.
7. Transférez le surnageant dans les courbes, mesurez l’absorbance à 590 nm avec le spectrophotomètre et calculez l’activité de la β-1,3-glucanase sur le β-1,4-glucane en utilisant la procédure du fabricant (voir le tableau des matériaux) et exprimez l’activité en unités/mg de protéines.

12. Détermination du mode d’action de la β-1,3-glucanase

REMARQUE : Le mode d’action de la β-1,3-glucanase induite par Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 infestés de RWASA2 a été analysé avec des oligosaccharides laminarins (LAMs) dont le degré de polymérisation (DP) est compris entre 5 et 2. Utilisez la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) et le kit de glucose oxydase peroxydase (GOPOD) pour déterminer le DP nécessaire à l’hydrolyse de la β-1,3-glucanase du substrat. La CCM a été utilisée pour l’analyse qualitative, et la LC-MS a été utilisée pour l’analyse quantitative, qui a déterminé la concentration des oligosaccharides dans l’hydrolysat après la réaction²¹.

1. Préparer les réactions du mode d’action de la β-1,3-glucanase
   REMARQUE : Préparez l’extrait protéique concentré à l’aide d’un filtre à membrane concentrateur centrifuge de 10 kDa, et obtenez ainsi des extraits protéiques concentrés et non concentrés infestés de RWASA2 pour l’expérience.
   1. Pour concentrer les enzymes extraites de chaque cultivar, transférez 5 mL des extraits dans les filtres à membrane concentrateurs de la centrifugeuse de 10 kDa.
   2. Centrifuger les tubes filtrants à membrane contenant l’extrait à 15 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
   3. Dissoudre le laminaripentaose (LAM5), le laminaritétraose (LAM4), le laminaritriose (LAM3) et le laminaribiose (LAM2) (voir le tableau des matières) dans 50 mM de citrate de sodium (pH 5) pour obtenir 10 mg/mL.
   4. Pour démarrer la réaction, ajoutez 20 μL d’extrait de protéine et 40 μL de laminaripentaose (LAM5), de laminaritétraose (LAM4), de laminaritriose (LAM3) et de laminaribiose (LAM2).
   5. Incuber la réaction à 40 °C pendant 16 h et terminer par ébullition à 100 °C pendant 5 min.
2. Effectuer la chromatographie sur couche mince (CCM)
   1. Coupez 4 plaques de silice en² morceaux de 10 cm et tracez une ligne sur la surface de l’assiette, en laissant un espace de 1 cm à partir du bas d’un bord.
   2. Marquez les points sur la ligne et marquez-les selon différents cultivars et DP des oligosaccharides laminarins, à 1 cm de distance et. Prenez 2 plaques de silice pour les extraits protéiques concentrés et les 2 autres pour les extraits non concentrés.
   3. Ajouter 3 μL des mélanges réactionnels 3 à 5 fois sur les points marqués correspondants sur la plaque de silice et laisser les points sur la plaque sécher complètement avant de répéter le processus.
   4. Placez délicatement les plaques de silice dans le réservoir de CCM contenant la phase mobile du n-butanol : acide acétique : eau (2:1:1 v/v/v) avec le côté contenant les taches des échantillons au fond.
   5. Laissez la phase mobile se déplacer du bas vers le haut de la plaque.
      REMARQUE : Cette étape peut prendre environ 2 h. Ne déplacez pas et ne dérangez pas le réservoir pendant la séparation des échantillons.
   6. Retirez les plaques de la phase mobile et laissez-les sécher à température ambiante.
   7. Ajoutez la solution de coloration dans le petit récipient, immergez doucement la plaque de silice dans la solution de coloration de naphtol à 0,3 % (v/v) dans de l’éthanol à 95 % (v/v) en utilisant de l’acide sulfurique à 5 % (v/v) pendant 5 s, retirez-la, puis laissez-la sécher à température ambiante.
      REMARQUE : À cette étape, allumez le bloc chauffant/four et réglez la température sur 100 °C.
   8. Placez les plaques de silice séchées sur le bloc chauffant et chauffez à 100 °C pendant 7 à 10 minutes ou jusqu’à ce que les taches bleu-violet apparaissent. Prenez des photos des plaques de silice montrant les taches bleu-violet et documentez-les.
3. Quantifier la concentration des hydrolysats de laminarins-oligosaccharides
   REMARQUE : La concentration des hydrolysats de LAM sera quantifiée pour les extraits protéiques concentrés et non concentrés²¹.
   1. Ajouter 20 μL de chaque échantillon sur une colonne C18 (glucides 4,6 × 250 mm) et laisser séparer à un débit de 500 μL/min en utilisant un gradient d’eau (solvant A) et d’acétonitrile (solvant B) de 100 % B à 60 % B sur 10 min, suivi d’étapes de rééquilibrage de la colonne avec une durée totale de 20 min pour permettre le rééquilibrage de la colonne.
   2. Ionisez les analytes éluants en mode électronébulisation négative dans la source d’ions de spectrométrie de masse avec une température de chauffage de 400 °C pour évaporer l’excès de solvant, le gaz de nébulisation de 30 psi, le gaz de chauffage de 30 psi et le gaz de rideau de 20 psi.
   3. Réglez le potentiel de désagrégation sur 350 V.
   4. Analysez les analytes éluants sur le spectromètre de masse en mode de balayage Q1 allant de 150 Da à 1000 Da avec un temps de séjour de 3 s.
   5. Notez les concentrations des analytes sur la feuille de calcul.
4. Quantifier la concentration de glucose
   1. Analysez la concentration de glucose produite par l’hydrolyse de la laminarine à l’aide du réactif GOPOD en suivant les instructions du fabricant^22,23.
   2. Mesurer l’absorbance à 510 nm en mode fixe du spectrophotomètre.

13. Collecte et analyse des données

1. Randomisez toutes les expériences pour éviter tout biais lors de l’infestation ou du prélèvement d’échantillons et effectuez l’analyse en quadrillats.
2. Sauf indication contraire, utilisez les moyennes ±écart-type pour représenter les valeurs dans les graphiques et les tableaux générés à partir des données expérimentales collectées.
3. Utilisez Microsoft Excel pour analyser toutes les données et générer des graphiques.
4. Effectuez des analyses statistiques avec des logiciels compatibles.
   REMARQUE : Effectuer une analyse multifactorielle de variance (ANOVA) pour tester la signification entre les traitements et la LSD de Fisher pour tester les groupes homogènes à une valeur alpha de 0,05.

Résultats

Quatre réplicats biologiques de cultivars de blé (Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5) ont été infestés par RWASA2 au stade de croissance à 3 feuilles. Après l’infestation, les feuilles ont été récoltées à 1-, 2-, 3-, 7-, 14 dpi. Les traitements témoins n’ont pas été infestés par RWASA2 pour rendre les résultats de l’expérience comparables à ceux des plants de blé non exposés au stress. Les expériences ont été menées en quadrilcalitats, et les résultats ont été présentés...

Discussion

Le blé et l’orge sont des cultures céréalières fréquemment infestées par des espèces de pucerons, y compris les pucerons russes du blé (Diuraphis noxia)^7,24. Les plants de blé résistants induisent la régulation positive des activités POD et β-1,3-glucanase en tant que réponses de défense tout au long de la période d’infestation pour modifier la paroi cellulaire en régulant l’accumulation de callose et de lignine

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.