Chiarire le proprietà fisico-chimiche di #946;-1,3-glucanasi e perossidasi del meccanismo di difesa della parete cellulare del grano contro l'infestazione da Diuraphis noxia

Riepilogo

Il presente protocollo descrive le procedure utilizzate per studiare e caratterizzare gli enzimi correlati alla parete cellulare, principalmente β-1,3-glucanasi e perossidasi, nelle piante di frumento. I loro livelli di attività aumentano durante l'interazione grano-RWA e sono coinvolti nella risposta di difesa delle piante attraverso il rinforzo della parete cellulare, che scoraggia l'alimentazione degli afidi.

Abstract

Le piante di grano infestate dagli afidi russi del grano (RWA) inducono una cascata di risposte di difesa, tra cui le risposte di ipersensibilità (HR) e l'induzione di proteine correlate alla patogenesi (PR), come la β-1,3-glucanasi e la perossidasi (POD). Questo studio mira a caratterizzare le proprietà fisico-chimiche della POD associata alla parete cellulare e della β-1,3-glucanasi e a determinare il loro sinergismo sulla modifica della parete cellulare durante l'interazione RWASA2-grano. Le cultivar Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 suscettibili, moderatamente resistenti sono state pregerminate e piantate in serra, fertilizzate 14 giorni dopo la semina e irrigate ogni 3 giorni. Le piante sono state infestate da 20 individui partenogenetici dello stesso clone RWASA2 allo stadio di 3 foglie e le foglie sono state raccolte da 1 a 14 giorni dopo l'infestazione. Il liquido di lavaggio intercellulare (IWF) è stato estratto mediante filtrazione sottovuoto e conservato a -20 °C. I residui fogliari sono stati frantumati in polvere e utilizzati per i componenti della parete cellulare. L'attività e la caratterizzazione del POD sono state determinate utilizzando 5 mM di substrato di guaiacolo e H₂O₂, monitorando la variazione dell'assorbanza a 470 nm. L'attività della β-1,3-glucanasi, il pH e le condizioni ottimali di temperatura sono stati dimostrati misurando gli zuccheri riducenti totali nell'idrolizzato con il reagente DNS utilizzando substrati di β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, misurando l'assorbanza a 540 nm e utilizzando la curva standard del glucosio. Il pH ottimale è stato determinato tra pH 4 e 9, la temperatura ottimale tra 25 e 50 °C e la stabilità termica tra 30 °C e 70 °C. La specificità del substrato di β-1,3-glucanasi è stata determinata a 25 °C e 40 °C utilizzando substrati di cagliata e orzo β-1,3-1,4-glucano. Inoltre, la modalità d'azione della β-1,3-glucanasi è stata determinata utilizzando la laminaribiosio alla laminaripentasio. I modelli di prodotti dell'idrolisi degli oligosaccaridi sono stati analizzati qualitativamente con cromatografia su strato sottile (TLC) e analizzati quantitativamente con HPLC. Il metodo presentato in questo studio dimostra un approccio robusto per infestare il grano con RWA, estraendo la perossidasi e la β-1,3-glucanasi dalla regione della parete cellulare e la loro caratterizzazione biochimica completa.

Introduzione

Gli afidi russi del grano (RWA) infestano il grano e l'orzo, causando una significativa perdita di resa o una riduzione della qualità del grano. Il frumento risponde all'infestazione inducendo diverse risposte di difesa, tra cui l'aumento dei livelli di attività della β-1,3-glucanasi e della perossidasi nelle cultivar resistenti, mentre le cultivar sensibili riducono l'attività di questi enzimi nel periodo di infestazione precoce 1,2,3,4. Le funzioni chiave della β-1,3-glucanasi e della POD nella pianta di frumento includevano la regolazione dell'accumulo di callosio nella cultivar resistente e l'estinzione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) sulla parete cellulare e sulle regioni apoplastiche durante l'infestazione da RWA 1,3,5,6,7. Mafa et ^al.6 hanno dimostrato che c'era una forte correlazione tra l'aumento dell'attività delle POD e l'aumento del contenuto di lignina nella cultivar di grano resistente in seguito a infestazioni da RWASA2. Inoltre, l'aumento del contenuto di lignina indicava che la parete cellulare della cultivar di grano resistente infestata era rinforzata, portando a una riduzione dell'alimentazione RWA.

La maggior parte dei gruppi di ricercatori ha estratto e studiato la β-1,3-glucanasi apoplastica e la POD durante l'interazione grano/orzo-RWA; inoltre, la maggior parte di questi studi ha affermato che questi enzimi influenzano la parete cellulare della pianta di grano infestata da RWA senza misurare la presenza dell'enzima nella regione della parete cellulare. Solo pochi studi hanno utilizzato tecniche microscopiche per dimostrare che i livelli di attività della β-1,3-glucanasi erano collegati alla regolazione del calcosio ^7,8,9 o hanno estratto i principali componenti della parete cellulare per dimostrare la correlazione tra le attività del POD e la modifica della parete cellulare nel ^6,10 resistente. La mancanza di sondare l'associazione β-1,3-glucanasi e POD alla parete cellulare indica la necessità di sviluppare metodi che consentano ai ricercatori di misurare direttamente gli enzimi legati alla parete cellulare.

Il metodo attuale propone che sia necessario rimuovere il fluido apoplastico dal tessuto fogliare prima di estrarre gli enzimi legati alla parete cellulare. La procedura di estrazione del liquido apoplastico deve essere eseguita due volte dal tessuto fogliare, che viene utilizzato per estrarre gli enzimi legati alla parete cellulare. Questo processo riduce la contaminazione e la confusione degli enzimi apoplastici con quelli che si trovano nelle regioni della parete cellulare. Pertanto, in questo studio, abbiamo estratto il POD legato alla parete cellulare, la β-1,3-glucanasi e la β-glucanasi specifica per MLG e abbiamo eseguito la loro caratterizzazione biochimica.

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Protocollo

Lo studio è stato condotto con l'approvazione e il permesso del Comitato Etico per la Ricerca Ambientale e sulla Biosicurezza dell'Università del Free State (UFS-ESD2022/0131/22). I dettagli dei reagenti e dell'attrezzatura qui sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Condizioni di crescita delle piante

1. Germinare 250 semi di ogni cultivar di grano, cioè Tugela suscettibile, Tugela-Dn1 moderatamente resistente e Tugela-Dn5 resistente, in piastre di Petri separate.
2. Aggiungere 5 ml di acqua distillata in ciascuna capsula di Petri, sigillare con una pellicola di paraffina e incubare nella camera di germinazione impostata a 25 °C per 2 giorni.
3. Trapiantare i semi germinati di ogni cultivar in vasi da 15 cm contenenti terriccio 1:1 e muschio di torba (15 piante per vaso) in condizioni di serra controllata.
4. Impostare i regimi di temperatura rispettivamente a 18 °C e 24 °C di notte e di giorno.
5. Irrigare le piante ogni 3 giorni con acqua di rubinetto e fornire loro 2 g/L di fertilizzante 14 giorni dopo la germinazione.
6. Metti le piante in gabbie racchiuse in reti e lasciale crescere fino al terzo stadio fogliare ^2,6 (con quattro repliche biologiche di ogni cultivar).

2. Infestazione da cultivar di grano con RWASA2

1. Infestare le cultivar di grano Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 con RWASA2 secondo Jimoh et ^al.11 e Mohase e Taiwe¹².
2. Tieni le piante in due gruppi separati in gabbie; infestare un set con 20 individui partenogenetici dello stesso clone RWASA2 per pianta in ogni vaso nelle camere di crescita coperte con reti. Tenete un'altra serie di piante di grano in una stanza separata sotto la camera di crescita con reti pulite e trattatele come controlli.
   NOTA: Tenere i due trattamenti in locali separati e coprire le piante in gabbie racchiuse in reti. Inoltre, nel caso in cui in uno studio vengano utilizzati due diversi biotipi di RWA, tenere il più possibile le piante infestate da un biotipo di RWA da quelle infestate dal secondo biotipo o in stanze separate sotto camere di crescita coperte da reti per evitare ogni possibile contaminazione incrociata del RWASA2.
3. Per la raccolta, selezionare la seconda e la terza foglia in due diversi regimi temporali, periodo di alimentazione a breve termine (1, 2 e 3 giorni) e periodo di alimentazione a lungo termine (7 e 14 giorni) e avvolgerle in tovaglioli di carta umidi.
4. Trasferisci immediatamente le foglie raccolte in una scatola contenente ghiaccio per ridurre il metabolismo delle foglie prima dell'estrazione del liquido di lavaggio intercellulare (IWF).

3. Estrazione del liquido di lavaggio intercellulare (IWF) dall'apoplasto

1. Tagliare le foglie raccolte di circa tre cultivar di grano in pezzi di 7 cm.
2. Sciacquare due volte i pezzi di foglia in acqua distillata per rimuovere eventuali contaminazioni citosoliche dalle estremità tagliate ^6,13.
3. Inserire i pezzi di foglia in una provetta di vetro a pareti spesse e immergere i campioni nel tampone di estrazione (50 mM Tris-HCl, pH 7,8).
4. Applicare l'infiltrazione sottovuoto per 5 minuti utilizzando una pompa a getto d'acqua per impregnare le foglie con il tampone di estrazione.
5. Successivamente, rimuovere i pezzi di foglia dal tubo di vetro e asciugarli con un tovagliolo di carta.
6. Inserire i pezzi di foglie essiccate verticalmente nelle provette da centrifuga preraffreddate dotate di dischi forati e centrifugare a 500 x g per 10 minuti a 4 °C.
7. Utilizzare una pipetta da 100 μl per raccogliere il surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL pre-raffreddate.
8. Ripetere l'intera procedura di estrazione con lo stesso materiale fogliare.
9. Unire il surnatante raccolto e conservarlo a -20° C.
   NOTA: Le aliquote del surnatante sono trattate come fonte del contenuto di apoplast o IWF. L'IWF non è stato utilizzato nel presente studio, ma era importante rimuoverlo dai tessuti fogliari prima di estrarre la β-1,3-glucanasi e la perossidasi (POD) legate alla parete cellulare.

4. Estrazione della β-1,3-glucanasi associata alla parete cellulare e del POD

NOTA: I residui fogliari rimasti dopo l'estrazione IWF sono stati utilizzati per estrarre le proteine della parete cellulare totale.

1. Schiacciare i residui fogliari in polvere fine con azoto liquido usando un mortaio e un pestello.
2. Trasferire circa 200 mg di tessuto fogliare in polvere in un mortaio contenente 4 mL di tampone di estrazione (50 mM di fosfato di sodio con 1% (p/v) di polivinilpolipirrolidone (PVPP); pH 5,0) seguito da una macinazione con un pestello fino a ottenere una pasta liscia, che viene quindi trasferita in provette per microcentrifuga.
3. Incubare la miscela nelle provette da microcentrifuga per 3 minuti con ghiaccio e poi centrifugare a 10.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
4. Raccogliere il surnatante (estratti proteici totali) in provette da microcentrifuga (aliquote da 2 mL) e utilizzarlo come fonte di β-1,3-glucanasi e POD per l'intero studio.

5. Determinazione dello standard proteico

1. Determinare la concentrazione proteica totale degli estratti seguendo il metodo Bradford¹⁴.
2. Preparare le soluzioni di albumina sierica bovina (BSA) alle concentrazioni di 0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL e 1,0 mg/mL disciolte in 50 mM di tampone fosfato di sodio per generare lo standard proteico.
3. Preparare lo standard aggiungendo 10 μl di ciascuna soluzione BSA nella micropiastra a 96 pozzetti con 190 μl (0,25% v/v) di reagente Bradford (vedere la tabella dei materiali).
4. Incubare a 25 °C per 20 minuti e misurare l'assorbanza a 595 nm utilizzando il lettore di micropiastre e utilizzare i valori di assorbanza per preparare la curva standard per quantificare la concentrazione proteica.
5. Quantificare la concentrazione proteica
   1. Aggiungere 10 μl dell'enzima estratto (fase 4) in una micropiastra a 96 pozzetti con 190 μl (0,25% v/v) di reagente Bradford in triplicati.
   2. Incubare a temperatura ambiente (25 °C) per 20 min.
   3. Misurare l'assorbanza a 595 nm utilizzando lo spettrofotometro con lettore di micropiastre e utilizzare i valori di assorbanza per determinare la concentrazione proteica utilizzando BSA come standard proteico (preparato al punto 5.4).

6. Preparare lo standard glicemico per l'attività della β-1,3-glucanasi

1. Preparare le soluzioni standard con concentrazioni comprese tra 0,00 mg/mL e 1,0 mg/mL (0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL) con glucosio disciolto in acqua distillata.
2. Aggiungere 300 μl di ciascuna soluzione di glucosio e 600 μl di reagente dell'acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) in un rapporto 1:2 in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e incubare le reazioni a 100 °C per 5 minuti (vedere la tabella dei materiali per i reagenti DNS) (Miller et al.15).
3. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente prima di misurare l'assorbanza a 540 nm utilizzando lo spettrofotometro.
4. Utilizzare i valori medi di assorbanza per sviluppare la curva standard per determinare l'attività dell'enzima β-1,3-glucanasi.

7. Determinazione del saggio di attività della β-1,3-glucanasi

NOTA: L'attività enzimatica della β-1,3-glucanasi legata alla parete cellulare estratta da Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 è stata determinata dalla quantità di zuccheri riducenti totali rilasciati dall'idrolisi di substrati misti di β-1,3-1,4-glucano (MLG) e 0,4% (p/v) β-1,3-glucano utilizzando un metodo modificato come descritto da Miller et ^al.15. Conservare sempre i tubi con le aliquote proteiche sul ghiaccio. Se i campioni sono stati congelati, scongelarli con ghiaccio e procedere immediatamente dopo lo scongelamento.

1. Aggiungere 200 μl dell'estratto enzimatico (mantenere la concentrazione proteica compresa tra 20 μg/mL e 90 μg/mL in tutte le reazioni, salvo diversa indicazione) e 300 μl del substrato disciolto in 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5,0) nelle provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
   NOTA: Eseguire una reazione parallela in bianco senza l'estratto enzimatico per tutti i substrati (primo bianco) e il bianco enzimatico è costituito da estratto enzimatico senza substrato (secondo bianco). Sia il substrato che l'estratto enzimatico sono stati sostituiti con il tampone rispettivamente nel primo e nel secondo nero.
2. Incubare le reazioni a 37 °C per 24 ore e terminare la reazione riscaldando a 100 °C per 5 minuti, quindi centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
3. Miscelare 300 μl di surnatante con 600 μl di reagente DNS (rapporto 1:2) in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL e far bollire a 100 °C per 5 min.
4. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e misurare l'assorbanza a 540 nm utilizzando lo spettrofotometro.
   NOTA: Se la concentrazione di zuccheri riducenti totali è elevata nella miscela, si otterrà una soluzione marrone scuro, difficile da leggere utilizzando lo spettrofotometro. Pertanto, è necessaria un'ulteriore diluizione dei campioni prima di leggere l'assorbanza.
5. Utilizzare la curva standard del glucosio sviluppata al punto 6.4 per determinare l'attività enzimatica nelle unità SI della curva standard.
6. Per convertire l'attività in un'attività specifica espressa in μmol glucosio/h/mg di proteina, utilizzare l'equazione seguente:
   Attività specifica = [(attività enzimatica/180.16)*1000]/tempo/concentrazione proteica
   NOTA: Converte l'attività enzimatica in mg/mL in g/mL; 180,16 g/mol è il peso molecolare del glucosio, 1000 è un fattore che converte M in micromoli, il tempo è il periodo di reazione e la concentrazione dell'estratto proteico è rappresentata in mg/mL. Un'unità di attività della β-1,3-glucanasi è definita come 1 μmol di glucosio rilasciato dal substrato entro un periodo di reazione di 1 ora.

8. Determinazione dell'attività della perossidasi (POD)

NOTA: L'attività della perossidasi legata alla parete cellulare delle cultivar di frumento Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 è stata determinata quantificando la formazione del tetra-guaiacolo prodotto per unità di tempo dal guaiacolo¹⁶.

1. Aggiungere 30 μl di estratto enzimatico, 30 μl di 1% (v/v) H₂O₂ e 970 μl di 5 mM di guaiacolo nelle cuvette a 25 °C.
   NOTA: Eseguire la reazione in bianco senza l'estratto enzimatico (primo bianco) e un altro bianco per campioni enzimatici senza substrato (secondo bianco). I campioni di enzima o substrato sono stati sostituiti da 50 mM di tampone fosfato di sodio rispettivamente nel primo e nel secondo bianco.
2. Utilizzare la modalità cinetica dello spettrofotometro per monitorare la variazione dell'assorbanza a 470 nm.
3. Determinare la pendenza in cui il grafico era lineare e utilizzarla come valore di assorbanza.
4. Calcola l'assorbanza media e usala nel calcolo dell'attività POD.
5. Calcolare l'attività della perossidasi utilizzando il coefficiente di estinzione molare del guaiacolo (26,6 ^{mM-1 cm-1}) ed esprimere l'attività in μmol tetra-guaiacolo/min/mg di proteina.
6. Calcola l'attività del POD usando l'equazione utilizzata da Mafa et ^al.6:
   ATTIVITÀ DEL POD = [(ΔABS × DF) ÷ Concentrazione proteica] × 26,6 ^{mM-1 cm-1} × 1 cm
   NOTA: Dove ΔABS = assorbanza media; DF = fattore di diluizione; 26,6 ^{mM-1 cm-1} = coefficiente di estinzione del guaiacolo.

9. Caratterizzazione POD

NOTA: I saggi di caratterizzazione POD sono stati condotti utilizzando estratti enzimatici di Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 a 3 giorni dopo l'infestazione, seguendo metodi simili descritti nella fase 8, con lievi variazioni dei tamponi di reazione e delle temperature. I campioni di enzimi sono stati sempre tenuti in ghiaccio durante gli esperimenti. Esegui le reazioni in quadruplicate con una reazione in bianco parallela.

1. Per ottenere saggi di pH ottimali, eseguire i seguenti passaggi.
   1. Sciogliere il substrato di guaiacolo in tamponi da 50 mM (citrato di sodio, pH 4 e 5), fosfato di sodio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9) (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Eseguire le reazioni a 25 °C come descritto al punto 8.
2. Per saggi di temperatura ottimali, eseguire i seguenti passaggi.
   1. Eseguire le reazioni rispettivamente a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C.
   2. Utilizzare il substrato di guaiacolo disciolto nel tampone pH 5 (pH ottimale) ed eseguire le reazioni come descritto al punto 8.
3. Per i test di termostabilità, eseguire i seguenti passaggi.
   1. Prima di iniziare le reazioni, incubare l'enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C per 30 minuti.
   2. Eseguire le reazioni secondo i metodi descritti al punto 8 utilizzando 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5) e a 40 °C (temperatura ottimale).

10. Caratterizzazione della β-1,3-glucanasi

NOTA: Condurre i saggi di caratterizzazione seguendo il metodo descritto nella fase 7 utilizzando estratti enzimatici da 3 dpi, con alcune modifiche ai tamponi di reazione e alle temperature. Eseguire le reazioni in quadruplicati, con una reazione parallela in bianco per ogni substrato.

1. Per saggi di pH ottimali, procedere come segue:
   1. Sciogliere i substrati MLG e β-1,3-glucano in tamponi da 50 mM (citrato di sodio, pH 4 e 5), fosfato di sodio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9).
   2. Eseguire la reazione come descritto nel passaggio 7.
2. Per saggi di temperatura ottimali, procedere come segue:
   1. Eseguire le reazioni rispettivamente a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C.
   2. Utilizzare substrati MLG e β-1,3-glucano disciolti nel tampone citrato di sodio 50 mM (pH 5) con pH ottimale (ottenuto al punto 10.1) ed eseguire le reazioni come descritto al punto 7.
3. Per i saggi di termostabilità, procedere come segue:
   1. Prima di iniziare le reazioni, incubare l'enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C per 30 minuti.
   2. Eseguire le reazioni utilizzando substrati disciolti in 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5) e incubare a 25 °C e 40 °C per 24 ore.

11. Valutazione del meccanismo d'azione della β-1,3-glucanasi su diversi substrati di glucano

NOTA: I substrati del glucano contengono lo stesso residuo di glucosio nella loro spina dorsale, ma i legami glicosidici tra le unità di glucopiranosio sono diversi e possono assumere l'orientamento α o β¹⁷. I legami glicosidici possono formarsi tra diversi atomi di carbonio di molecole di glucosio, definendo la loro struttura chimica, ad esempio β-1,3-glucano, β-1,4-glucano e β-1,3-1,4-glucano legato misto (MLG)18,19,20. Il meccanismo d'azione della β-1,3-glucanasi è stato determinato utilizzando campioni di Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn 5 infestati da RWASA2 (fonti enzimatiche) e i seguenti substrati β-1,3-glucano (CM-curdlan), MLG (da orzo) e β-1,4-glucano (AZO-CM-Cellulosa). Il meccanismo d'azione viene determinato in condizioni ottimali di saggio (25 °C e 40 °C, pH 5,0), utilizzando substrati MLG allo 0,1% (p/v) di β-1,4-glucano, 0,4% (p/v) β-1,3-glucano o 0,5% (p/v).

1. Sciogliere i substrati in 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5).
2. Aggiungere 200 μl dell'estratto enzimatico e 300 μl del substrato nelle provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
3. Incubare le reazioni a due temperature separate, 25 °C e 40 °C per 8 ore.
4. Terminazione delle reazioni mediante riscaldamento a 100 °C.
5. Centrifugare la miscela di reazione di β-1,3-glucano e MLG a 10,000 x g per 10 minuti a 4 °C e procedere come descritto al punto 7.3.
6. Per il β-1,4-glucano, dopo aver terminato la reazione a 100 °C, diluire la miscela con 800 μL di etanolo assoluto e centrifugare a 4 °C per 10 min a 10,000 x g.
7. Trasferire il surnatante nelle curve, misurare l'assorbanza a 590 nm con lo spettrofotometro e calcolare l'attività della β-1,3-glucanasi sulla β-1,4-glucano utilizzando la procedura del produttore (vedi Tabella dei materiali) ed esprimere l'attività in Unità/mg di proteine.

12. Determinazione del meccanismo d'azione della β-1,3-glucanasi

NOTA: La modalità d'azione della β Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 indotta da RWASA2-infestate da Tugela-Dn5 è stata analizzata con laminarin-oligosaccaridi (LAM) con un grado di polimerizzazione (DP) compreso tra 5 e 2. Utilizzare il kit per cromatografia su strato sottile (TLC), cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e glucosio ossidasi perossidasi (GOPOD) per determinare la DP necessaria alla β-1,3-glucanasi per idrolizzare il substrato. Il TLC è stato utilizzato per l'analisi qualitativa e l'LC-MS è stato utilizzato per l'analisi quantitativa, che ha determinato la concentrazione degli oligosaccaridi nell'idrolizzato dopo la reazione²¹.

1. Preparare le reazioni della modalità d'azione della β-1,3-glucanasi
   NOTA: Preparare l'estratto proteico concentrato con un filtro a membrana concentrante per centrifuga da 10 kDa, e quindi avere estratti proteici concentrati e non concentrati infestati da RWASA2 per l'esperimento.
   1. Per concentrare gli enzimi estratti da ciascuna cultivar, trasferire 5 mL di estratti nei filtri a membrana concentratori centrifughi da 10 kDa.
   2. Centrifugare le provette filtranti a membrana contenenti estratto a 15.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
   3. Sciogliere la laminaripentaosio (LAM5), la laminaritetraosio (LAM4), la laminaritriosio (LAM3) e la laminaribiosio (LAM2) (vedere la tabella dei materiali) in 50 mM di citrato di sodio (pH 5) per ottenere 10 mg/mL.
   4. Per avviare la reazione, aggiungere 20 μl di estratto proteico e 40 μl di laminaripentaosio (LAM5), laminaritetraosio (LAM4), laminaritriosio (LAM3) e laminaribiosio (LAM2).
   5. Incubare la reazione a 40 °C per 16 ore e terminare con ebollizione a 100 °C per 5 minuti.
2. Eseguire la cromatografia su strato sottile (TLC)
   1. Tagliare 4 lastre di silice in² pezzi da 10 cm e tracciare una linea sulla superficie della piastra, lasciando uno spazio di 1 cm dal fondo di un bordo.
   2. Segna i punti sopra la linea e segnali in base alle diverse cultivar e DP dei laminarin-oligosaccaridi, a 1 cm di distanza e. Prendi 2 piastre di silice per l'estratto proteico concentrato e le altre 2 per gli estratti non concentrati.
   3. Aggiungere 3 μl delle miscele di reazione da 3 a 5 volte sui punti contrassegnati corrispondenti sulla piastra di silice e lasciare asciugare completamente i punti sulla piastra prima di ripetere il processo.
   4. Mettere delicatamente le piastre di silice nel serbatoio TLC contenente la fase mobile di n-butanolo: acido acetico: acqua (2:1:1 v/v/v) con il lato contenente le macchie dei campioni sul fondo.
   5. Lasciare che la fase mobile si sposti dal basso verso l'alto della piastra.
      NOTA: Questo passaggio può richiedere circa 2 ore. Non spostare o disturbare il serbatoio durante la separazione dei campioni.
   6. Togliete le piastre dalla fase mobile e lasciatele asciugare a temperatura ambiente.
   7. Aggiungere la soluzione colorante nel piccolo contenitore, immergere delicatamente la lastra di silice nella soluzione colorante di naftolo allo 0,3% (p/v) in etanolo al 95% (v/v) utilizzando acido solforico al 5% (v/v) per 5 s, rimuoverla e lasciarla asciugare a temperatura ambiente.
      NOTA: A questo punto, accendere il blocco riscaldante/forno e impostare la temperatura a 100 °C.
   8. Mettere le piastre di silice essiccate sul blocco riscaldante e scaldare a 100 °C per 7-10 minuti o fino a quando non compaiono le macchie blu-violacee. Scatta foto delle lastre di silice che mostrano le macchie blu-viola e documentale.
3. Quantificare la concentrazione di idrolizzati laminarin-oligosaccaridi
   NOTA: La concentrazione degli idrolizzati LAM sarà quantificata sia per gli estratti proteici concentrati che per quelli non concentrati²¹.
   1. Aggiungere 20 μl di ciascun campione su una colonna C18 (carboidrati 4,6 × 250 mm) e lasciare separare a una velocità di flusso di 500 μl/min utilizzando un gradiente di acqua (solvente A) e acetonitrile (solvente B) dal 100% B al 60% B in 10 minuti, seguito da fasi di riequilibrio della colonna con un tempo di esecuzione totale di 20 minuti per consentire il riequilibrio della colonna.
   2. Ionizzare gli analiti a rilascio in modalità elettrospray negativo nella sorgente ionica per spettrometria di massa con una temperatura di riscaldamento di 400 °C per far evaporare il solvente in eccesso, 30 psi di gas di nebulizzazione, 30 psi di gas di riscaldamento e 20 psi di gas di cortina.
   3. Impostare il potenziale di declustering a 350 V.
   4. Analizzare gli analiti eluiti sullo spettrometro di massa in una modalità di scansione Q1 che va da 150 Da a 1000 Da con un tempo di permanenza di 3 s.
   5. Registrare le concentrazioni degli analiti sul foglio di calcolo.
4. Quantificare la concentrazione di glucosio
   1. Analizzare la concentrazione di glucosio prodotta dall'idrolisi della laminarina utilizzando il reagente GOPOD seguendo le istruzioni del produttore^22,23.
   2. Misurare l'assorbanza a 510 nm in modalità fissa dello spettrofotometro.

13. Raccolta e analisi dei dati

1. Randomizzare tutti gli esperimenti per evitare distorsioni durante l'infestazione o la raccolta del campione e condurre l'analisi in quadruplicati.
2. Salvo diversa indicazione, utilizzare i mezzi ± deviazione standard per rappresentare i valori nei grafici e nelle tabelle generati dai dati sperimentali raccolti.
3. Utilizzare Microsoft Excel per analizzare tutti i dati e generare grafici.
4. Esegui analisi statistiche con software compatibile.
   NOTA: eseguire l'analisi multifattoriale della varianza (ANOVA) per verificare la significatività tra i trattamenti e l'LSD di Fisher per verificare la presenza di gruppi omogenei a un valore alfa di 0,05.

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Risultati

Quattro repliche biologiche di cultivar di frumento (Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5) sono state infestate da RWASA2 nella fase di crescita a 3 foglie. Dopo l'infestazione, le foglie sono state raccolte a 1, 2, 3, 7 e 14 dpi. I trattamenti di controllo non sono stati infestati con RWASA2 per rendere i risultati dell'esperimento paragonabili a quelli delle piante di grano non esposte a stress. Gli esperimenti sono stati condotti in quadruplicati e i risultati sono stati presentati come valori medi.

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Discussione

Il grano e l'orzo sono colture cerealicole frequentemente infestate da specie di afidi, tra cui gli afidi russi del grano (Diuraphis noxia)^7,24. Le piante di grano resistenti inducono l'upregolazione delle attività della POD e della β-1,3-glucanasi come risposte di difesa durante il periodo di infestazione per modificare la parete cellulare regolando l'accumulo di calclosio e lignina 6,25,26,27...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.