Chiarire le proprietà fisico-chimiche di #946;-1,3-glucanasi e perossidasi del meccanismo di difesa della parete cellulare del grano contro l'infestazione da Diuraphis noxia

Riepilogo

Il presente protocollo descrive le procedure utilizzate per studiare e caratterizzare gli enzimi correlati alla parete cellulare, principalmente β-1,3-glucanasi e perossidasi, nelle piante di frumento. I loro livelli di attività aumentano durante l'interazione grano-RWA e sono coinvolti nella risposta di difesa delle piante attraverso il rinforzo della parete cellulare, che scoraggia l'alimentazione degli afidi.

Abstract

Le piante di grano infestate dagli afidi russi del grano (RWA) inducono una cascata di risposte di difesa, tra cui le risposte di ipersensibilità (HR) e l'induzione di proteine correlate alla patogenesi (PR), come la β-1,3-glucanasi e la perossidasi (POD). Questo studio mira a caratterizzare le proprietà fisico-chimiche della POD associata alla parete cellulare e della β-1,3-glucanasi e a determinare il loro sinergismo sulla modifica della parete cellulare durante l'interazione RWASA2-grano. Le cultivar Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 suscettibili, moderatamente resistenti sono state pregerminate e piantate in serra, fertilizzate 14 giorni dopo la semina e irrigate ogni 3 giorni. Le piante sono state infestate da 20 individui partenogenetici dello stesso clone RWASA2 allo stadio di 3 foglie e le foglie sono state raccolte da 1 a 14 giorni dopo l'infestazione. Il liquido di lavaggio intercellulare (IWF) è stato estratto mediante filtrazione sottovuoto e conservato a -20 °C. I residui fogliari sono stati frantumati in polvere e utilizzati per i componenti della parete cellulare. L'attività e la caratterizzazione del POD sono state determinate utilizzando 5 mM di substrato di guaiacolo e H₂O₂, monitorando la variazione dell'assorbanza a 470 nm. L'attività della β-1,3-glucanasi, il pH e le condizioni ottimali di temperatura sono stati dimostrati misurando gli zuccheri riducenti totali nell'idrolizzato con il reagente DNS utilizzando substrati di β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, misurando l'assorbanza a 540 nm e utilizzando la curva standard del glucosio. Il pH ottimale è stato determinato tra pH 4 e 9, la temperatura ottimale tra 25 e 50 °C e la stabilità termica tra 30 °C e 70 °C. La specificità del substrato di β-1,3-glucanasi è stata determinata a 25 °C e 40 °C utilizzando substrati di cagliata e orzo β-1,3-1,4-glucano. Inoltre, la modalità d'azione della β-1,3-glucanasi è stata determinata utilizzando la laminaribiosio alla laminaripentasio. I modelli di prodotti dell'idrolisi degli oligosaccaridi sono stati analizzati qualitativamente con cromatografia su strato sottile (TLC) e analizzati quantitativamente con HPLC. Il metodo presentato in questo studio dimostra un approccio robusto per infestare il grano con RWA, estraendo la perossidasi e la β-1,3-glucanasi dalla regione della parete cellulare e la loro caratterizzazione biochimica completa.

Introduzione

Gli afidi russi del grano (RWA) infestano il grano e l'orzo, causando una significativa perdita di resa o una riduzione della qualità del grano. Il frumento risponde all'infestazione inducendo diverse risposte di difesa, tra cui l'aumento dei livelli di attività della β-1,3-glucanasi e della perossidasi nelle cultivar resistenti, mentre le cultivar sensibili riducono l'attività di questi enzimi nel periodo di infestazione precoce 1,2,3,4. Le funzioni chiave della β-1,3-glucanasi e della POD nella pianta di frumento includevano la regolazione....

Protocollo

Lo studio è stato condotto con l'approvazione e il permesso del Comitato Etico per la Ricerca Ambientale e sulla Biosicurezza dell'Università del Free State (UFS-ESD2022/0131/22). I dettagli dei reagenti e dell'attrezzatura qui sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Condizioni di crescita delle piante

1. Germinare 250 semi di ogni cultivar di grano, cioè Tugela suscettibile, Tugela-Dn1 moderatamente resistente e Tugela-Dn5 resistente, in piastre di Petri separate.
2. Aggiungere 5 ml di acqua distillata in ciascuna capsula di Petri, sigillare con una pellicola di paraff....

Discussione

Il grano e l'orzo sono colture cerealicole frequentemente infestate da specie di afidi, tra cui gli afidi russi del grano (Diuraphis noxia)^7,24. Le piante di grano resistenti inducono l'upregolazione delle attività della POD e della β-1,3-glucanasi come risposte di difesa durante il periodo di infestazione per modificare la parete cellulare regolando l'accumulo di calclosio e lignina 6,25,26,27.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.