阐明小麦细胞 壁防御机制 的 #946;-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的物理化学特性

摘要

本方案描述了用于研究和表征小麦植物中细胞壁相关酶（主要是 β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶）的程序。在小麦-RWA 相互作用期间，它们的活性水平增加，并通过细胞壁加固参与植物防御反应，从而阻止蚜虫取食。

摘要

受俄罗斯小麦蚜虫 （RWA） 侵染的小麦植株会诱导一连串防御反应，包括超敏反应 （HR） 和发病机制相关 （PR） 蛋白的诱导，例如 β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶 （POD）。本研究旨在表征细胞壁相关 POD 和 β-1,3-葡聚糖酶的物理化学性质，并确定它们在 RWASA2-小麦相互作用过程中对细胞壁修饰的协同作用。在温室条件下对易感 Tugela、中度抗性 Tugela-Dn1 和抗性 Tugela-Dn5 栽培品种进行预发芽和种植，种植后 14 天施肥，每 3 天灌溉一次。植物在 3 叶期被 20 个相同 RWASA2 克隆的孤雌个体侵染，并在侵染后 1 至 14 天收获叶片。使用真空过滤提取细胞间洗涤液 （IWF） 并储存在 -20 °C。 将叶残留物粉碎成粉末，用于细胞壁成分。使用 5 mM 愈创木酚底物和 H₂O₂ 测定 POD 活性和表征，监测 470 nm 处吸光度的变化。通过使用 β-1,3-葡聚糖和 β-1,3-1,4-葡聚糖底物用 DNS 试剂测量水解物中的总还原糖，测量 540 nm 处的吸光度，并使用葡萄糖标准曲线，证明了 β-1,3-葡聚糖酶活性、pH 值和温度最佳条件。在 pH 4 至 9 之间测定最适 pH 值，在 25 至 50 °C 之间测定最佳温度，在 30 °C 至 70 °C 之间测定热稳定性。在 25 °C 和 40 °C 下使用可得然胶和大麦 β-1,3-1,4-葡聚糖酶底物测定 β-1,3-3-葡聚糖酶底物特异性。此外，使用海带二糖到海带五糖测定 β-1,3-葡聚糖酶的作用模式。用薄层色谱 （TLC） 定性分析寡糖水解产物模式，并用 HPLC 定量分析。本研究中提出的方法展示了一种用 RWA 感染小麦、从细胞壁区域提取过氧化物酶和 β-1,3-葡聚糖酶及其综合生化表征的稳健方法。

引言

俄罗斯小麦蚜虫 （RWA） 侵扰小麦和大麦，导致产量严重损失或谷物质量下降。小麦通过诱导多种防御反应来响应侵染，包括增加抗性品种的 β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶活性水平，而易感品种在侵染早期降低这些酶的活性 1,2,3,4。β-1,3-葡聚糖酶和 POD 在小麦植株中的关键功能包括调节抗性品种中的胼胝质积累以及在 RWA 侵染期间细胞壁和质外体区域的活性氧 （ROS） 淬灭 ^1,3,5,6,7。Mafa 等^{人6 证明}，RWASA2 侵染后抗性小麦品种中 POD 活性的增加与木质素含量的增加之间存在很强的相关性。此外，木质素含量的增加表明受侵染的抗性小麦品种的细胞壁得到加强，导致 RWA 取食减少。

大多数研究小组在小麦/大麦-RWA 相互作用过程中提....

研究方案

该研究是在自由州大学环境和生物安全研究伦理委员会 （UFS-ESD2022/0131/22） 的批准和许可下进行的。此处的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 植物生长条件

1. 在单独的培养皿中发芽每个小麦品种的 250 粒种子，即易感的 Tugela、中度抗性的 Tugela-Dn1 和抗性的 Tugela-Dn5。
2. 在每个培养皿中加入 5 mL 蒸馏水，用石蜡膜密封，并在 25 °C 的发芽室中孵育 2 天。
3. 在受控的温室条件下，将每个栽培品种的发芽种子移植到 15 厘米的花盆中，花盆中含有 1：1 的土壤和泥炭苔（每盆 15 株）。
4. 在夜间和白天将温度分别设置为 18 °C 和 24 °C。
5. 每 3 天使用自来水灌溉一次植物，并在发芽后 2 天向它们提供 14 克/升肥料。
6. 将植物放在用网包裹的笼子里，让它们生长到第三个叶子阶段 ^2,6（每个品种有四个生物重复）。

2. 小麦品种 RWASA2 侵染

1. 根据 Jim....

讨论

小麦和大麦是经常受到蚜虫物种侵扰的谷类作物，包括俄罗斯小麦蚜虫 （Diuraphis noxia）^7,24。抗性小麦植物诱导 POD 和 β-1,3-葡聚糖酶活性的上调，作为整个侵染期间的防御反应，通过调节胼胝质和木质素积累来改变细胞壁 6,25,26,27。值得注意的是，大.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.