阐明小麦细胞 壁防御机制 的 #946;-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的物理化学特性

摘要

本方案描述了用于研究和表征小麦植物中细胞壁相关酶（主要是 β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶）的程序。在小麦-RWA 相互作用期间，它们的活性水平增加，并通过细胞壁加固参与植物防御反应，从而阻止蚜虫取食。

摘要

受俄罗斯小麦蚜虫 （RWA） 侵染的小麦植株会诱导一连串防御反应，包括超敏反应 （HR） 和发病机制相关 （PR） 蛋白的诱导，例如 β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶 （POD）。本研究旨在表征细胞壁相关 POD 和 β-1,3-葡聚糖酶的物理化学性质，并确定它们在 RWASA2-小麦相互作用过程中对细胞壁修饰的协同作用。在温室条件下对易感 Tugela、中度抗性 Tugela-Dn1 和抗性 Tugela-Dn5 栽培品种进行预发芽和种植，种植后 14 天施肥，每 3 天灌溉一次。植物在 3 叶期被 20 个相同 RWASA2 克隆的孤雌个体侵染，并在侵染后 1 至 14 天收获叶片。使用真空过滤提取细胞间洗涤液 （IWF） 并储存在 -20 °C。 将叶残留物粉碎成粉末，用于细胞壁成分。使用 5 mM 愈创木酚底物和 H₂O₂ 测定 POD 活性和表征，监测 470 nm 处吸光度的变化。通过使用 β-1,3-葡聚糖和 β-1,3-1,4-葡聚糖底物用 DNS 试剂测量水解物中的总还原糖，测量 540 nm 处的吸光度，并使用葡萄糖标准曲线，证明了 β-1,3-葡聚糖酶活性、pH 值和温度最佳条件。在 pH 4 至 9 之间测定最适 pH 值，在 25 至 50 °C 之间测定最佳温度，在 30 °C 至 70 °C 之间测定热稳定性。在 25 °C 和 40 °C 下使用可得然胶和大麦 β-1,3-1,4-葡聚糖酶底物测定 β-1,3-3-葡聚糖酶底物特异性。此外，使用海带二糖到海带五糖测定 β-1,3-葡聚糖酶的作用模式。用薄层色谱 （TLC） 定性分析寡糖水解产物模式，并用 HPLC 定量分析。本研究中提出的方法展示了一种用 RWA 感染小麦、从细胞壁区域提取过氧化物酶和 β-1,3-葡聚糖酶及其综合生化表征的稳健方法。

引言

俄罗斯小麦蚜虫 （RWA） 侵扰小麦和大麦，导致产量严重损失或谷物质量下降。小麦通过诱导多种防御反应来响应侵染，包括增加抗性品种的 β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶活性水平，而易感品种在侵染早期降低这些酶的活性 1,2,3,4。β-1,3-葡聚糖酶和 POD 在小麦植株中的关键功能包括调节抗性品种中的胼胝质积累以及在 RWA 侵染期间细胞壁和质外体区域的活性氧 （ROS） 淬灭 ^1,3,5,6,7。Mafa 等^{人6 证明}，RWASA2 侵染后抗性小麦品种中 POD 活性的增加与木质素含量的增加之间存在很强的相关性。此外，木质素含量的增加表明受侵染的抗性小麦品种的细胞壁得到加强，导致 RWA 取食减少。

大多数研究小组在小麦/大麦-RWA 相互作用过程中提取并研究了质外体 β-1,3-葡聚糖酶和 POD;此外，这些研究中的大多数声称这些酶会影响受 RWA 侵染的小麦植株的细胞壁，而没有测量细胞壁区域中酶的存在。只有少数研究使用显微技术表明 β-1,3-葡聚糖酶活性水平与胼胝质调节 ^7,8,9 有关，或提取主要细胞壁成分以证明 POD 活性与抗性细胞壁修饰之间的相关性 ^6,10。缺乏探测 β-1,3-葡聚糖酶和 POD 与细胞壁的结合表明需要开发允许研究人员直接测量细胞壁结合酶的方法。

目前的方法提出，在提取细胞壁结合酶之前，有必要从叶组织中去除质外体液。质外体液的提取程序必须从叶组织中进行两次，用于提取细胞壁结合酶。这个过程减少了质外体酶与细胞壁区域中发现的质外体酶的污染和混淆。因此，在本研究中，我们提取了细胞壁结合的 POD、β-1,3-葡聚糖酶和 MLG 特异性 β-葡聚糖酶，并进行了它们的生化表征。

研究方案

该研究是在自由州大学环境和生物安全研究伦理委员会 （UFS-ESD2022/0131/22） 的批准和许可下进行的。此处的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 植物生长条件

1. 在单独的培养皿中发芽每个小麦品种的 250 粒种子，即易感的 Tugela、中度抗性的 Tugela-Dn1 和抗性的 Tugela-Dn5。
2. 在每个培养皿中加入 5 mL 蒸馏水，用石蜡膜密封，并在 25 °C 的发芽室中孵育 2 天。
3. 在受控的温室条件下，将每个栽培品种的发芽种子移植到 15 厘米的花盆中，花盆中含有 1：1 的土壤和泥炭苔（每盆 15 株）。
4. 在夜间和白天将温度分别设置为 18 °C 和 24 °C。
5. 每 3 天使用自来水灌溉一次植物，并在发芽后 2 天向它们提供 14 克/升肥料。
6. 将植物放在用网包裹的笼子里，让它们生长到第三个叶子阶段 ^2,6（每个品种有四个生物重复）。

2. 小麦品种 RWASA2 侵染

1. 根据 Jimoh 等人 ¹¹ 以及 Mohase 和 Taiwe¹²，用 RWASA2 感染 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 小麦品种。
2. 将植物分成两组单独的笼子;在用网覆盖的生长室的每个花盆中，每株植物用 20 个相同 RWASA2 克隆的孤雌个体感染一组。将另一组小麦植株放在生长室下方的单独房间里，用干净的网，并将它们作为对照。
   注意：将两种处理方法保存在不同的房间中，并将植物盖在网中的笼子中。此外，在研究中使用两种不同的 RWA 生物型的情况下，请尽可能将受一种 RWA 生物型侵染的植物与受第二种生物型侵染的植物保持在生长室下的单独房间中，以避免 RWASA2 的任何可能的交叉污染。
3. 收获时，选择两种不同的时间，短期饲喂期（1、2 和 3 天）和长期饲喂期（7 天和 14 天），并选择第二片和第三片叶子，并用湿纸巾包裹。
4. 在细胞间清洗液 （IWF） 提取之前，立即将收获的叶子转移到装有冰的盒子中，以减少叶子代谢。

3. 从质外体中提取细胞间洗涤液 （IWF）

1. 将大约三个小麦品种收获的叶子切成 7 厘米的小块。
2. 用蒸馏水冲洗叶片两次，以去除切割端 ^6,13 的任何胞质污染。
3. 将叶片插入厚壁玻璃管中，将样品浸入提取缓冲液 （50 mM Tris-HCl，pH 7.8） 中。
4. 使用水喷射泵真空渗透 5 分钟，用提取缓冲液浸渍叶子。
5. 此后，从玻璃管中取出叶片，用纸巾吸干。
6. 将干燥的叶片垂直插入装有多孔盘的预冷离心管中，并在 4 °C 下以 500 x g 离心 10 分钟。
7. 使用 100 μL 移液器将上清液收集到预冷的 1.5 mL 微量离心管中。
8. 使用相同的叶子材料重复整个提取过程。
9. 合并收集的上清液并将其储存在 -20°C。
   注意：上清液等分试样被视为质外体含量或 IWF 的来源。目前的研究中没有使用 IWF，但在我们提取细胞壁结合的 β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶 （POD） 之前，将其从叶组织中去除是很重要的。

4. 提取细胞壁相关的 β-1,3-葡聚糖酶和 POD

注：IWF 提取后留下的叶残留物用于提取总细胞壁蛋白。

1. 用研钵和研杵将叶子残留物用液氮粉碎成细粉。
2. 将大约 200 mg 粉末状叶组织转移到含有 4 mL 提取缓冲液（50 mM 磷酸钠和 1% （w/v） 聚乙烯聚吡咯烷酮 （PVPP;pH 值 5.0））的研钵中，然后用杵研磨成光滑的糊状物，然后将其转移到微量离心管中。
3. 将混合物在微量离心管中在冰上孵育 3 分钟，然后在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 15 分钟。
4. 将上清液（总蛋白提取物）收集在微量离心管中（2 mL 等分试样），并将其用作整个研究中 β-1,3-葡聚糖酶和 POD 的来源。

5. 蛋白质标准品的测定

1. 按照 Bradford 方法¹⁴ 测定提取物的总蛋白浓度。
2. 制备浓度为 0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL 和 1.0 mg/mL 的牛血清白蛋白 （BSA） 溶液，溶于 50 mM 磷酸钠缓冲液中，以生成蛋白质标准品。
3. 通过将 10 μL 每种 BSA 溶液加入 96 孔微孔板中，加入 190 μL （0.25% v/v） 的 Bradford 试剂来制备标准品（参见 材料表）。
4. 在 25 °C 下孵育 20 分钟，使用酶标仪测量 595 nm 处的吸光度，并使用吸光度值制备用于定量蛋白质浓度的标准曲线。
5. 定量蛋白质浓度
   1. 将 10 μL 提取的酶（步骤 4）加入 96 孔微孔板中，加入 190 μL （0.25% v/v） 的 Bradford 试剂，一式三份。
   2. 在室温 （25 °C） 下孵育 20 分钟。
   3. 使用带有酶标仪的分光光度计测量 595 nm 处的吸光度，并使用吸光度值确定使用 BSA 作为蛋白质标准品的蛋白质浓度（在步骤 5.4 中制备）。

6. 制备 β-1,3-葡聚糖酶活性的葡萄糖标准品

1. 制备浓度在 0.00 mg/mL 和 1.0 mg/mL（0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL）之间的标准溶液，葡萄糖溶于蒸馏水中。
2. 将 300 μL 每种葡萄糖溶液和 600 μL 3,5-二硝基水杨酸 （DNS） 试剂以 1：2 的比例加入 1.5 mL 微量离心管中，并在 100 °C 下孵育反应 5 分钟（参见 DNS 试剂 材料表 ）（Miller 等人 ¹⁵）。
3. 让混合物在室温下冷却，然后使用分光光度计测量 540 nm 处的吸光度。
4. 使用平均吸光度值绘制用于测定 β-1,3-葡聚糖酶活性的标准曲线。

7. 测定 β-1,3-葡聚糖酶活性测定

注：从 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 中提取的细胞壁结合 β-1,3-葡聚糖酶的酶活性由使用 Miller 等人描述的改良方法水解 0.5% （w/v） 混合连接 β-1,3-4-葡聚糖 （MLG） 和 0.4% （w/v） β-1,3-葡聚糖底物水解释放的总还原糖的量来确定¹⁵.始终将装有蛋白质等分试样的试管放在冰上。如果样品被冷冻，请在冰上解冻，并在解冻后立即进行。

1. 将 200 μL 酶提取物（除非另有说明，否则所有反应中的蛋白质浓度保持在 20 μg/mL 至 90 μg/mL）和 300 μL 溶于 50 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH 5.0） 中的底物加入 1.5 mL 微量离心管中。
   注：对所有底物（第一个空白）进行没有酶提取物的平行空白反应，酶空白由没有底物的酶提取物组成（第二个空白）。底物和酶提取物分别被第一和第二黑色的缓冲液替换。
2. 将反应物在37°C孵育24小时，并在100°C下加热5分钟终止反应，然后在4°C下以10,000× g 离心10分钟。
3. 将 300 μL 上清液与 600 μL DNS 试剂（1：2 比例）混合到新的 1.5 mL 微量离心管中，并在 100 °C 下煮沸 5 分钟。
4. 让溶液冷却至室温，并使用分光光度计测量 540 nm 处的吸光度。
   注意：如果混合物中总还原糖的浓度高，则会产生深棕色溶液，使用分光光度计很难读取。因此，在读取吸光度之前，必须进一步稀释样品。
5. 使用上述步骤 6.4 中开发的葡萄糖标准曲线来确定标准曲线的 SI 单位中的酶活性。
6. 要将活性转换为以 μmol 葡萄糖/h/mg 蛋白质表示的特异性活性，请使用以下公式：
   比活度 = [（酶活度/180.16）*1000]/时间/蛋白质浓度
   注：将酶活性（以 mg/mL 为单位）转换为 g/mL;180.16 g/mol 是葡萄糖的分子量，1000 是将 M 转化为微摩尔的因子，时间是反应周期，蛋白质提取物浓度以 mg/mL 表示。一个单位的 β-1,3-葡聚糖酶活性定义为在 1 小时反应期内从底物释放的 1 μmol 葡萄糖。

8. 测定过氧化物酶 （POD） 活性

注：通过定量愈创木酚¹⁶ 每单位时间产生的四愈创木酚的形成，确定 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 小麦品种的细胞壁结合过氧化物酶活性。

1. 在 25 °C 下将 30 μL 酶提取物、30 μL 1% （v/v） H₂O₂ 和 970 μL 5 mM 愈创木酚加入比色皿中。
   注：进行不含酶提取物的空白反应（第一个空白），对于没有底物的酶样品，进行另一个空白（第二个空白）。在第一个和第二个空白中分别用 50 mM 磷酸钠缓冲液替换酶或底物样品。
2. 使用分光光度计的动力学模式监测 470 nm 处的吸光度变化。
3. 确定图形呈线性的斜率，并将其用作吸光度值。
4. 计算平均吸光度并将其用于计算 POD 活性。
5. 使用愈创木酚的摩尔消光系数 （26.6 mM ^-1cm ^-1 ） 计算过氧化物酶活性，并以 μmol tetra-guaiacol / min / mg蛋白质表达活性。
6. 使用 Mafa 等人使用的方程式计算 POD 活性 ⁶：
   POD 活性 = [（ΔABS × DF） ÷ 蛋白质浓度] × 26.6 ^{mM-1 cm-1} × 1 cm
   注：其中 ΔABS = 平均吸光度;DF = 稀释因子;26.6 mM ^-1cm ^-1 = 愈创木酚消光系数。

9. POD 表征

注：按照步骤 8 中描述的类似方法，使用 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 的感染后 3 天 （dpi） 酶提取物进行 POD 表征测定，反应缓冲液和温度略有变化。在进行实验时，酶样品始终保存在冰上。将反应一式四份进行，并进行平行空白反应。

1. 为了获得理想的 pH 测定，请执行以下步骤。
   1. 将愈创木酚底物溶解在 50 mM 缓冲液（柠檬酸钠，pH 4 和 5）、磷酸钠（pH 6 和 7）和 Tris-HCl（pH 8 和 9）中（参见 材料表）。
   2. 如步骤 8 中所述，在 25 °C 下运行反应。
2. 为了获得最佳温度测定，请执行以下步骤。
   1. 分别在 25 °C、30 °C、40 °C 和 50 °C 下运行反应。
   2. 使用溶解在 pH 值为 5（最佳 pH 值）缓冲液中的愈创木酚底物，并按照步骤 8 中的说明进行反应。
3. 对于热稳定性测定，请执行以下步骤。
   1. 在开始反应之前，将酶在 37 °C、50 °C 和 70 °C 下孵育 30 分钟。
   2. 根据步骤 8 中描述的方法，使用 50 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH 5） 并在 40 °C（最佳温度）下运行反应。

10. β-1,3-葡聚糖酶表征

注：按照步骤 7 中描述的方法使用 3 dpi 酶提取物进行表征测定，对反应缓冲液和温度进行一些修改。一式四份运行反应，每种底物平行空白反应。

1. 为了获得最佳 pH 测定，请执行以下操作：
   1. 将 MLG 和 β-1,3-葡聚糖底物溶解在 50 mM 缓冲液（柠檬酸钠，pH 4 和 5）、磷酸钠（pH 6 和 7）和 Tris-HCl（pH 8 和 9）中。
   2. 按照步骤 7 中的说明运行反应。
2. 为了获得最佳温度测定，请执行以下操作：
   1. 分别在 25 °C、30 °C、40 °C 和 50 °C 下运行反应。
   2. 使用溶解在 50 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH 5） 中的 MLG 和 β-1,3-葡聚糖底物和最佳 pH 值（在步骤 10.1 中获得），并按照步骤 7 中的说明运行反应。
3. 对于热稳定性测定，请按以下步骤进行：
   1. 在开始反应之前，将酶在 37 °C、50 °C 和 70 °C 下孵育 30 分钟。
   2. 使用溶解在 50 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH 5） 中的底物进行反应，并在 25 °C 和 40 °C 下孵育 24 小时。

11. 评估 β-1,3-葡聚糖酶对不同葡聚糖底物的作用机制

注：葡聚糖底物在其骨架中含有相同的葡萄糖残基，但吡喃葡萄糖单元之间的糖苷键多种多样，可以采取α或β方向¹⁷。糖苷键可以在葡萄糖分子的几个碳原子之间形成，定义它们的化学结构，例如 β-1,3-葡聚糖、β-1,4-葡聚糖和混合键合β-1,3-1,4-葡聚糖 （MLG）18,19,20。使用 RWASA2 感染的 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn 5 样品（酶源）和以下底物 β-1,3-葡聚糖 （CM-curdlan）、MLG（来自大麦）和 β-1,4-葡聚糖 （AZO-CM-Cellulose） 来确定 β-1,3-葡聚糖酶的作用机制。在最佳测定条件（25°C 和 40°C，pH 5.0）下，使用 0.1% （w/v） β-1,4-葡聚糖、0.4% （w/v） β-1,3-葡聚糖或 0.5% （w/v） MLG 底物确定作用机制。

1. 将底物溶解在 50 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH 5） 中。
2. 将 200 μL 酶提取物和 300 μL 底物添加到 1.5 mL 微量离心管中。
3. 将反应物在两个不同的温度（25 °C 和 40 °C）下孵育 8 小时。
4. 通过在 100 °C 下加热终止反应。
5. 将 β-1,3-葡聚糖和 MLG 的反应混合物在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟，然后按照步骤 7.3 中的说明进行。
6. 对于 β-1,4-葡聚糖，在 100 °C 终止反应后，用 800 μL 无水乙醇稀释混合物，并在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟。
7. 将上清液转移到 Curvets 中，用分光光度计测量 590 nm 处的吸光度，并使用制造商的程序计算 β-1,3-葡聚糖酶对 β-1,4-葡聚糖酶的活性（参见 材料表），并以单位/mg 蛋白质表示活性。

12. 确定 β-1,3-葡聚糖酶的作用方式

注：用聚合度 （DP） 在 5 到 2 之间的海带多糖-低聚糖 （LAM） 测定 RWASA2 感染的 Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5 诱导的 β-1,3-葡聚糖酶的作用模式。使用薄层色谱 （TLC）、液相色谱-质谱 （LC-MS） 和葡萄糖氧化酶过氧化物酶 （GOPOD） 试剂盒确定 β-1,3-葡聚糖酶水解底物所需的 DP。TLC 用于定性分析，LC-MS 用于定量分析，测定反应后水解产物中低聚糖的浓度²¹。

1. 制备 β-1,3-葡聚糖酶作用模式的反应
   注意：用 10 kDa 离心浓缩膜过滤器制备浓缩的蛋白质提取物，从而获得用于实验的浓缩和非浓缩 RWASA2 感染的蛋白质提取物。
   1. 为了浓缩从每个培养品种中提取的酶，将 5 mL 的提取物转移到 10 kDa 离心浓缩膜过滤器中。
   2. 将含有提取物的膜滤管在 4 °C 下以 15,000 x g 离心 30 分钟。
   3. 将海带五糖 （LAM5）、海带四糖 （LAM4）、海带三糖 （LAM3） 和海带二糖 （LAM2）（参见 材料表）溶解在 50 mM 柠檬酸钠 （pH 5） 中，制成 10 mg/mL。
   4. 要开始反应，加入 20 μL 蛋白质提取物和 40 μL 海带五糖 （LAM5）、海带四糖 （LAM4）、海带三糖 （LAM3） 和海带二糖 （LAM2）。
   5. 将反应物在 40 °C 下孵育 16 小时，然后在 100 °C 下煮沸 5 分钟终止。
2. 进行薄层色谱 （TLC）
   1. 将 4 块二氧化硅板切成 10 厘米² 的小块，并在板的表面画一条线，从一个边缘的底部留出 1 厘米的空间。
   2. 在线上标记点，并根据不同的品种和海带多糖低聚糖的 DP 标记它们，相距 1 厘米和。取 2 个硅胶板用于浓缩蛋白提取物，另外 2 个用于非浓缩提取物。
   3. 在硅胶板上的相应标记点上加入 3 μL 反应混合物 3 至 5 次，让板上的斑点完全干燥，然后重复该过程。
   4. 轻轻地将二氧化硅板放入含有正丁醇流动相的TLC槽中：乙酸：水（2：1：1 v / v / v），底部包含样品斑点的一侧。
   5. 让流动相从板的底部移动到顶部。
      注意：此步骤可能需要大约 2 小时。样品分离时，请勿移动或干扰槽。
   6. 从流动相中取出板，让它们在室温下干燥。
   7. 将染色液加入小容器中，将二氧化硅板轻轻浸入 0.3% （w/v） 萘酚的染色液中，溶于 95% （v/v） 乙醇中，使用 5% （v/v） 硫酸 5 s，将其取出，然后使其在室温下干燥。
      注意：在此步骤中，打开加热块/烘箱并将温度设置为 100 °C。
   8. 将干燥的二氧化硅板放在加热块上，在 100 °C 下加热 7-10 分钟或直到出现蓝紫色斑点。拍摄显示蓝紫色斑点的二氧化硅板的照片并记录它们。
3. 定量海带多糖-低聚糖水解物的浓度
   注：将对浓缩和非浓缩蛋白质提取物的 LAM 水解物浓度进行定量²¹。
   1. 在 C18（碳水化合物 4.6 × 250 mm）色谱柱上加入每个样品 20 μL，以 500 μL/min 的流速使用水（溶剂 A）和乙腈（溶剂 B）梯度从 100% B 分离至 60% B，持续 10 min，然后进行色谱柱重新平衡步骤，总运行时间为 20 min，以实现色谱柱再平衡。
   2. 在加热器温度为 400 °C 的质谱离子源中，以负离子电喷雾模式电离洗脱分析物，以蒸发过量的溶剂、30 psi 雾化器气体、30 psi 加热器气体和 20 psi 帘式气体。
   3. 将解聚电位设置为 350 V。
   4. 在质谱仪上以 150 Da 至 1000 Da 的 Q1 扫描模式分析洗脱分析物，停留时间为 3 s。
   5. 在电子表格上记录分析物的浓度。
4. 定量葡萄糖浓度
   1. 按照制造商的说明使用 GOPOD 试剂分析海带多糖水解产生的葡萄糖浓度^22,23。
   2. 在分光光度计的固定模式下测量 510 nm 处的吸光度。

13. 数据收集和分析

1. 随机化所有实验以避免感染或样本采集过程中的偏差，并一式四份进行分析。
2. 除非另有说明，否则使用均值±标准差来表示从收集的实验数据生成的图形和表格中的值。
3. 使用 Microsoft Excel 分析所有数据并生成图表。
4. 使用兼容的软件执行统计分析。
   注：执行多因素方差分析 （ANOVA） 以检验处理和 Fisher LSD 之间的显着性，以 alpha 值为 0.05 检验同质组。

结果

小麦品种的四个生物学重复品种 （Tugela、Tugela-Dn1 和 Tugela-Dn5） 在 3 叶生长阶段被 RWASA2 侵染。侵染后，以 1 、 2 、 3 、 7 和 14 dpi 收获叶子。对照处理未被 RWASA2 侵染，使实验结果与未受到胁迫的小麦植株相当。实验一式四份进行，结果以平均值表示。

使用 BSA 作为蛋白质标准品对 RWASA2 感染和对照提取物的蛋白质浓度进行定量。这在测定 β-1,3-葡聚糖酶和 POD 的...

讨论

小麦和大麦是经常受到蚜虫物种侵扰的谷类作物，包括俄罗斯小麦蚜虫 （Diuraphis noxia）^7,24。抗性小麦植物诱导 POD 和 β-1,3-葡聚糖酶活性的上调，作为整个侵染期间的防御反应，通过调节胼胝质和木质素积累来改变细胞壁 6,25,26,27。值得注意的是，大...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.