Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması

Özet

Mevcut protokol, buğday bitkilerinde başta β-1,3-glukanaz ve peroksidaz olmak üzere hücre duvarı ile ilgili enzimleri incelemek ve karakterize etmek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Buğday-RWA etkileşimi sırasında aktivite seviyeleri artar ve yaprak biti beslenmesini caydıran hücre duvarı takviyesi yoluyla bitki savunma tepkisinde yer alır.

Özet

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) tarafından istila edilen buğday bitkileri, aşırı duyarlı tepkiler (HR) ve β-1,3-glukanaz ve peroksidaz (POD) gibi patogenezle ilgili (PR) proteinlerin indüksiyonu dahil olmak üzere bir dizi savunma tepkisine neden olur. Bu çalışma, hücre duvarı ile ilişkili POD ve β-1,3-glukanazın fizikokimyasal özelliklerini karakterize etmeyi ve RWASA2-buğday etkileşimi sırasında hücre duvarı modifikasyonu üzerindeki sinerjilerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Duyarlı Tugela, orta derecede dayanıklı Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5 çeşitleri sera koşullarında önceden çimlendirilerek ekildi, ekimden 14 gün sonra gübrelendi ve her 3 günde bir sulandı. Bitkiler, 3 yapraklı aşamada aynı RWASA2 klonunun 20 partenogenetik bireyi ile istila edildi ve yapraklar istiladan 1 ila 14 gün sonra hasat edildi. Hücreler arası yıkama sıvısı (IWF), vakum filtrasyonu kullanılarak ekstrakte edildi ve -20 °C'de saklandı. Yaprak kalıntıları toz haline getirildi ve hücre duvarı bileşenleri için kullanıldı. POD aktivitesi ve karakterizasyonu, 5 mM guaiacol substratı ve H₂O₂ kullanılarak belirlendi ve 470 nm'de absorbanstaki değişiklik izlendi. β-1,3-glukanaz aktivitesi, pH ve sıcaklık optimum koşulları, β-1,3-glukan ve β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak DNS reaktifi ile hidrolizattaki toplam indirgeyici şekerlerin ölçülmesi, 540 nm'de absorbansın ölçülmesi ve glikoz standart eğrisi kullanılarak gösterilmiştir. Optimum pH, pH 4 ila 9 arasında, sıcaklık optimumu 25 ila 50 °C arasında ve termal stabilite 30 °C ile 70 °C arasında belirlendi. β-1,3-glukanaz substrat özgüllüğü, curdlan ve arpa β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak 25 °C ve 40 °C'de belirlendi. Ek olarak, β-1,3-glukanaz etki modu, laminaribiyoz ila laminaripentaoz kullanılarak belirlendi. Oligosakkarit hidroliz ürün paternleri, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile kalitatif olarak analiz edildi ve HPLC ile kantitatif olarak analiz edildi. Bu çalışmada sunulan yöntem, buğdayın RWA ile istila edilmesi, hücre duvarı bölgesinden peroksidaz ve β-1,3-glukanazın ekstrakte edilmesi ve bunların kapsamlı biyokimyasal karakterizasyonu için sağlam bir yaklaşım göstermektedir.

Giriş

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) buğday ve arpayı istila ederek önemli verim kaybına veya tahıl kalitesinin düşmesine neden olur. Buğday, dirençli çeşitlerde β-1,3-glukanaz ve peroksidaz aktivite seviyelerinin arttırılması da dahil olmak üzere çeşitli savunma tepkilerini indükleyerek istilaya yanıt verirken, duyarlı çeşitler erken istila döneminde bu enzimlerin aktivitesini azaltır 1,2,3,4. Buğday bitkisindeki β-1,3-glukanaz ve POD'un temel işlevleri, RWA istilası 1,3,5,6,7 sırasında dirençli kültivarda kalloz birikiminin düzenlenmesi ve hücre duvarında ve apoplastik bölgelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) söndürülmesini içeriyordu. Mafa ve ^ark.6, RWASA2 istilası üzerine dirençli buğday çeşidinde artan POD aktivitesi ile artan lignin içeriği arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Ek olarak, artan lignin içeriği, istila edilmiş dirençli buğday çeşidinin hücre duvarının güçlendirildiğini ve bunun da RWA beslemesinin azalmasına yol açtığını gösterdi.

Çoğu araştırmacı grubu, buğday / arpa-RWA etkileşimi sırasında apoplastik β-1,3-glukanaz ve POD'u çıkardı ve inceledi; Ek olarak, bu çalışmaların çoğu, bu enzimlerin, hücre duvarı bölgesindeki enzim varlığını ölçmeden RWA ile enfekte olmuş buğday bitkisinin hücre duvarını etkilediğini iddia etti. Sadece birkaç çalışma, β-1,3-glukanaz aktivite seviyelerinin kalloz regülasyonu ^7,8,9 ile bağlantılı olduğunu veya dirençli ^6,10'da POD aktiviteleri ile hücre duvarı modifikasyonu arasındaki korelasyonu göstermek için ekstrakte edilen ana hücre duvarı bileşenlerine bağlı olduğunu göstermek için mikroskobik teknikler kullanmıştır. Hücre duvarına β-1,3-glukanaz ve POD ilişkisinin araştırılmaması, araştırmacıların hücre duvarına bağlı enzimleri doğrudan ölçmelerine izin veren yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.

Mevcut yöntem, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesinden önce apoplastik sıvının yaprak dokusundan çıkarılmasının gerekli olduğunu önermektedir. Apoplastik sıvının ekstraksiyon prosedürü, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesi için kullanılan yaprak dokusundan iki kez yapılmalıdır. Bu işlem, apoplastik enzimlerin hücre duvarı bölgelerinde bulunanlarla kirlenmesini ve karışıklığını azaltır. Bu nedenle, bu çalışmada hücre duvarına bağlı POD, β-1,3-glukanaz ve MLG'ye özgü β-glukanaz ekstrakte edildi ve biyokimyasal karakterizasyonları gerçekleştirildi.

Protokol

Çalışma, Free State Üniversitesi Çevre ve Biyogüvenlik Araştırmaları Etik Kurulu'nun (UFS-ESD2022/0131/22) onayı ve izni ile gerçekleştirilmiştir. Buradaki reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bitki büyüme koşulları

1. Her buğday çeşidinin 250 tohumunu, yani duyarlı Tugela, orta derecede dirençli Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5'i ayrı Petri kaplarında çimlendirin.
2. Her Petri kabına 5 mL damıtılmış su ekleyin, bir parafin filmi ile kapatın ve 25 ° C'ye ayarlanmış çimlenme odasında 2 gün boyunca inkübe edin.
3. Her çeşidin çimlenmiş tohumlarını, kontrollü sera koşullarında 1: 1 toprak ve turba yosunu (saksı başına 15 bitki) içeren 15 cm'lik saksılara nakledin.
4. Sıcaklık rejimlerini gece ve gündüz sırasıyla 18 °C ve 24 °C'ye ayarlayın.
5. Bitkileri her 3 günde bir musluk suyu kullanarak sulayın ve çimlenmeden 14 gün sonra 2 g/L gübre ile besleyin.
6. Bitkileri ağlarla kaplı kafeslere yerleştirin ve üçüncü yaprak aşamasına ^2,6'ya kadar büyümelerine izin verin (her çeşidin dört biyolojik kopyası ile).

2. Buğday çeşitleri RWASA2 ile istila

1. Jimoh ve ^ark.11 ve Mohase ve Taiwe^12'ye göre Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5 buğday çeşitlerini RWASA2 ile istila edin.
2. Bitkileri kafeslerde iki ayrı set halinde tutun; Ağlarla kaplı büyüme odalarındaki her saksıda bitki başına aynı RWASA2 klonunun 20 partenogenetik bireyi ile bir seti istila edin. Başka bir buğday bitkisi setini, büyüme odasının altında, temiz ağlarla ayrı bir odada tutun ve bunları kontrol olarak kabul edin.
   NOT: İki tedaviyi ayrı odalarda saklayın ve bitkileri ağlarla kaplı kafeslerde örtün. Ayrıca, bir çalışmada iki farklı DIT biyotipinin kullanıldığı bir durumda, ikinci biyotipin istila ettiği bitkileri mümkün olduğunca ikinci biyotipin istila ettiği bitkilerden veya RWASA2'nin olası çapraz kontaminasyonunu önlemek için ağlarla kaplı büyüme odalarının altındaki ayrı odalarda tutun.
3. Hasat için, ikinci ve üçüncü yaprakları kısa süreli besleme periyodu (1, 2 ve 3 gün) ve uzun süreli besleme periyodu (7 ve 14 gün) olmak üzere iki farklı zaman rejiminde seçin ve nemli kağıt havlulara sarın.
4. Hücreler arası yıkama sıvısı (IWF) ekstraksiyonundan önce yaprak metabolizmasını azaltmak için hasat edilen yaprakları hemen buz içeren bir kutuya aktarın.

3. Apoplasttan hücreler arası yıkama sıvısının (IWF) ekstraksiyonu

1. Yaklaşık üç buğday çeşidinin hasat edilen yapraklarını 7 cm'lik parçalar halinde kesin.
2. Kesilen uçlardaki sitozolik kontaminasyonu gidermek için yaprak parçalarını damıtılmış suda^iki kez durulayın ^6,13.
3. Yaprak parçalarını kalın duvarlı bir cam tüpe yerleştirin ve numuneleri ekstraksiyon tamponuna (50 mM Tris-HCl, pH 7.8) daldırın.
4. Yaprakları ekstraksiyon tamponu ile emprenye etmek için bir su jeti pompası kullanarak 5 dakika boyunca vakum sızması uygulayın.
5. Daha sonra yaprak parçalarını cam tüpten çıkarın ve bir kağıt havluyla kurulayın.
6. Kurutulmuş yaprak parçalarını, delikli disklerle donatılmış önceden soğutulmuş santrifüj tüplerine dikey olarak yerleştirin ve 500 °C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplamak için 100 μL'lik bir pipet kullanın.
8. Tüm ekstraksiyon prosedürünü aynı yaprak materyali ile tekrarlayın.
9. Toplanan süpernatanı birleştirin ve -20 ° C'de saklayın.
   NOT: Süpernatan alikotlar, apoplast içeriğinin veya IWF'nin kaynağı olarak kabul edilir. Bu çalışmada IWF kullanılmadı, ancak hücre duvarına bağlı β-1,3-glukanaz ve Peroksidaz (POD) ekstrakte etmeden önce yaprak dokularından çıkarılması önemliydi.

4. Hücre duvarı ile ilişkili β-1,3-glukanaz ve POD'un ekstraksiyonu

NOT: IWF ekstraksiyonundan sonra kalan yaprak kalıntıları, toplam hücre duvarı proteinini çıkarmak için kullanıldı.

1. Yaprak kalıntılarını bir havan ve havaneli kullanarak sıvı nitrojen ile ince bir toz haline getirin.
2. Yaklaşık 200 mg toz haline getirilmiş yaprak dokusunu 4 mL ekstraksiyon tamponu (% 1 (a / h) polivinilpolipirolidon (PVPP) ile 50 mM sodyum fosfat; pH 5.0) içeren bir harca aktarın, ardından bir havaneli ile pürüzsüz bir macun haline getirin, bu daha sonra mikrosantrifüj tüplerine aktarılır.
3. Karışımı mikrosantrifüj tüplerinde buz üzerinde 3 dakika inkübe edin ve ardından 10.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
4. Süpernatanı (toplam protein ekstraktları) mikrosantrifüj tüplerinde (2 mL'lik alikotlar) toplayın ve tüm çalışma için β-1,3-glukanaz ve POD kaynağı olarak kullanın.

5. Protein standardının belirlenmesi

1. Bradford yöntemini¹⁴ izleyerek ekstraktların toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.
2. Sığır serum albümini (BSA) çözeltilerini 0.0 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.2 mg / mL, 0.3 mg / mL, 0.4 mg / mL, 0.5 mg / mL, 0.6 mg / mL, 0.7 mg / mL, 0.8 mg / mL, 0.9 mg / mL ve 1.0 mg / mL konsantrasyonlarında protein standardını oluşturmak için 50 mM sodyum fosfat tamponunda çözündürün.
3. 190 μL (% 0.25 v / v) Bradford reaktifi ile 96 oyuklu mikroplakaya her bir BSA çözeltisinden 10 μL ekleyerek standardı hazırlayın (bkz.
4. 25 ° C'de 20 dakika inkübe edin ve mikroplaka okuyucuyu kullanarak 595 nm'de absorbansı ölçün ve protein konsantrasyonunu ölçmek için standart eğriyi hazırlamak için absorbans değerlerini kullanın.
5. Protein konsantrasyonunu ölçün
   1. Ekstrakte edilen enzimin 10 μL'sini (adım 4), üçlü kopyalar halinde 190 μL (% 0.25 v / v) Bradford reaktifi ile 96 oyuklu bir mikroplakaya ekleyin.
   2. Oda sıcaklığında (25 °C) 20 dakika inkübe edin.
   3. Bir mikroplaka okuyuculu spektrofotometreyi kullanarak 595 nm'de absorbansı ölçün ve protein standardı olarak BSA'yı kullanarak protein konsantrasyonunu belirlemek için absorbans değerlerini kullanın (adım 5.4'te hazırlanmıştır).

6. β-1,3-glukanaz aktivitesi için glikoz standardı hazırlayın

1. 0.00 mg / mL ile 1.0 mg / mL (0.0 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.2 mg / mL, 0.3 mg / mL, 0.4 mg / mL, 0.5 mg / mL, 0.6 mg / mL, 0.7 mg / mL, 0.8 mg / mL, 0.9 mg / mL, 1.0 mg / mL) arasında konsantrasyonlarda standart çözeltileri hazırlayın.
2. Her bir glikoz çözeltisinden 300 μL ve 600 μL 3,5-Dinitrosalisilik asit (DNS) reaktifini 1:2 oranında 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve reaksiyonları 100 °C'de 5 dakika inkübe edin (DNS reaktifleri için Malzeme Tablosuna bakınız) (Miller ve ^ark.15).
3. Spektrofotometre kullanarak 540 nm'de absorbansı ölçmeden önce karışımın oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
4. β-1,3-glukanaz enzim aktivitesini belirlemek için standart eğriyi geliştirmek için ortalama absorbans değerlerini kullanın.

7. β-1,3-glukanaz aktivite testinin belirlenmesi

NOT: Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5'ten ekstrakte edilen hücre duvarına bağlı β-1,3-glukanazın enzim aktivitesi, Miller ve ark.15 tarafından tarif edildiği gibi modifiye edilmiş bir yöntem kullanılarak %0.5 (a/h) karışık bağlı β-1,3-1,4-glukan (MLG) ve %0.4 (a/h) β-1,3-glukan substratlarının hidrolizinden salınan salınan toplam indirgeyici şekerlerin miktarı ile ^{belirlenmiştir.15}. Protein alikotlu tüpleri her zaman buzun üzerinde tutun. Numuneler donmuşsa, buz üzerinde çözdürün ve çözüldükten hemen sonra devam edin.

1. 200 μL enzim ekstraktı ekleyin (aksi belirtilmedikçe tüm reaksiyonlarda protein konsantrasyonunu 20 μg / mL ila 90 μg / mL arasında tutun) ve 50 mM sodyum sitrat tamponunda çözülmüş 300 μL substrat (pH 5.0) 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine.
   NOT: Tüm substratlar için enzim ekstraktı olmadan paralel bir boş reaksiyon çalıştırın (ilk boş) ve boş enzim, substratsız enzim ekstraktından oluşur (ikinci boş). Hem substrat hem de enzim ekstraktı, sırasıyla birinci ve ikinci siyahlarda tampon ile değiştirildi.
2. Reaksiyonları 37 ° C'de 24 saat inkübe edin ve 100 ° C'de 5 dakika ısıtarak reaksiyonu sonlandırın, ardından 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
3. 300 μL süpernatanı 600 μL DNS reaktifi (1:2 oranında) ile yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine karıştırın ve 100 °C'de 5 dakika kaynatın.
4. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve spektrofotometreyi kullanarak absorbansı 540 nm'de ölçün.
   NOT: Karışımdaki toplam indirgeyici şekerlerin konsantrasyonu yüksekse, spektrofotometre kullanılarak okunması zor olan koyu kahverengi bir çözelti ile sonuçlanacaktır. Bu nedenle, absorbansı okumadan önce numunelerin daha fazla seyreltilmesi gereklidir.
5. Standart eğrinin SI birimlerindeki enzim aktivitesini belirlemek için yukarıdaki adım 6.4'te geliştirilen glikoz standart eğrisini kullanın.
6. Aktiviteyi μmol glikoz/h/mg protein cinsinden ifade edilen belirli bir aktiviteye dönüştürmek için aşağıdaki denklemi kullanın:
   Spesifik aktivite = [(enzim aktivitesi/180.16)*1000]/zaman/protein konsantrasyonu
   NOT: Enzim aktivitesini mg / mL cinsinden g / mL'ye dönüştürün; 180.16 g/mol, glikozun moleküler ağırlığıdır, 1000, M'yi mikromollere dönüştüren bir faktördür, zaman reaksiyon süresidir ve protein özü konsantrasyonu mg/mL cinsinden temsil edilir. Bir birim β-1,3-glukanaz aktivitesi, 1 saatlik bir reaksiyon periyodu içinde substrattan salınan 1 μmol glikoz olarak tanımlanır.

8. Peroksidaz (POD) aktivitesinin belirlenmesi

NOT: Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5 buğday çeşitlerinin hücre duvarına bağlı peroksidaz aktivitesi, guaiacol^16'dan birim zamanda üretilen tetra-guaiacol oluşumunun ölçülmesiyle belirlendi.

1. 25 ° C'de küvetlere 30 μL enzim ekstraktı, 30 μL% 1 (h / h) H₂O₂ ve 970 μL 5 mM guaiacol ekleyin.
   NOT: Enzim özütü olmadan boş reaksiyonu yapın (İlk boş) ve substrat içermeyen enzim numuneleri için başka bir boşluk (ikinci boş). Enzim veya substrat numuneleri, sırasıyla birinci ve ikinci boşluklarda 50 mM Sodyum Fosfat tamponu ile değiştirildi.
2. 470 nm'de absorbanstaki değişikliği izlemek için spektrofotometrenin kinetik modunu kullanın.
3. Grafiğin doğrusal olduğu eğimi belirleyin ve bunu absorbans değeri olarak kullanın.
4. Ortalama absorbansı hesaplayın ve bunu POD aktivitesini hesaplamada kullanın.
5. Guaiacol'ün molar sönme katsayısını (26.6 ^{mM-1 cm-1}) kullanarak peroksidaz aktivitesini hesaplayın ve aktiviteyi μmol tetra-guaiacol / min / mg proteini cinsinden ifade edin.
6. Mafa ve ^ark.6 tarafından kullanılan denklemi kullanarak POD aktivitesini hesaplayın:
   BAKLA AKTİVİTESİ = [(ΔABS × DF) ÷ Protein konsantrasyonu] × 26.6 ^{mM-1 cm-1} × 1 cm
   NOT: Burada ΔABS = ortalama absorbans; DF = Seyreltme faktörü; 26.6 ^{mM-1 cm-1} = Guaiacol yok olma katsayısı.

9. POD karakterizasyonu

NOT: POD karakterizasyon deneyleri, Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5'in istiladan 3 gün sonra (dpi) enzim ekstraktları kullanılarak, reaksiyon tamponlarında ve sıcaklıklarda küçük değişikliklerle, adım 8'de açıklanan benzer yöntemler izlenerek gerçekleştirilmiştir. Deneyler yapılırken enzim örnekleri her zaman buz üzerinde tutuldu. Reaksiyonları paralel bir boş reaksiyonla dörtlü olarak çalıştırın.

1. Optimum pH tahlilleri için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Guaiacol substratını 50 mM tamponlarda (sodyum sitrat, pH 4 ve 5), sodyum fosfat (pH 6 ve 7) ve Tris-HCl'de (pH 8 ve 9) çözün (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Reaksiyonları 25. adımda açıklandığı gibi 8 °C'de çalıştırın.
2. Optimum sıcaklık tahlilleri için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Reaksiyonları sırasıyla 25 °C, 30 °C, 40 °C ve 50 °C'de çalıştırın.
   2. pH 5 (pH optimum) tamponunda çözünmüş guaiacol substratı kullanın ve reaksiyonları adım 8'de açıklandığı gibi çalıştırın.
3. Termostabilite deneyleri için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Reaksiyonlara başlamadan önce enzimi 37 °C, 50 °C ve 70 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   2. Reaksiyonları, 50 mM sodyum sitrat tamponu (pH 5) kullanarak ve 40 °C'de (optimum sıcaklık) adım 8'de açıklanan yöntemlere göre çalıştırın.

10. β-1,3-glukanaz karakterizasyonu

NOT: Reaksiyon tamponlarında ve sıcaklıklarda bazı modifikasyonlarla, 3 dpi enzim ekstraktları kullanarak adım 7'de açıklanan yöntemi izleyerek karakterizasyon testlerini gerçekleştirin. Reaksiyonları, her substrat için paralel bir boş reaksiyonla dörtlü olarak çalıştırın.

1. Optimum pH tahlilleri için aşağıdakileri yapın:
   1. MLG ve β-1,3-glukan substratlarını 50 mM tamponlarda (sodyum sitrat, pH 4 ve 5), sodyum fosfat (pH 6 ve 7) ve Tris-HCl'de (pH 8 ve 9) çözün.
   2. Reaksiyonu 7. adımda açıklandığı gibi çalıştırın.
2. Optimum sıcaklık tahlilleri için aşağıdakileri yapın:
   1. Reaksiyonları sırasıyla 25 °C, 30 °C, 40 °C ve 50 °C'de çalıştırın.
   2. Optimum β pH ile (adım 1,3'de elde edilen) 50 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 5) çözülmüş MLG ve 10.1-glukan substratlarını kullanın ve reaksiyonları adım 7'de açıklandığı gibi çalıştırın.
3. Termostabilite deneyleri için aşağıdakileri yapın:
   1. Reaksiyonlara başlamadan önce enzimi 37 °C, 50 °C ve 70 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   2. Reaksiyonları 50 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 5) çözünmüş substratları kullanarak çalıştırın ve 25 °C ve 40 °C'de 24 saat inkübe edin.

11. Farklı glukan substratları üzerinde β-1,3-glukanaz etki mekanizmasının değerlendirilmesi

NOT: Glukan substratları, omurgalarında aynı glikoz kalıntısını içerir, ancak glukopiranoz birimleri arasındaki glikozidik bağlar çeşitlidir ve α veya β yönelimini^{alabilir 17}. Glikozidik bağlar, glikoz moleküllerinin kimyasal yapılarını tanımlayan birkaç karbon atomu arasında oluşabilir, örneğin β-1,3-glukan, β-1,4-glukan ve karışık bağlı β-1,3-1,4-glukan (MLG)18,19,20. β-1,3-glukanaz etki mekanizması, RWASA2 ile enfekte edilmiş Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn 5 numuneleri (enzim kaynakları) ve aşağıdaki substratlar β-1,3-glukan (CM-curdlan), MLG (arpadan) ve β-1,4-glukan (AZO-CM-Selüloz) kullanılarak belirlendi. Etki mekanizması, optimal tahlil koşulları altında (25 ° C ve 40 ° C, pH 5.0),% 0.1 (a / h) β-1,4-glukan,% 0.4 (a / h) β-1,3-glukan veya% 0.5 (a / h) MLG substratları.

1. Substratları 50 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 5) çözün.
2. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 200 μL enzim ekstraktı ve 300 μL substrat ekleyin.
3. Reaksiyonları 25 °C ve 40 °C olmak üzere iki ayrı sıcaklıkta 8 saat inkübe edin.
4. 100 °C'de ısıtılarak reaksiyonların sonlandırılması.
5. β-1,3-glukan ve MLG reaksiyon karışımını 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve adım 7.3'te açıklandığı gibi devam edin.
6. β-1,4-glukan için, reaksiyonu 100 °C'de sonlandırdıktan sonra, karışımı 800 μL mutlak etanol ile seyreltin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı eğrilere aktarın, spektrofotometre ile 590 nm'de absorbansı ölçün ve üreticinin prosedürünü kullanarak β-1,4-glukan üzerindeki β-1,3-glukanaz aktivitesini hesaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve aktiviteyi Birimler/mg protein cinsinden ifade edin.

12. β-1,3-glukanaz etki şeklinin belirlenmesi

NOT: RWASA2 ile enfekte edilmiş Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5'in neden olduğu β-1,3-glukanaz etki modu, polimerizasyon derecesi (DP) 5 ile 2 arasında olan laminarin-oligosakkaritler (LAM'lar) ile test edildi. Substratı hidrolize etmek için β-1,3-glukanaz için gereken DP'yi belirlemek için İnce tabaka kromatografisi (TLC), sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) ve glikoz oksidaz peroksidaz (GOPOD) kitini kullanın. TLC, kalitatif analiz için kullanıldı ve LC-MS, reaksiyon^21'den sonra hidrolizattaki oligosakkaritlerin konsantrasyonunu belirleyen kantitatif analiz için kullanıldı.

1. β-1,3-glukanaz etki modunun reaksiyonlarını hazırlayın
   NOT: Konsantre protein ekstraktını 10 kDa santrifüj konsantre membran filtresi ile hazırlayın ve böylece deney için konsantre ve konsantre olmayan RWASA2 istilasına uğramış protein ekstraktlarına sahip olun.
   1. Her bir çeşitten ekstrakte edilen enzimleri konsantre etmek için, ekstraktların 5 mL'sini 10 kDa santrifüj konsantre membran filtrelerine aktarın.
   2. Ekstrakt içeren membran filtre tüplerini 15.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. Laminaripentaoz (LAM5), Laminaritetraoze (LAM4), Laminaritrioz (LAM3) ve Laminaribiose (LAM2) (Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mM sodyum sitrat (pH 5) içinde 10 mg / mL yapmak için çözün.
   4. Reaksiyonu başlatmak için 20 μL protein özütü ve 40 μL Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraoze (LAM4), Laminaritrioz (LAM3) ve Laminaribiose (LAM2) ekleyin.
   5. Reaksiyonu 40 °C'de 16 saat inkübe edin ve 100 °C'de 5 dakika kaynatarak sonlandırın.
2. İnce tabaka kromatografisi (TLC) yapın
   1. 4 silika plakayı 10 cm'lik² parçaya kesin ve bir kenarın altından 1 cm boşluk bırakarak plakanın yüzeyi boyunca bir çizgi çizin.
   2. Çizgilerin üzerindeki noktaları işaretleyin ve bunları Laminarin-oligosakkaritlerin farklı çeşitlerine ve DP'lerine göre 1 cm aralıklarla işaretleyin ve. Konsantre protein özütü için 2 silika plakası ve konsantre olmayan özler için diğer 2 tanesini alın.
   3. Silika plaka üzerindeki karşılık gelen işaretli noktaların üzerine 3 ila 5 kez 3 μL reaksiyon karışımları ekleyin ve işlemi tekrarlamadan önce plaka üzerindeki lekelerin tamamen kurumasını bekleyin.
   4. Silika plakaları, n-butanolün mobil fazını içeren TLC tankına: asetik asit: su (2: 1: 1 v / v / v) altta numunelerin lekelerini içeren tarafı olacak şekilde yavaşça koyun.
   5. Mobil fazın plakanın altından üstüne doğru hareket etmesine izin verin.
      NOT: Bu adım yaklaşık 2 saat sürebilir. Numuneler ayrılırken tankı hareket ettirmeyin veya rahatsız etmeyin.
   6. Plakaları mobil fazdan çıkarın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   7. Boyama solüsyonunu küçük bir kaba ekleyin, silika plakasını 5 saniye boyunca% 5 (v / h) sülfürik asit kullanarak% 95 (v / h) etanol içinde% 0.3 (a / h) Naftol boyama çözeltisine hafifçe batırın, çıkarın ve ardından oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
      NOT: Bu adımda, ısıtma bloğunu/fırını açın ve sıcaklığı 100 °C'ye ayarlayın.
   8. Kurutulmuş silika plakaları ısıtma bloğuna koyun ve 100 °C'de 7-10 dakika veya mavi-mor lekeler görünene kadar ısıtın. Mavi-mor lekeleri gösteren silika plakaların fotoğraflarını çekin ve belgeleyin.
3. Laminerin-oligosakkarit hidrolizatlarının konsantrasyonunu ölçmek
   NOT: LAM hidrolizatlarının konsantrasyonu, hem konsantre hem de konsantre olmayan protein ekstraktları²¹ için ölçülecektir.
   1. Bir C18 (Karbonhidrat 4,6 × 250 mm) kolonuna her numuneden 20 μL ekleyin ve 10 dakika boyunca %100 B'den %60 B'ye kadar bir su (çözücü A) ve asetonitril (çözücü B) gradyanı kullanarak 500 μL/dk'lık bir akış hızında ayrılmaya izin verin ve ardından kolonun yeniden dengelenmesine izin vermek için toplam 20 dakikalık çalışma süresine sahip kolon yeniden dengeleme adımları izleyin.
   2. Fazla çözücüyü, 30 psi nebulizatör gazını, 30 psi ısıtıcı gazını ve 20 psi perde gazını buharlaştırmak için 400 °C ısıtıcı sıcaklığına sahip kütle spektrometresi iyon kaynağında negatif elektrosprey modunda elüting analitlerini iyonize edin.
   3. Küme çözme potansiyelini 350 V olarak ayarlayın.
   4. 150 Da ile 1000 Da arasında değişen bir Q1 tarama modunda ve 3 sn bekleme süresinde kütle spektrometresi üzerindeki eluting analitlerini analiz edin.
   5. Analitlerin konsantrasyonlarını elektronik tabloya kaydedin.
4. Glikoz konsantrasyonunu ölçün
   1. Üreticinin talimatlarına^22,23 uyarak GOPOD reaktifi kullanılarak laminarin hidrolizi ile üretilen glikoz konsantrasyonunu analiz edin.
   2. Spektrofotometrenin sabit modunda 510 nm'de absorbansı ölçün.

13. Veri toplama ve analizi

1. İstila veya numune toplama sırasında yanlılığı önlemek için tüm deneyleri rastgele hale getirin ve analizi dört nüsha halinde gerçekleştirin.
2. Aksi belirtilmedikçe, toplanan deneysel verilerden oluşturulan grafik ve tablolardaki değerleri temsil etmek için ortalama ± standart sapmayı kullanın.
3. Tüm verileri analiz etmek ve grafikler oluşturmak için Microsoft Excel'i kullanın.
4. Uyumlu yazılım ile istatistiksel analiz yapın.
   NOT: Tedaviler arasındaki anlamlılığı test etmek için Çok Faktörlü Varyans Analizi (ANOVA) ve 0,05 alfa değerinde homojen grupları test etmek için Fisher'ın LSD'sini gerçekleştirin.

Sonuçlar

Buğday çeşitlerinin dört biyolojik kopyası (Tugela, Tugela-Dn1 ve Tugela-Dn5), 3 yapraklı büyüme aşamasında RWASA2 ile istila edildi. İstiladan sonra yapraklar 1, 2, 3, 7 ve 14 dpi'de hasat edildi. Deney sonuçlarını strese maruz kalmayan buğday bitkileriyle karşılaştırılabilir hale getirmek için kontrol tedavileri RWASA2 ile enfekte edilmedi. Deneyler dörtlü olarak yapıldı ve sonuçlar ortalama değerler olarak sunuldu.

Hem RWASA2 ile enfekte edilmiş...

Tartışmalar

Buğday ve arpa, Rus buğday yaprak bitleri (Diuraphis noxia) dahil olmak üzere yaprak biti türleri tarafından sıklıkla istila edilen tahıl ^{ürünleridir7,24}. Dirençli buğday bitkileri, kalloz ve lignin birikimini düzenleyerek hücre duvarını değiştirmek için istila dönemi boyunca savunma tepkileri olarak POD ve β-1,3-glukanaz aktivitelerinin yukarı regülasyonunu indükler 6,25,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.