Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması

Özet

Mevcut protokol, buğday bitkilerinde başta β-1,3-glukanaz ve peroksidaz olmak üzere hücre duvarı ile ilgili enzimleri incelemek ve karakterize etmek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Buğday-RWA etkileşimi sırasında aktivite seviyeleri artar ve yaprak biti beslenmesini caydıran hücre duvarı takviyesi yoluyla bitki savunma tepkisinde yer alır.

Özet

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) tarafından istila edilen buğday bitkileri, aşırı duyarlı tepkiler (HR) ve β-1,3-glukanaz ve peroksidaz (POD) gibi patogenezle ilgili (PR) proteinlerin indüksiyonu dahil olmak üzere bir dizi savunma tepkisine neden olur. Bu çalışma, hücre duvarı ile ilişkili POD ve β-1,3-glukanazın fizikokimyasal özelliklerini karakterize etmeyi ve RWASA2-buğday etkileşimi sırasında hücre duvarı modifikasyonu üzerindeki sinerjilerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Duyarlı Tugela, orta derecede dayanıklı Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5 çeşitleri sera koşullarında önceden çimlendirilerek ekildi, ekimden 14 gün sonra gübrelendi ve her 3 günde bir sulandı. Bitkiler, 3 yapraklı aşamada aynı RWASA2 klonunun 20 partenogenetik bireyi ile istila edildi ve yapraklar istiladan 1 ila 14 gün sonra hasat edildi. Hücreler arası yıkama sıvısı (IWF), vakum filtrasyonu kullanılarak ekstrakte edildi ve -20 °C'de saklandı. Yaprak kalıntıları toz haline getirildi ve hücre duvarı bileşenleri için kullanıldı. POD aktivitesi ve karakterizasyonu, 5 mM guaiacol substratı ve H₂O₂ kullanılarak belirlendi ve 470 nm'de absorbanstaki değişiklik izlendi. β-1,3-glukanaz aktivitesi, pH ve sıcaklık optimum koşulları, β-1,3-glukan ve β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak DNS reaktifi ile hidrolizattaki toplam indirgeyici şekerlerin ölçülmesi, 540 nm'de absorbansın ölçülmesi ve glikoz standart eğrisi kullanılarak gösterilmiştir. Optimum pH, pH 4 ila 9 arasında, sıcaklık optimumu 25 ila 50 °C arasında ve termal stabilite 30 °C ile 70 °C arasında belirlendi. β-1,3-glukanaz substrat özgüllüğü, curdlan ve arpa β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak 25 °C ve 40 °C'de belirlendi. Ek olarak, β-1,3-glukanaz etki modu, laminaribiyoz ila laminaripentaoz kullanılarak belirlendi. Oligosakkarit hidroliz ürün paternleri, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile kalitatif olarak analiz edildi ve HPLC ile kantitatif olarak analiz edildi. Bu çalışmada sunulan yöntem, buğdayın RWA ile istila edilmesi, hücre duvarı bölgesinden peroksidaz ve β-1,3-glukanazın ekstrakte edilmesi ve bunların kapsamlı biyokimyasal karakterizasyonu için sağlam bir yaklaşım göstermektedir.

Giriş

Rus buğday yaprak bitleri (RWA) buğday ve arpayı istila ederek önemli verim kaybına veya tahıl kalitesinin düşmesine neden olur. Buğday, dirençli çeşitlerde β-1,3-glukanaz ve peroksidaz aktivite seviyelerinin arttırılması da dahil olmak üzere çeşitli savunma tepkilerini indükleyerek istilaya yanıt verirken, duyarlı çeşitler erken istila döneminde bu enzimlerin aktivitesini azaltır 1,2,3,4. Buğday bitkisindeki β-1,3-glukanaz ve POD'un temel işlevleri, RWA istilası 1,3,5,6,7 sırasında dirençli kültivarda kall....

Protokol

Çalışma, Free State Üniversitesi Çevre ve Biyogüvenlik Araştırmaları Etik Kurulu'nun (UFS-ESD2022/0131/22) onayı ve izni ile gerçekleştirilmiştir. Buradaki reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bitki büyüme koşulları

1. Her buğday çeşidinin 250 tohumunu, yani duyarlı Tugela, orta derecede dirençli Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5'i ayrı Petri kaplarında çimlendirin.
2. Her Petri kabına 5 mL damıtılmış su ekleyin, bir parafin filmi ile kapatın ve 25 ° C'ye ayarlanmış çimlenme odasında 2 gün boyunca inkübe edin.
3. Her çeşidin çiml....

Tartışmalar

Buğday ve arpa, Rus buğday yaprak bitleri (Diuraphis noxia) dahil olmak üzere yaprak biti türleri tarafından sıklıkla istila edilen tahıl ^{ürünleridir7,24}. Dirençli buğday bitkileri, kalloz ve lignin birikimini düzenleyerek hücre duvarını değiştirmek için istila dönemi boyunca savunma tepkileri olarak POD ve β-1,3-glukanaz aktivitelerinin yukarı regülasyonunu indükler 6,25,.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.