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요약

본 프로토콜은 밀 식물에서 주로 β-1,3-glucanase 및 peroxidase와 같은 세포벽 관련 효소를 연구하고 특성화하는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 그들의 활동 수준은 밀-RWA 상호 작용 중에 증가하며 세포벽 강화를 통해 식물 방어 반응에 관여하여 진딧물 먹이를 억제합니다.

초록

러시아 밀 진딧물(RWA)에 감염된 밀 식물은 과민 반응(HR) 및 β-1,3-glucanase 및 peroxidase(POD)와 같은 발병 관련(PR) 단백질의 유도를 포함한 일련의 방어 반응을 유발합니다. 이 연구는 세포벽 관련 POD와 β-1,3-glucanase의 물리화학적 특성을 특성화하고 RWASA2-wheat 상호 작용 중 세포벽 변형에 대한 시너지 효과를 결정하는 것을 목표로 합니다. 감수성이 있는 투겔라(Tugela), 적당히 저항성이 있는 투겔라-Dn1(Tugela-Dn1) 및 저항성이 있는 투겔라-Dn5(Tugela-Dn5) 품종을 온실 조건에서 미리 발아시키고 심었으며, 심은 후 14일 후에 비료를 주고 3일마다 관개했습니다. 식물은 3 잎 단계에서 동일한 RWASA2 클론의 20 개의 parthenogenetic 개체로 감염되었으며, 잎은 감염 후 1 일에서 14 일에 수확되었습니다. 세포간 세척액(IWF)을 진공 여과를 사용하여 추출하고 -20°C에서 보관했습니다. 잎 잔류물을 분말로 분쇄하여 세포벽 구성 요소에 사용했습니다. POD 활성 및 특성 분석은 5mM guaiacol 기질 및H2O2를 사용하여 측정하고 470nm에서 흡광도 변화를 모니터링했습니다. β-1,3-글루카나제 활성도, pH 및 온도 최적 조건은 β-1,3-글루칸 및 β-1,3-1,4-글루칸 기질을 사용하여 DNS 시약으로 가수분해물 내 총 환원당을 측정하고, 540nm에서 흡광도를 측정하고, 포도당 표준 곡선을 사용하여 입증되었습니다. pH 최적은 pH 4 내지 9 사이에서, 온도 최적은 25 내지 50°C, 열 안정성은 30°C 내지 70°C 사이에서 결정하였다. β-1,3-글루카나제 기질 특이성은 25°C 및 40°C에서 커드란 및 보리 β-1,3-1,4-글루칸 기질을 사용하여 결정하였다. 또한, β-1,3-글루카나제 작용 모드는 라미나리바이오오스 대 라미나리펜타오스를 사용하여 측정하였다. 올리고당 가수분해 산물 패턴은 박층 크로마토그래피(TLC)로 정성적으로 분석하고 HPLC로 정량적으로 분석했습니다. 이 연구에서 제시된 방법은 밀에 RWA를 감염시키고 세포벽 영역에서 과산화효소 및 β-1,3-글루카나아제를 추출하고 포괄적인 생화학적 특성을 분석하기 위한 강력한 접근 방식을 보여줍니다.

서문

러시아 밀 진딧물(RWA)은 밀과 보리를 감염시켜 상당한 수확량 손실이나 곡물 품질 저하를 일으킵니다. 밀은 저항성 품종에서 β-1,3-glucanase 및 peroxidase 활성 수준을 증가시키는 것을 포함하여 여러 방어 반응을 유도하여 감염에 반응하는 반면, 감수성 품종은 초기 감염 기간 1,2,3,4에서 이러한 효소의 활성을 감소시킵니다. 밀 식물에서 β-1,3-glucanase 및 POD의 주요 기능에는 저항성 품종의 callose 축적을 조절하고 RWA 감염 1,3,5,6,7 동안 세포벽 및 아포플라스틱 영역에서 활성산소종(ROS)을 담금질하는 것이 포함되었습니다. Mafa et al.6은 RWASA2 감염 시 저항성 밀 품종에서 증가된 POD 활성과 증가된 리그닌 함량 사이에 강한 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 또한, 리그닌 함량이 증가하면 감염된 저항성 밀 품종의 세포벽이 강화되어 RWA 수유량이 감소했음을 나타냅니다.

대부분의 연구자 그룹은 밀/보리-RWA 상호 작용 동안 아포플라스틱 β-1,3-glucanase 및 POD를 추출하고 연구했습니다. 또한, 이러한 연구의 대부분은 이러한 효소가 세포벽 영역의 효소 존재를 측정하지 않고 RWA에 감염된 밀 식물의 세포벽에 영향을 미친다고 주장했습니다. β-1,3-glucanase 활성 수준이 callose regulation 7,8,9와 관련이 있음을 보여주기 위해 현미경 기술을 사용한 연구는 소수에 불과하며, 저항 성 6,10에서 POD 활성과 세포벽 변형 사이의 상관 관계를 입증하기 위해 주요 세포벽 구성 요소를 추출했습니다. β-1,3-glucanase 및 POD와 세포벽의 연관성을 조사하지 않았다는 것은 연구자들이 세포벽 결합 효소를 직접 측정할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있음을 나타냅니다.

현재의 방법은 세포벽에 결합된 효소를 추출하기 전에 잎 조직에서 아포소성 액체를 제거하는 것이 필요하다고 제안합니다. 아포플라스틱 유체의 추출 절차는 세포벽 결합 효소를 추출하는 데 사용되는 잎 조직에서 두 번 수행해야 합니다. 이 과정은 세포벽 영역에서 발견되는 효소와 아포플라스틱 효소의 오염 및 혼동을 줄입니다. 따라서 본 연구에서는 세포벽 결합 POD, β-1,3-글루카나아제, MLG 특이적 β-글루카나아제를 추출하여 이들의 생화학적 특성 분석을 수행하였다.

프로토콜

이 연구는 자유 주립 대학 (UFS-ESD2022 / 0131 / 22)의 환경 및 생물 안전성 연구 윤리위원회의 승인 및 허가하에 수행되었습니다. 여기에 있는 시약 및 장비에 대한 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 식물 성장 조건

  1. 각 밀 품종의 250 종자, 즉 감수성 Tugela, 적당히 저항성이 강한 Tugela-Dn1 및 저항성 Tugela-Dn5를 별도의 페트리 접시에 발아시킵니다.
  2. 각 페트리 접시에 증류수 5mL를 넣고 파라핀 필름으로 밀봉한 다음 25°C로 설정된 발아실에서 2일 동안 배양합니다.
  3. 통제된 온실 조건에서 1:1 토양과 피트모스(화분당 15개)가 포함된 15cm 화분에 각 품종의 발아된 씨앗을 이식합니다.
  4. 밤과 낮에는 각각 18°C와 24°C로 온도 체계를 설정합니다.
  5. 수돗물을 사용하여 3일마다 식물에 관개하고 발아 후 14일 후에 2g/L 비료를 공급합니다.
  6. 식물을 그물로 둘러싸인 새장에 넣고 세 번째 잎 단계 2,6 (각 품종의 4 개의 생물학적 복제 포함)까지 자라도록합니다.

2. RWASA2에 의한 밀 품종 감염

  1. Jimoh et al.11 및 Mohase 및 Taiwe12에 따르면 Tugela, Tugela-Dn1 및 Tugela-Dn5 밀 품종에 RWASA2를 감염시킵니다.
  2. 식물을 새장에 두 개의 별도 세트로 보관하십시오. 그물로 덮인 성장실의 각 화분에 식물당 동일한 RWASA2 클론의 20명의 단세포 유전학적 개체가 있는 한 세트를 감염시킵니다. 다른 밀 식물 세트는 깨끗한 그물이 있는 성장실 아래의 별도의 방에 보관하고 대조군으로 취급하십시오.
    참고 : 두 가지 트리트먼트를 별도의 방에 보관하고 식물을 그물로 둘러싸인 케이지로 덮으십시오. 또한 연구에서 두 가지 다른 RWA 생물형이 사용되는 경우 가능한 한 두 번째 생물형에 감염된 식물과 한 가지 RWA 생물형에 감염된 식물을 유지하거나 그물로 덮인 성장실 아래의 별도의 방에 두어 RWASA2의 교차 오염 가능성을 방지하십시오.
  3. 수확을 위해 두 번째와 세 번째 잎을 단기간 수유 기간(1일, 2일, 3일)과 장기 수유 기간(7일, 14일)의 두 가지 다른 시간 체계에서 선택하고 촉촉한 종이 타월로 싸십시오.
  4. 수확한 잎을 얼음이 들어 있는 상자에 즉시 옮겨 넣어 잎 대사를 줄여 세포간 세척액(IWF)을 추출합니다.

3. 아포플라스트(apoplast)에서 세포간 세척액(IWF) 추출

  1. 약 3개의 밀 품종에서 수확한 잎을 7cm 조각으로 자릅니다.
  2. 잎 조각을 증류수로 두 번 헹구어 절단 끝에서 세포질 오염을 제거합니다 6,13.
  3. 잎 조각을 두꺼운 벽의 유리관에 삽입하고 샘플을 추출 완충액 (50mM Tris-HCl, pH 7.8)에 담그십시오.
  4. 워터 제트 펌프를 사용하여 5분 동안 진공 침투를 적용하여 잎에 추출 완충액을 스침침시킵니다.
  5. 그런 다음 유리관에서 잎 조각을 제거하고 종이 타월로 닦아 건조시킵니다.
  6. 건조된 잎 조각을 천공 디스크가 장착된 사전 냉각된 원심분리기 튜브에 수직으로 삽입하고 4°C에서 10분 동안 500 x g 의 원심분리기를 삽입합니다.
  7. 100 μL 피펫을 사용하여 상층액을 사전 냉각된 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다.
  8. 동일한 잎 재료로 전체 추출 절차를 반복합니다.
  9. 수집된 상층액을 결합하여 -20°C에서 보관합니다.
    참고: 상층액 분취액은 아포플라스트 함량 또는 IWF의 공급원으로 취급됩니다. IWF는 현재 연구에서 사용되지 않았지만 세포벽에 결합된 β-1,3-glucanase 및 Peroxidase(POD)를 추출하기 전에 잎 조직에서 IWF를 제거하는 것이 중요했습니다.

4. 세포벽 관련 β-1,3-glucanase 및 POD 추출

참고: IWF 추출 후 남은 잎 잔여물은 총 세포벽 단백질을 추출하는 데 사용되었습니다.

  1. 절구와 유봉을 사용하여 액체 질소로 잎 잔여물을 미세한 가루로 부수십시오.
  2. 약 200mg의 분말 잎 조직을 4mL의 추출 완충액(50mM 인산나트륨, 1%(w/v) 폴리비닐폴리피롤리돈(PVPP), pH 5.0)이 포함된 모르타르에 옮긴 다음 유봉으로 갈아 부드러운 페이스트를 만든 다음 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  3. 혼합물을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 얼음 위에서 3분 동안 배양한 다음 10,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
  4. 미세 원심분리기 튜브(2mL 분취액)에서 상층액(총 단백질 추출물)을 수집하고 전체 연구 동안 β-1,3-glucanase 및 POD의 공급원으로 사용합니다.

5. 단백질 표준물질의 결정

  1. Bradford 방법14에 따라 추출물의 총 단백질 농도를 측정합니다.
  2. 50mM 인산나트륨 완충액에 용해된 0.0mg/mL, 0.1mg/mL, 0.2mg/mL, 0.3mg/mL, 0.4mg/mL, 0.5mg/mL, 0.6mg/mL, 0.7mg/mL, 0.8mg/mL, 0.9mg/mL 및 1.0mg/mL의 농도로 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 준비하여 단백질 표준물질을 생성합니다.
  3. 190 μL(0.25% v/v)의 Bradford 시약을 사용하여 각 BSA 용액 10μL를 96웰 마이크로플레이트에 추가하여 표준물질을 준비합니다( 재료 표 참조).
  4. 25°C에서 20분 동안 배양하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하고 흡광도 값을 사용하여 단백질 농도를 정량화하기 위한 표준 곡선을 준비합니다.
  5. 단백질 농도 정량화
    1. 추출된 효소 10μL(4단계)를 190μL(0.25% v/v)의 Bradford 시약이 있는 96웰 마이크로플레이트에 3배로 추가합니다.
    2. 실온(25°C)에서 20분 동안 배양합니다.
    3. 마이크로플레이트 리더가 있는 분광광도계를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하고 흡광도 값을 사용하여 BSA를 단백질 표준물질로 사용하여 단백질 농도를 결정합니다(5.4단계에서 준비).

6. β-1,3-glucanase 활성을 위한 포도당 표준물질을 준비합니다.

  1. 포도당을 증류수에 용해시키고 0.00mg/mL에서 1.0mg/mL(0.0mg/mL, 0.1mg/mL, 0.2mg/mL, 0.3mg/mL, 0.4mg/mL, 0.5mg/mL, 0.6mg/mL, 0.7mg/mL, 0.8mg/mL, 0.9mg/mL, 1.0mg/mL) 농도의 표준 용액을 준비합니다.
  2. 각 포도당 용액 300μL와 3,5-디니트로살리실산(DNS) 시약 600μL를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 1:2 비율로 넣고 100°C에서 5분 동안 반응을 배양합니다(DNS 시약에 대한 재료 표 참조)(Miller et al.15).
  3. 분광 광도계를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하기 전에 혼합물을 실온에서 식히십시오.
  4. 평균 흡광도 값을 사용하여 β-1,3-glucanase 효소 활성을 측정하기 위한 표준 곡선을 개발합니다.

7. β-1,3-glucanase 활성 분석 결정

참고: Tugela, Tugela-Dn1 및 Tugela-Dn5에서 추출한 세포벽 결합 β-1,3-글루카나제의 효소 활성은 Miller et al.15에 의해 설명된 수정된 방법을 사용하여 0.5%(w/v) 혼합 연결된 β-1,3-글루칸(MLG) 및 0.4%(w/v) β-1,3-글루칸 기질의 가수분해에서 방출된 총 환원당의 양에 의해 측정되었습니다. 단백질 부분 표본이 있는 튜브를 항상 얼음 위에 두십시오. 샘플이 얼었다면 얼음에서 해동하고 해동 후 즉시 진행하십시오.

  1. 효소 추출물 200μL(달리 명시되지 않는 한 모든 반응에서 단백질 농도를 20μg/mL에서 90μg/mL 사이로 유지)와 50mM 구연산나트륨 완충액(pH 5.0)에 용해된 기질 300μL를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다.
    참고: 모든 기질에 대해 효소 추출물 없이 병렬 블랭크 반응을 실행하고(첫 번째 블랭크), 효소 블랭크는 기질이 없는 효소 추출물(두 번째 블랭크)로 구성됩니다. 기질과 효소 추출물 모두를 각각 첫 번째 및 두 번째 블랙의 완충액으로 교체했습니다.
  2. 37°C에서 24시간 동안 반응을 배양하고 100°C에서 5분 동안 가열한 다음 10,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 반응을 종료합니다.
  3. 상층액 300μL와 600μL DNS 시약(1:2 비율)을 새 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 혼합하고 100°C에서 5분 동안 끓입니다.
  4. 용액을 실온으로 냉각시키고 분광 광도계를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정합니다.
    알림: 혼합물에서 총 환원당의 농도가 높으면 분광 광도계를 사용하여 읽기 어려운 짙은 갈색 용액이 생성됩니다. 따라서 흡광도를 판독하기 전에 샘플의 추가 희석이 필요합니다.
  5. 위의 6.4단계에서 개발된 포도당 표준 곡선을 사용하여 표준 곡선의 SI 단위에서 효소 활성을 측정합니다.
  6. 활성을 μmol 포도당/h/mg 단백질로 표현되는 특정 활성으로 변환하려면 아래 방정식을 사용하십시오.
    특정 활성 = [(효소 활성도/180.16)*1000]/시간/단백질 농도
    참고: mg/mL 단위의 효소 활성을 g/mL로 변환합니다. 180.16g/mol은 포도당의 분자량, 1000은 M을 마이크로몰로 변환하는 인자, 시간은 반응 기간, 단백질 추출물 농도는 mg/mL로 표시됩니다. β-1,3-glucanase 활성의 한 단위는 1시간 반응 기간 내에 기질에서 방출되는 1μmol의 포도당으로 정의됩니다.

8. 과산화효소(POD) 활성 측정

참고: Tugela, Tugela-Dn1 및 Tugela-Dn5 밀 품종의 세포벽 결합 과산화효소 활성은 guaiacol16에서 단위 시간당 생산된 tetra-guaiacol의 형성을 정량화하여 측정했습니다.

  1. 효소 추출물 30μL, 30μL 1%(v/v) H2O2및 970μL의 5mM 구아이아콜을 25°C의 큐벳에 추가합니다.
    참고: 효소 추출물 없이 블랭크 반응을 만들고(첫 번째 블랭크), 기질이 없는 효소 샘플에 대해 다른 블랭크(두 번째 블랭크)를 만듭니다. 효소 또는 기질 샘플은 각각 첫 번째 및 두 번째 블랭크에서 50mM 인산나트륨 완충액으로 교체되었습니다.
  2. 분광광도계의 운동 모드를 사용하여 470nm에서 흡광도 변화를 모니터링합니다.
  3. 그래프가 선형인 기울기를 결정하고 이를 흡광도 값으로 사용합니다.
  4. 평균 흡광도를 계산하여 POD 활성을 계산하는 데 사용합니다.
  5. guaiacol의 몰 흡광 계수(26.6 mM-1 cm-1)를 사용하여 과산화효소 활성을 계산하고 μmol tetra-guaiacol/min/mg 단백질로 활성을 표시합니다.
  6. Mafa et al.6에서 사용한 방정식을 사용하여 POD 활동을 계산합니다.
    POD 활성 = [(ΔABS × DF) ÷ 단백질 농도] × 26.6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    참고: 여기서 ΔABS = 평균 흡광도; DF = 희석 계수; 26.6 mM-1 cm-1 = 구아이아콜 흡광 계수.

9. POD 특성화

참고: POD 특성화 분석은 8단계에서 설명한 유사한 방법에 따라 Tugela, Tugela-Dn1 및 Tugela-Dn5 의 감염 3일 후(dpi) 효소 추출물을 사용하여 수행되었으며 반응 완충액 및 온도는 약간 변경되었습니다. 효소 샘플은 실험이 진행되는 동안 항상 얼음 위에 보관되었습니다. 평행 블랭크 반응으로 4배로 반응을 실행합니다.

  1. 최적의 pH 분석을 위해 다음 단계를 수행하십시오.
    1. 구아이아콜 기질을 50mM 완충액(구연산나트륨, pH 4 및 5), 인산나트륨(pH 6 및 7) 및 Tris-HCl(pH 8 및 9)에 용해시킵니다( 재료 표 참조).
    2. 8단계에서 설명한 대로 25°C에서 반응을 실행합니다.
  2. 최적의 온도 분석을 위해 다음 단계를 수행하십시오.
    1. 각각 25°C, 30°C, 40°C 및 50°C에서 반응을 실행합니다.
    2. 완충액 pH 5(pH 최적)에 용해된 구아이아콜 기질을 사용하고 8단계에 설명된 대로 반응을 실행합니다.
  3. 열안정성 분석의 경우 다음 단계를 수행합니다.
    1. 반응을 시작하기 전에 효소를 37°C, 50°C, 70°C에서 30분 동안 배양합니다.
    2. 50mM 구연산나트륨 완충액(pH 5)을 사용하고 40°C(최적 온도)에서 8단계에서 설명한 방법에 따라 반응을 실행합니다.

10. β-1,3-glucanase 특성화

참고: 3dpi 효소 추출물을 사용하여 7단계에서 설명한 방법에 따라 반응 완충액 및 온도를 약간 수정하여 특성화 분석을 수행합니다. 각 기질에 대해 평행한 블랭크 반응을 사용하여 4분으로 반응을 실행합니다.

  1. 최적의 pH 분석을 위해 다음과 같이 진행하십시오.
    1. MLG 및 β-1,3-글루칸 기질을 50mM 완충액(구연산나트륨, pH 4 및 5), 인산나트륨(pH 6 및 7) 및 Tris-HCl(pH 8 및 9)에 용해시킵니다.
    2. 7단계에서 설명한 대로 반응을 실행합니다.
  2. 최적의 온도 분석을 위해 다음과 같이 진행하십시오.
    1. 각각 25°C, 30°C, 40°C 및 50°C에서 반응을 실행합니다.
    2. 50mM 구연산나트륨 완충액(pH 5)에 용해된 MLG 및 β-1,3-글루칸 기질을 최적의 pH(10.1단계에서 얻음)로 사용하고 7단계에 설명된 대로 반응을 실행합니다.
  3. 열안정성 분석의 경우 다음과 같이 진행하십시오.
    1. 반응을 시작하기 전에 효소를 37°C, 50°C, 70°C에서 30분 동안 배양합니다.
    2. 50mM 구연산나트륨 완충액(pH 5)에 용해된 기질을 사용하여 반응을 실행하고 25°C 및 40°C에서 24시간 동안 배양합니다.

11. 다양한 글루칸 기질에 대한 β-1,3-glucanase 작용 기전 평가

참고: 글루칸 기질은 백본에 동일한 포도당 잔류물을 함유하고 있지만, 글루코피라노스 단위 간의 당조직 결합은 다양하며 α 또는 β 방향을 취할 수 있다17. 글리코시드 결합은 포도당 분자의 여러 탄소 원자 사이에 형성될 수 있으며, 예를 들어 β-1,3-글루칸, β-1,4-글루칸 및 혼합 연결된 β-1,3-1,4-글루칸(MLG)18,19,20과 같은 화학 구조를 정의할 수 있습니다. β-1,3-글루카나아제의 작용 기전은 RWASA2-감염 투겔라, 투겔라-Dn1 및 투겔라-Dn5 샘플(효소 공급원)과 β-1,3-글루칸(CM-커들란), MLG(보리) 및 β-1,4-글루칸(AZO-CM-셀룰로오스)을 사용하여 측정하였다. 작용 기전은 최적의 분석 조건(25°C 및 40°C, pH 5.0)에서 0.1%(w/v) β-1,4-글루칸, 0.4%(w/v) β-1,3-글루칸 또는 0.5%(w/v) MLG 기질을 사용하여 측정합니다.

  1. 50mM 구연산나트륨 완충액(pH 5)에 기질을 용해시킵니다.
  2. 효소 추출물 200μL와 기판 300μL를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다.
  3. 25 °C와 40 °C의 두 가지 온도에서 8시간 동안 반응을 배양합니다.
  4. 100 °C에서 가열하여 반응을 종료합니다.
  5. β-1,3-글루칸과 MLG의 반응 혼합물을 10,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 단계 7.3에 설명된 대로 진행합니다.
  6. β-1,4-글루칸의 경우 100°C에서 반응을 종료한 후 혼합물을 800μL의 절대 에탄올로 희석하고 4°C에서 10,000xg에서 10분 동안 원심분리기를 희석합니다.
  7. 상층액을 곡선으로 옮기고 분광 광도계로 590nm에서 흡광도를 측정한 다음 제조업체의 절차( 재료 표 참조)를 사용하여 β-1,4-글루칸에서 β-1,3-글루카나제 활성을 계산하고 활성을 단위/mg 단백질로 표시합니다.

12. β-1,3-glucanase 작용 모드 결정

참고: RWASA2에 감염된 Tugela, Tugela-Dn1 및 Tugela-Dn5 유도 β-1,3-glucanase 작용 모드는 중합도(DP)가 5에서 2 사이인 라미나린-올리고당(LAM)으로 분석되었습니다. 박층 크로마토그래피(TLC), 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 및 포도당 산화효소 과산화효소(GOPOD) 키트를 사용하여 β-1,3-glucanase가 기판을 가수분해하는 데 필요한 DP를 결정합니다. TLC는 정성 분석에 사용되었고, LC-MS는 정량 분석에 사용되었으며, 이는 반응 후 가수분해물 내 올리고당의 농도를 측정하였다(21).

  1. β-1,3-glucanase 작용 모드의 반응을 준비합니다.
    참고: 10kDa 원심분리기 농축 멤브레인 필터로 농축 단백질 추출물을 준비하므로 실험을 위해 농축 및 비농축 RWASA2 감염 단백질 추출물을 준비합니다.
    1. 각 품종에서 추출한 효소를 농축하기 위해 추출물 5mL를 10kDa 원심분리기 농축 멤브레인 필터로 옮깁니다.
    2. 추출물이 포함된 멤브레인 필터 튜브를 15,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
    3. 라미나리펜타오스(LAM5), 라미나리트라오스(LAM4), 라미나리트리오스(LAM3) 및 라미나리비오스(LAM2)( 재료 표 참조)를 50mM 구연산나트륨(pH 5)에 용해시켜 10mg/mL를 만듭니다.
    4. 반응을 시작하려면 단백질 추출물 20μL와 라미나리펜타오스(LAM5), 라미나리트라오스(LAM4), 라미나리트리오스(LAM3) 및 라미나리비오스(LAM2) 40μL를 추가합니다.
    5. 40°C에서 16시간 동안 반응을 배양하고 100°C에서 5분 동안 끓여 종료합니다.
  2. 박층 크로마토그래피(TLC) 수행
    1. 4 개의 실리카 플레이트를 10cm2 개로 자르고 플레이트 표면을 가로 질러 한 선을 그려 한쪽 가장자리 하단에서 1cm의 공간을 남겨 둡니다.
    2. 선 위에 점을 표시하고 Laminarin-oligosaccharides의 다른 품종과 DP에 따라 1cm 간격으로 표시하십시오. 농축 단백질 추출물을 위해 2 개의 실리카 플레이트를 사용하고 다른 2 개는 비 농축 추출물을 위해 가져 가십시오.
    3. 반응 혼합물 3 μL를 실리카 플레이트의 해당 표시된 지점 위에 3-5 번 추가하고 프로세스를 반복하기 전에 플레이트의 지점을 완전히 건조시킵니다.
    4. n-부탄올: 아세트산: 물(2:1:1 V/V/V)의 이동상이 들어 있는 TLC 탱크에 실리카 플레이트를 부드럽게 넣고 샘플의 반점이 있는 면이 바닥에 오도록 합니다.
    5. 이동상이 플레이트의 하단에서 상단으로 이동하도록 합니다.
      참고: 이 단계는 약 2 시간이 소요될 수 있습니다. 샘플이 분리되는 동안 탱크를 움직이거나 방해하지 마십시오.
    6. 이동상에서 플레이트를 제거하고 실온에서 건조시킵니다.
    7. 염색 용액을 작은 용기에 넣고 실리카 플레이트를 5% (v/v) 황산을 사용하여 95%(v/v) 에탄올에 0.3%(w/v) 나프톨 염색 용액에 5초 동안 부드럽게 담갔다가 제거한 다음 실온에서 건조시킵니다.
      알림: 이 단계에서 가열 블록/오븐을 켜고 온도를 100°C로 설정합니다.
    8. 건조된 실리카판을 가열 블록에 놓고 100°C에서 7-10분 동안 또는 청자색 반점이 나타날 때까지 가열합니다. 청자색 반점을 보여주는 실리카판의 사진을 찍고 문서화합니다.
  3. laminarin-oligosaccharides hydrolysate의 농도 정량화
    참고: LAM 가수분해물의 농도는 농축 및 비농축 단백질 추출물21 모두에 대해 정량화됩니다.
    1. C18(탄수화물 4.6 × 250mm) 컬럼에 각 샘플의 20μL를 추가하고 물(용매 A) 및 아세토니트릴(용매 B) 그래디언트를 사용하여 10분 동안 100% B에서 60% B까지 500μL/분의 유속으로 분리한 다음 컬럼 재평형을 위해 총 실행 시간이 20분인 컬럼 재평형 단계를 수행합니다.
    2. 400°C의 히터 온도로 질량 분석 이온 소스에서 음의 전기분무 모드로 용리 분석물을 이온화하여 과도한 용매, 30psi 분무기 가스, 30psi 히터 가스 및 20psi 커튼 가스를 증발시킵니다.
    3. 디클러스터링 전위를 350V로 설정합니다.
    4. 150 Da - 1000 Da 범위의 Q1 스캔 모드에서 3초의 체류 시간으로 질량분석기의 용리 분석물을 분석합니다.
    5. 스프레드시트에 분석물의 농도를 기록합니다.
  4. 포도당의 농도를 정량화합니다.
    1. 제조업체의 지침22,23에 따라 GOPOD 시약을 사용하여 층류 가수분해에 의해 생성된 포도당 농도를 분석합니다.
    2. 분광 광도계의 고정 모드에서 510nm에서 흡광도를 측정합니다.

13. 데이터 수집 및 분석

  1. 감염 또는 검체 채취 중 편향을 피하기 위해 모든 실험을 무작위 배정하고 4배로 분석을 수행합니다.
  2. 달리 명시되지 않는 한, 수집된 실험 데이터에서 생성된 그래프와 표의 값을 나타내기 위해 표준 편차 ± 평균을 사용하십시오.
  3. Microsoft Excel을 사용하여 모든 데이터를 분석하고 그래프를 생성합니다.
  4. 호환되는 소프트웨어로 통계 분석을 수행합니다.
    참고: 다요인 분산 분석(ANOVA)을 수행하여 처리 간의 유의성을 검정하고 Fisher의 LSD를 수행하여 알파 값 0.05에서 동질적인 그룹을 검정합니다.

결과

밀 품종의 4가지 생물학적 복제물(Tugela, Tugela-Dn1 및 Tugela-Dn5)은 3잎 성장 단계에서 RWASA2에 감염되었습니다. 감염 후 잎은 1, 2, 3, 7 및 14dpi로 수확했습니다. 대조군 처리는 RWASA2에 감염되지 않아 실험 결과를 스트레스에 노출되지 않은 밀 식물과 비교할 수 있도록 했습니다. 실험은 4배로 진행되었으며 결과는 평균값으로 제시되었습니다.

RWASA2-inpeded 추출물과 대조?...

토론

밀과 보리는 러시아 밀 진딧물(Diuraphis noxia)을 포함한 진딧물 종에 자주 감염되는 곡물 작물입니다.7,24. 저항성 밀 식물은 감염 기간 동안 방어 반응으로 POD 및 β-1,3-glucanase 활성의 상향 조절을 유도하여 callose 및 lignin 축적을 조절함으로써 세포벽을 수정합니다 6,25,26,27.

공개

저자는 이 작업에 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

M. Mafa는 NRF-Thuthuka (참조 번호 : TTK2204102938)로부터 자금을 지원받았습니다. S.N. Zondo는 석사 학위로 National Research Foundation 대학원 장학금을 받았습니다. 저자들은 이 연구에 사용된 씨앗을 제공한 ARC-SG(Agricultural Research Council - Small Grain) 연구소에 감사를 표합니다. 이 자료에 표현된 모든 의견, 결과 및 권장 사항은 저자의 것이므로 자금 제공자는 이와 관련하여 어떠한 책임도 지지 않습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane deviceSigma-AldrichR1NB84206For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g LaminaribioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM2High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM3High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acidSigma-AldrichD0550Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose Megazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM4High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM5High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanolSigma-Aldrich107017Ethanol absolute for analysis
acetic acidSigma-AldrichB00063Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-CelluloseMegazyme (Wicklow, Ireland)S-ACMCThe polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley) Megazyme (Wicklow, Ireland)G6513A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay DyeBio-Rad Laboratories, South africa500-0006Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II 
Bovine serum albumin (BSA)Gibco Europe810-1018For Laboratory use only
Citrate acidSigma-AldrichC0759For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan Megazyme (Wicklow, Ireland)P-CMCURPowdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-GlucoseSigma-AldrichG8270For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxideBDH Laboratory Supplies, England10366Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estonia)NIPeat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))Multifeed ClassicB1908248A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
NaphtholMerck, GermanyN2780Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
PhenolSigma-Aldrich33517Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)Sigma-AldrichS2377used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EASilica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxideSigma-AldrichS8045For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfiteSigma-Aldrich31448Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrateSigma-AldrichS9390Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrateSigma-Aldrich71500An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis softwareTIBCO Statisticaversion 13.1
Sulfuric acidMerck, Darmstadt, Germany30743Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible SpectrophotometerGENESYS 120 
 NI = not identified.

참고문헌

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