Aufklärung der physikalisch-chemischen Eigenschaften von #946;-1,3-Glucanase und Peroxidase des Abwehrmechanismus der Weizenzellwand gegen Diuraphis noxia-Befall

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Verfahren zur Untersuchung und Charakterisierung von zellwandbezogenen Enzymen, hauptsächlich β-1,3-Glucanase und Peroxidase, in Weizenpflanzen. Ihr Aktivitätsniveau nimmt während der Weizen-RWA-Interaktion zu und ist an der pflanzlichen Abwehrreaktion durch Zellwandverstärkung beteiligt, die das Fressen von Blattläusen verhindert.

Zusammenfassung

Weizenpflanzen, die von Russischen Weizenblattläusen (RWA) befallen sind, induzieren eine Kaskade von Abwehrreaktionen, einschließlich der Überempfindlichkeitsreaktionen (HR) und der Induktion von pathogeneseverwandten (PR) Proteinen wie β-1,3-Glucanase und Peroxidase (POD). Ziel dieser Studie ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Zellwand-assoziiertem POD und β-1,3-Glucanase zu charakterisieren und ihren Synergismus auf die Zellwandmodifikation während der RWASA2-Weizen-Interaktion zu bestimmen. Die anfälligen Sorten Tugela, mäßig resistentes Tugela-Dn1 und resistentes Tugela-Dn5 wurden vorgekeimt und unter Gewächshausbedingungen gepflanzt, 14 Tage nach der Pflanzung gedüngt und alle 3 Tage bewässert. Die Pflanzen wurden im 3-Blatt-Stadium mit 20 parthenogenetischen Individuen desselben RWASA2-Klons befallen, und die Blätter wurden 1 bis 14 Tage nach dem Befall geerntet. Die Interzelluläre Waschflüssigkeit (IWF) wurde mittels Vakuumfiltration extrahiert und bei -20 °C gelagert. Blattreste wurden zu Pulver zerkleinert und für Zellwandbestandteile verwendet. Die POD-Aktivität und -Charakterisierung wurden unter Verwendung von 5 mM Guajakol Substrat und H₂O₂ bestimmt, wobei die Änderung der Absorption bei 470 nm überwacht wurde. β-1,3-Glucanase-Aktivität, pH-Wert und Temperatur optimale Bedingungen wurden durch Messung des gesamten reduzierenden Zuckers im Hydrolysat mit DNS-Reagenz unter Verwendung von β-1,3-Glucan- und β-1,3-1,4-Glucan-Substraten, Messung der Absorption bei 540 nm und unter Verwendung der Glukose-Standardkurve nachgewiesen. Das pH-Optimum wurde zwischen pH 4 und 9, das Temperaturoptimum zwischen 25 und 50 °C und die thermische Stabilität zwischen 30 °C und 70 °C bestimmt. Die Spezifität des β-1,3-Glucanase-Substrats wurde bei 25 °C und 40 °C unter Verwendung von Curdlan und Gerste β-1,3-1,4-Glucan-Substraten bestimmt. Zusätzlich wurde der Wirkmechanismus von β-1,3-Glucanase mittels Laminaribiose zu Laminaripentaose bestimmt. Die Muster der Oligosaccharidhydrolyseprodukte wurden qualitativ mit Dünnschichtchromatographie (DC) und quantitativ mit HPLC analysiert. Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode demonstriert einen robusten Ansatz für den Befall von Weizen mit RWA, die Extraktion von Peroxidase und β-1,3-Glucanase aus der Zellwandregion und deren umfassende biochemische Charakterisierung.

Einleitung

Russische Weizenblattläuse (RWA) befallen Weizen und Gerste und verursachen erhebliche Ertragsverluste oder eine Verringerung der Getreidequalität. Weizen reagiert auf einen Befall, indem er verschiedene Abwehrreaktionen hervorruft, einschließlich der Erhöhung der β-1,3-Glucanase- und Peroxidase-Aktivität in den resistenten Sorten, während anfällige Sorten die Aktivität dieser Enzyme in der frühen Befallsphase verringern 1,2,3,4. Zu den Schlüsselfunktionen von β-1,3-Glucanase und POD in der Weizenpflanze gehörten die Regulierung der Callose-Akkumulation in der resistenten Sorte und der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), das Quenchen an der Zellwand und den apoplastischen Regionen während eines RWA-Befalls 1,3,5,6,7. Mafa et ^al.6 zeigten, dass es eine starke Korrelation zwischen der erhöhten POD-Aktivität und dem erhöhten Ligningehalt in der resistenten Weizensorte bei RWASA2-Befall gab. Darüber hinaus deutete ein erhöhter Ligningehalt darauf hin, dass die Zellwand der befallenen resistenten Weizensorte verstärkt wurde, was zu einer reduzierten RWA-Fütterung führte.

Die meisten Forschergruppen extrahierten und untersuchten apoplastische β-1,3-Glucanase und POD während der Weizen/Gerste-RWA-Interaktion; Darüber hinaus behaupteten die meisten dieser Studien, dass diese Enzyme die Zellwand der mit RWA befallenen Weizenpflanze beeinflussen, ohne das Vorhandensein von Enzymen im Zellwandbereich zu messen. Nur wenige Studien haben mikroskopische Techniken verwendet, um zu zeigen, dass die β-1,3-Glucanase-Aktivität mit der Callose-Regulation verbunden ist ^7,8,9 oder extrahierte wichtige Zellwandkomponenten, um die Korrelation zwischen POD-Aktivitäten und Zellwandmodifikation bei den resistenten ^6,10 zu demonstrieren. Das Fehlen von Untersuchungen der Assoziation von β-1,3-Glucanase und POD mit der Zellwand deutet darauf hin, dass Methoden entwickelt werden müssen, die es den Forschern ermöglichen, die an die Zellwand gebundenen Enzyme direkt zu messen.

Die derzeitige Methode schlägt vor, dass die Entfernung der apoplastischen Flüssigkeit aus dem Blattgewebe notwendig ist, bevor die an die Zellwand gebundenen Enzyme extrahiert werden. Das Extraktionsverfahren der apoplastischen Flüssigkeit muss zweimal aus dem Blattgewebe durchgeführt werden, das zur Extraktion der an die Zellwand gebundenen Enzyme verwendet wird. Dieser Prozess reduziert die Kontamination und Verwechslung der apoplastischen Enzyme mit denen in den Zellwandregionen. Daher haben wir in dieser Studie zellwandgebundenes POD, β-1,3-Glucanase und MLG-spezifische β-Glucanase extrahiert und ihre biochemische Charakterisierung durchgeführt.

Protokoll

Die Studie wurde mit Genehmigung und Genehmigung der Ethikkommission für Umwelt- und Biosicherheitsforschung der University of the Free State (UFS-ESD2022/0131/22) durchgeführt. Die Details zu den Reagenzien und der Ausrüstung sind hier in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bedingungen für das Pflanzenwachstum

1. Keimen Sie 250 Samen jeder Weizensorte, d. h. anfälliges Tugela, mäßig resistentes Tugela-Dn1 und resistentes Tugela-Dn5, in getrennten Petrischale.
2. 5 ml destilliertes Wasser in jede Petrischale geben, mit einem Paraffinfilm verschließen und 2 Tage lang in der auf 25 °C eingestellten Keimkammer inkubieren.
3. Verpflanzen Sie die gekeimten Samen jeder Sorte in 15 cm große Töpfe mit 1:1 Erde und Torfmoos (15 Pflanzen pro Topf) unter kontrollierten Gewächshausbedingungen.
4. Stellen Sie die Temperaturregime auf 18 °C bzw. 24 °C für Nacht und Tag ein.
5. Bewässern Sie die Pflanzen alle 3 Tage mit Leitungswasser und versorgen Sie sie 14 Tage nach der Keimung mit 2 g/L Dünger.
6. Setzen Sie die Pflanzen in Käfige, die von Netzen umhüllt sind, und lassen Sie sie bis zum dritten Blattstadium ^2,6 heranwachsen (mit vier biologischen Repliken jeder Sorte).

2. Befall von Weizensorten mit RWASA2

1. Befall von Tugela-, Tugela-Dn1- und Tugela-Dn5-Weizensorten mit RWASA2 nach Jimoh et ^al.11 und Mohase und Taiwe¹².
2. Halten Sie die Pflanzen in zwei getrennten Sets in Käfigen; Befallen Sie ein Set mit 20 parthenogenetischen Individuen desselben RWASA2-Klons pro Pflanze in jedem Topf in den mit Netzen abgedeckten Wachstumskammern. Halten Sie einen weiteren Satz Weizenpflanzen in einem separaten Raum unter der Wachstumskammer mit sauberen Netzen und behandeln Sie sie als Kontrollen.
   HINWEIS: Bewahren Sie die beiden Behandlungen in getrennten Räumen auf und decken Sie die Pflanzen in Käfigen ab, die mit Netzen umhüllt sind. In Fällen, in denen in einer Studie zwei verschiedene RWA-Biotypen verwendet werden, sollten die Pflanzen, die mit einem RWA-Biotyp befallen sind, so weit wie möglich von denen mit dem zweiten Biotyp befallen sind, oder in getrennten Räumen unter Wachstumskammern aufbewahrt werden, die mit Netzen abgedeckt sind, um eine mögliche Kreuzkontamination mit dem RWASA2 zu vermeiden.
3. Für die Ernte wählst Du das zweite und dritte Blatt zu zwei verschiedenen Zeitpunkten aus, der kurzfristigen Fütterungszeit (1, 2 und 3 Tage) und der langfristigen Fütterungszeit (7 und 14 Tage) und wickelst sie in feuchte Papiertücher ein.
4. Füllen Sie die geernteten Blätter sofort in eine Kiste mit Eis um, um den Blattstoffwechsel vor der Extraktion der interzellulären Waschflüssigkeit (IWF) zu reduzieren.

3. Extraktion der interzellulären Waschflüssigkeit (IWF) aus dem Apoplasten

1. Schneiden Sie die geernteten Blätter von etwa drei Weizensorten in 7 cm große Stücke.
2. Die Blattstücke werden zweimal in destilliertem Wasser abgespült, um die abgeschnittenen Enden von zytosolischen Verunreinigungen zu befreien ^6,13.
3. Geben Sie die Blattstücke in ein dickwandiges Glasröhrchen und tauchen Sie die Proben in Extraktionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8).
4. Wenden Sie eine Vakuuminfiltration für 5 Minuten mit einer Wasserstrahlpumpe an, um die Blätter mit dem Extraktionspuffer zu imprägnieren.
5. Danach die Blattstücke aus der Glasröhre nehmen und mit einem Papiertuch trocken tupfen.
6. Die getrockneten Blattstücke senkrecht in vorgekühlte Zentrifugenröhrchen mit Lochscheiben einführen und bei 500 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
7. Verwenden Sie eine 100-μl-Pipette, um den Überstand in vorgekühlte 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln.
8. Wiederholen Sie den gesamten Extraktionsvorgang mit dem gleichen Blattmaterial.
9. Kombinieren Sie den gesammelten Überstand und lagern Sie ihn bei -20° C.
   HINWEIS: Die überstehenden Aliquoten werden als Quelle des Apoplastgehalts oder IWF behandelt. Das IWF wurde in der aktuellen Studie nicht verwendet, aber es war wichtig, es aus dem Blattgewebe zu entfernen, bevor wir das an die Zellwand gebundene β-1,3-Glucanase und Peroxidase (POD) extrahierten.

4. Extraktion der Zellwand-assoziierten β-1,3-Glucanase und POD

HINWEIS: Die Blattreste, die nach der IWF-Extraktion übrig blieben, wurden zur Extraktion des gesamten Zellwandproteins verwendet.

1. Zerkleinern Sie die Blattreste mit flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel zu einem feinen Pulver.
2. Übertragen Sie ca. 200 mg des pulverisierten Blattgewebes in einen Mörser mit 4 ml Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat mit 1 % (w/v) Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP); pH 5,0), gefolgt von einem Mahlen mit einem Stößel zu einer glatten Paste, die dann in Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird.
3. Inkubieren Sie die Mischung in den Mikrozentrifugenröhrchen für 3 min auf Eis und zentrifugieren Sie dann bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C.
4. Sammeln Sie den Überstand (Gesamtproteinextrakte) in Mikrozentrifugenröhrchen (Aliquote von 2 ml) und verwenden Sie ihn als Quelle für β-1,3-Glucanase und POD für die gesamte Studie.

5. Bestimmung des Proteinstandards

1. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration der Extrakte nach der Bradford-Methode¹⁴.
2. Bereiten Sie die Rinderserumalbumin (BSA)-Lösungen in den Konzentrationen von 0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml und 1,0 mg/ml, gelöst in 50 mM Natriumphosphatpuffer, um den Proteinstandard zu erzeugen.
3. Bereiten Sie den Standard vor, indem Sie 10 μl jeder BSA-Lösung mit 190 μl (0,25 % v/v) Bradford-Reagenz in die 96-Well-Mikroplatte geben (siehe Materialtabelle).
4. Inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 25 °C und messen Sie die Extinktion bei 595 nm mit dem Mikroplatten-Reader und verwenden Sie die Absorptionswerte, um die Standardkurve für die Quantifizierung der Proteinkonzentration vorzubereiten.
5. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration
   1. Geben Sie 10 μl des extrahierten Enzyms (Schritt 4) in eine 96-Well-Mikroplatte mit 190 μl (0,25 % v/v) Bradford-Reagenz in dreifacher Ausfertigung.
   2. Bei Raumtemperatur (25 °C) 20 min inkubieren.
   3. Messen Sie die Extinktion bei 595 nm mit dem Spektralphotometer mit einem Mikroplatten-Reader und verwenden Sie die Absorptionswerte, um die Proteinkonzentration unter Verwendung von BSA als Proteinstandard (hergestellt in Schritt 5.4) zu bestimmen.

6. Bereiten Sie den Glukosestandard auf β-1,3-Glucanase-Aktivität vor

1. Bereiten Sie die Standardlösungen mit Konzentrationen zwischen 0,00 mg/ml und 1,0 mg/ml (0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml) mit in destilliertem Wasser gelöster Glukose vor.
2. Geben Sie 300 μl jeder Glukoselösung und 600 μl 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)-Reagenz im Verhältnis 1:2 in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie die Reaktionen 5 Minuten lang bei 100 °C (siehe Materialtabelle für DNS-Reagenzien) (Miller et ^al.15).
3. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Extinktion bei 540 nm mit dem Spektralphotometer messen.
4. Verwenden Sie die durchschnittlichen Absorptionswerte, um die Standardkurve zur Bestimmung der β-1,3-Glucanase-Enzymaktivität zu entwickeln.

7. Bestimmung des β-1,3-Glucanase-Aktivitätsassays

HINWEIS: Die Enzymaktivität der zellwandgebundenen β-1,3-Glucanase, die aus Tugela, Tugela-Dn1 und Tugela-Dn5 extrahiert wurde, wurde bestimmt durch die Menge an freigesetzten Gesamtreduktionszuckern, die aus der Hydrolyse freigesetzt wurden, von 0,5 % (w/v) gemischt verknüpften β-1,3-1,4-Glucan (MLG) und 0,4 % (w/v) β-1,3-Glucan-Substraten unter Verwendung einer modifizierten Methode, wie von Miller et al. ^{beschrieben.15}. Bewahren Sie die Röhrchen mit Proteinaliquoten immer auf dem Eis auf. Wenn die Proben eingefroren waren, tauen Sie sie auf Eis auf und fahren Sie sofort nach dem Auftauen fort.

1. Geben Sie 200 μl des Enzymextrakts (halten Sie die Proteinkonzentration bei allen Reaktionen zwischen 20 μg/ml und 90 μg/ml, sofern nicht anders angegeben) und 300 μl des in 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 5,0) gelösten Substrats in die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Führen Sie eine parallele Blindreaktion ohne Enzymextrakt für alle Substrate durch (erster Blindwert), und der Enzymblindwert besteht aus Enzymextrakt ohne Substrat (zweiter Blindwert). Sowohl das Substrat als auch der Enzymextrakt wurden im ersten bzw. zweiten Schwarz durch den Puffer ersetzt.
2. Die Reaktionen werden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und durch Erhitzen auf 100 °C für 5 min beendet, dann bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
3. Mischen Sie 300 μl des Überstands mit 600 μl DNS-Reagenz (Verhältnis 1:2) in neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und kochen Sie es 5 min lang bei 100 °C.
4. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und messen Sie die Extinktion bei 540 nm mit dem Spektralphotometer.
   HINWEIS: Wenn die Konzentration des gesamten reduzierenden Zuckers in der Mischung hoch ist, führt dies zu einer dunkelbraunen Lösung, die mit dem Spektralphotometer schwer abzulesen ist. Daher ist eine weitere Verdünnung der Proben notwendig, bevor die Extinktion abgelesen werden kann.
5. Verwenden Sie die in Schritt 6.4 entwickelte Glukose-Standardkurve, um die Enzymaktivität in den SI-Einheiten der Standardkurve zu bestimmen.
6. Um die Aktivität in eine spezifische Aktivität umzuwandeln, die in μmol Glukose/h/mg Protein ausgedrückt wird, verwenden Sie die folgende Gleichung:
   Spezifische Aktivität = [(Enzymaktivität/180.16)*1000]/Zeit/Proteinkonzentration
   HINWEIS: Konvertieren Sie die Enzymaktivität in mg/ml in g/ml; 180,16 g/mol ist das Molekulargewicht von Glukose, 1000 ist ein Faktor, der M in Mikromol umwandelt, Zeit ist die Reaktionsperiode und die Proteinextraktkonzentration wird in mg/ml dargestellt. Eine Einheit der β-1,3-Glucanase-Aktivität ist definiert als 1 μmol Glukose, die innerhalb einer Reaktionszeit von 1 h aus dem Substrat freigesetzt wird.

8. Bestimmung der Peroxidase (POD)-Aktivität

HINWEIS: Die zellwandgebundene Peroxidaseaktivität der Weizensorten Tugela, Tugela-Dn1 und Tugela-Dn5 wurde durch Quantifizierung der Bildung des pro Zeiteinheit aus Guajakol produzierten Tetra-Guajakol^{bestimmt 16}.

1. 30 μl des Enzymextrakts, 30 μl 1 % (v/v) H₂O₂ und 970 μl 5 mM Guajakol bei 25 °C in die Küvetten geben.
   HINWEIS: Führen Sie die Blindreaktion ohne den Enzymextrakt (erste Leerprobe) und eine weitere Blindreaktion für Enzymproben ohne Substrat (zweite Blindprobe) durch. Die Enzym- oder Substratproben wurden durch 50 mM Natriumphosphatpuffer im ersten bzw. zweiten Rohling ersetzt.
2. Verwenden Sie den kinetischen Modus des Spektralphotometers, um die Änderung der Extinktion bei 470 nm zu überwachen.
3. Bestimmen Sie die Steigung, an der das Diagramm linear war, und verwenden Sie sie als Absorptionswert.
4. Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption und verwenden Sie sie zur Berechnung der POD-Aktivität.
5. Berechnen Sie die Peroxidaseaktivität unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten von Guajakol (26,6 ^{mM-1 cm-1}) und drücken Sie die Aktivität in μmol Tetra-Guajakol/min/mg Protein aus.
6. Berechnen Sie die POD-Aktivität mit der von Mafa et ^al.6 verwendeten Gleichung:
   POD-AKTIVITÄT = [(ΔABS × DF) ÷ Proteinkonzentration] × 26,6 ^{mM-1 cm-1} × 1 cm
   ANMERKUNG: Dabei ist ΔABS = durchschnittliche Absorption; DF = Verdünnungsfaktor; 26,6 ^{mM-1 cm-1} = Guaiakol-Extinktionskoeffizient.

9. POD-Charakterisierung

HINWEIS: Die POD-Charakterisierungsassays wurden unter Verwendung von 3 Tagen nach dem Befall (dpi) Enzymextrakten von Tugela, Tugela-Dn1 und Tugela-Dn5 nach ähnlichen Methoden durchgeführt, die in Schritt 8 beschrieben wurden, mit geringfügigen Änderungen der Reaktionspuffer und Temperaturen. Die Enzymproben wurden während der Experimente immer auf Eis aufbewahrt. Führen Sie die Reaktionen in vierfacher Ausführung mit einer parallelen Blindreaktion aus.

1. Führen Sie für optimale pH-Assays die folgenden Schritte aus.
   1. Flüssigwassersubstrat in 50 mM Puffern (Natriumcitrat, pH 4 und 5), Natriumphosphat (pH 6 und 7) und Tris-HCl (pH 8 und 9) auflösen (siehe Materialtabelle).
   2. Führen Sie die Reaktionen bei 25 °C durch, wie in Schritt 8 beschrieben.
2. Führen Sie für optimale Temperaturtests die folgenden Schritte aus.
   1. Führen Sie die Reaktionen bei 25 °C, 30 °C, 40 °C bzw. 50 °C durch.
   2. Verwenden Sie Guajakolsubstrat, das im Puffer pH 5 (pH-Optimum) gelöst ist, und führen Sie die Reaktionen wie in Schritt 8 beschrieben durch.
3. Führen Sie für Thermostabilitätsassays die folgenden Schritte aus.
   1. Bevor Sie mit den Reaktionen beginnen, inkubieren Sie das Enzym 30 Minuten lang bei 37 °C, 50 °C und 70 °C.
   2. Die Reaktionen werden gemäß den in Schritt 8 beschriebenen Methoden mit 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 5) und bei 40 °C (Temperaturoptimum) durchgeführt.

10. Charakterisierung der β-1,3-Glucanase

HINWEIS: Führen Sie die Charakterisierungsassays nach der in Schritt 7 beschriebenen Methode mit 3-dpi-Enzymextrakten durch, mit einigen Änderungen an den Reaktionspuffern und Temperaturen. Führen Sie die Reaktionen in vierfacher Ausführung durch, mit einer parallelen Blindreaktion für jedes Substrat.

1. Für optimale pH-Assays gehen Sie wie folgt vor:
   1. MLG- und β-1,3-Glucan-Substrate werden in 50 mM-Puffern (Natriumcitrat, pH 4 und 5), Natriumphosphat (pH 6 und 7) und Tris-HCl (pH 8 und 9) gelöst.
   2. Führen Sie die Reaktion wie in Schritt 7 beschrieben aus.
2. Für optimale Temperatur-Assays gehen Sie wie folgt vor:
   1. Führen Sie die Reaktionen bei 25 °C, 30 °C, 40 °C bzw. 50 °C durch.
   2. Verwenden Sie MLG- und β-1,3-Glucan-Substrate, die im 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 5) mit optimalem pH-Wert (erhalten in Schritt 10.1) gelöst sind, und führen Sie die Reaktionen wie in Schritt 7 beschrieben durch.
3. Für Thermostabilitätsassays gehen Sie wie folgt vor:
   1. Bevor Sie mit den Reaktionen beginnen, inkubieren Sie das Enzym 30 Minuten lang bei 37 °C, 50 °C und 70 °C.
   2. Die Reaktionen werden mit Substraten durchgeführt, die in 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 5) gelöst sind, und 24 Stunden lang bei 25 °C und 40 °C inkubieren.

11. Bewertung des Wirkmechanismus von β-1,3-Glucanase auf verschiedenen Glucan-Substraten

HINWEIS: Glucansubstrate enthalten den gleichen Glukoserest in ihrem Rückgrat, aber die glykosidischen Bindungen zwischen Glucopyranose-Einheiten sind vielfältig und können die α oder β Ausrichtung¹⁷ annehmen. Die glykosidischen Bindungen können sich zwischen mehreren Kohlenstoffatomen von Glukosemolekülen bilden, die ihre chemische Struktur definieren, z. B. β-1,3-Glucan, β-1,4-Glucan und gemischtes Linked-β-1,3-1,4-Glucan (MLG)18,19,20. Der Wirkmechanismus der β-1,3-Glucanase wurde anhand von RWASA2-befallenen Tugela-, Tugela-Dn1- und Tugela-Dn 5-Proben (Enzymquellen) und den folgenden Substraten β-1,3-Glucan (CM-Curdlan), MLG (aus Gerste) und β-1,4-Glucan (AZO-CM-Cellulose) bestimmt. Der Wirkmechanismus wird unter optimalen Assay-Bedingungen (25 °C und 40 °C, pH 5,0) unter Verwendung von 0,1 % (w/v) β-1,4-Glucan, 0,4 % (w/v) β-1,3-Glucan oder 0,5 % (w/v) MLG-Substraten bestimmt.

1. Die Substrate werden in 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 5) aufgelöst.
2. Geben Sie 200 μL des Enzymextrakts und 300 μL des Substrats in die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Die Reaktionen werden bei zwei getrennten Temperaturen, 25 °C und 40 °C, 8 h lang inkubiert.
4. Beendigung der Reaktionen durch Erhitzen auf 100 °C.
5. Das Reaktionsgemisch aus β-1,3-Glucan und MLG bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und dabei wie in Schritt 7.3 beschrieben vorgehen.
6. Bei β-1,4-Glucan wird das Gemisch nach Beendigung der Reaktion bei 100 °C mit 800 μl absolutem Ethanol verdünnt und bei 4 ΰC für 10 min bei 10.000 x g zentrifugiert.
7. Den Überstand in die Kurven übertragen, die Extinktion bei 590 nm mit dem Spektralphotometer messen und die β-1,3-Glucanase-Aktivität auf β-1,4-Glucan nach dem Verfahren des Herstellers berechnen (siehe Materialtabelle) und die Aktivität in Einheiten/mg Protein ausdrücken.

12. Bestimmung des Wirkungsweises von β-1,3-Glucanase

HINWEIS: Die RWASA2-befallenen Tugela-, Tugela-Dn1- und Tugela-Dn5-induzierten β-1,3-Glucanase-Wirkmechanismen wurden mit Laminarin-Oligosacchariden (LAMs) mit einem Polymerisationsgrad (DP) zwischen 5 und 2 untersucht. Verwenden Sie die Dünnschichtchromatographie (DC), die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und das Glukoseoxidase-Peroxidase (GOPOD)-Kit, um die DP zu bestimmen, die für β-1,3-Glucanase zur Hydrolyse des Substrats erforderlich ist. Die TLC wurde für die qualitative Analyse und die LC-MS für die quantitative Analyse verwendet, die die Konzentration der Oligosaccharide im Hydrolysat nach der Reaktion bestimmt²¹.

1. Bereiten Sie die Reaktionen von β-1,3-Glucanase Wirkmechanismus vor
   HINWEIS: Bereiten Sie den konzentrierten Proteinextrakt mit einem 10 kDa-Zentrifugen-Konzentrationsmembranfilter vor und haben Sie somit konzentrierte und nicht konzentrierte RWASA2-befallene Proteinextrakte für das Experiment.
   1. Um die aus jeder Sorte extrahierten Enzyme zu konzentrieren, geben Sie 5 ml der Extrakte in die 10-kDa-Zentrifugen-Konzentrationsmembranfilter.
   2. Die Membranfilterrohre mit dem Extrakt bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
   3. Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3) und Laminaribiose (LAM2) (siehe Materialtabelle) in 50 mM Natriumcitrat (pH 5) auflösen, um 10 mg/ml herzustellen.
   4. Um die Reaktion zu starten, fügen Sie 20 μl des Proteinextrakts und 40 μl Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3) und Laminaribiose (LAM2) hinzu.
   5. Die Reaktion wird 16 Stunden lang bei 40 °C inkubiert und 5 Minuten lang bei 100 °C gekocht.
2. Durchführung der Dünnschichtchromatographie (DC)
   1. Schneiden Sie 4 Kieselsäureplatten in 10 cm² Stücke und ziehen Sie eine Linie über die Oberfläche der Platte, wobei Sie 1 cm Abstand von der Unterseite einer Kante lassen.
   2. Markieren Sie die Punkte über der Linie und markieren Sie sie nach verschiedenen Sorten und DP der Laminarin-Oligosaccharide, 1 cm Abstand und. Nehmen Sie 2 Kieselsäureplatten für konzentrierten Proteinextrakt und die anderen 2 für nicht konzentrierte Extrakte.
   3. Geben Sie 3 μl der Reaktionsgemische 3 bis 5 Mal über die entsprechenden markierten Flecken auf der Kieselplatte und lassen Sie die Flecken auf der Platte vollständig trocknen, bevor Sie den Vorgang wiederholen.
   4. Legen Sie die Kieselsäureplatten vorsichtig in den DC-Tank mit der mobilen Phase von n-Butanol: Essigsäure: Wasser (2:1:1 v/v/v), wobei die Seite die Flecken der Proben am Boden enthält.
   5. Lassen Sie die mobile Phase von unten nach oben auf der Platte wandern.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann ca. 2 Stunden dauern. Bewegen oder stören Sie den Tank nicht, während sich die Proben trennen.
   6. Nehmen Sie die Platten aus der mobilen Phase und lassen Sie sie bei Raumtemperatur trocknen.
   7. Geben Sie die Färbelösung in den kleinen Behälter, tauchen Sie die Kieselsäureplatte vorsichtig 5 s lang in die Färbelösung aus 0,3 % (w/v) Naphthol in 95 % (v/v) Ethanol mit 5 % (v/v) Schwefelsäure, entfernen Sie sie und lassen Sie sie dann bei Raumtemperatur trocknen.
      HINWEIS: Schalten Sie in diesem Schritt den Heizblock/Backofen ein und stellen Sie die Temperatur auf 100 °C ein.
   8. Legen Sie die getrockneten Kieselsäureplatten auf den Heizblock und erhitzen Sie sie 7-10 Minuten lang bei 100 °C oder bis die blau-violetten Flecken erscheinen. Machen Sie Fotos von den Kieselsäureplatten mit den blau-violetten Flecken und dokumentieren Sie diese.
3. Quantifizierung der Konzentration von Laminarin-Oligosaccharid-Hydrolysaten
   HINWEIS: Die Konzentration der LAM-Hydrolysate wird sowohl für konzentrierte als auch für nicht konzentrierte Proteinextrakte^{quantifiziert 21}.
   1. Geben Sie 20 μl jeder Probe auf eine C18-Säule (Kohlenhydrat 4,6 × 250 mm) und lassen Sie sie bei einer Flussrate von 500 μl/min unter Verwendung eines Wasser- (Lösungsmittel A) und Acetonitril-Gradienten (Lösungsmittel B) von 100 % B auf 60 % B über 10 Minuten trennen, gefolgt von Säulen-Reequilibrierungsschritten mit einer Gesamtlaufzeit von 20 Minuten, um eine erneute Gleichgewichtung der Säule zu ermöglichen.
   2. Ionisieren Sie die eluierenden Analyten im negativen Elektrospray-Modus in der Massenspektrometrie-Ionenquelle mit einer Erhitzertemperatur von 400 °C, um das überschüssige Lösungsmittel, 30 psi Verneblergas, 30 psi Erhitzergas und 20 psi Vorhanggas zu verdampfen.
   3. Stellen Sie das Declustering-Potenzial auf 350 V ein.
   4. Analysieren Sie die eluierenden Analyten auf dem Massenspektrometer in einem Q1-Scanmodus von 150 Da bis 1000 Da mit einer Verweilzeit von 3 s.
   5. Notieren Sie die Konzentrationen der Analyten in der Tabelle.
4. Quantifizieren Sie die Konzentration von Glukose
   1. Analysieren Sie die durch Laminarinhydrolyse erzeugte Glukosekonzentration mit dem GOPOD-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers^22,23.
   2. Messen Sie die Extinktion bei 510 nm in einem festen Modus des Spektralphotometers.

13. Datenerhebung und -analyse

1. Randomisieren Sie alle Experimente, um Verzerrungen während des Befalls oder der Probenentnahme zu vermeiden, und führen Sie die Analyse in Vierfachpräparaten durch.
2. Sofern nicht anders angegeben, verwenden Sie die Mittelwerte ± Standardabweichung, um die Werte in den Diagrammen und Tabellen darzustellen, die aus den gesammelten experimentellen Daten generiert wurden.
3. Verwenden Sie Microsoft Excel, um alle Daten zu analysieren und Diagramme zu erstellen.
4. Führen Sie statistische Analysen mit kompatibler Software durch.
   HINWEIS: Führen Sie eine multifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durch, um die Signifikanz zwischen den Behandlungen zu testen, und Fishers LSD, um auf homogene Gruppen bei einem Alpha-Wert von 0,05 zu testen.

Ergebnisse

Vier biologische Replikate von Weizensorten (Tugela, Tugela-Dn1 und Tugela-Dn5) wurden im 3-Blatt-Wachstumsstadium mit RWASA2 befallen. Nach dem Befall wurden die Blätter mit 1, 2, 3, 7 und 14 dpi geerntet. Die Kontrollbehandlungen waren nicht mit RWASA2 befallen, um die Versuchsergebnisse mit denen von Weizenpflanzen vergleichbar zu machen, die keinem Stress ausgesetzt waren. Die Experimente wurden in Vierfachproben durchgeführt, und die Ergebnisse wurden als Mittelwerte dargestellt.

Diskussion

Weizen und Gerste sind Getreidepflanzen, die häufig von Blattlausarten befallen werden, zu denen auch die Russische Weizenblattlaus (Diuraphis noxia) ^gehört7,24. Resistente Weizenpflanzen induzieren die Hochregulierung von POD- und β-1,3-Glucanase-Aktivitäten als Abwehrreaktionen während der gesamten Befallsperiode, um die Zellwand zu modifizieren, indem sie die Akkumulation von Callose und Lignin regulieren

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.