Aufklärung der physikalisch-chemischen Eigenschaften von #946;-1,3-Glucanase und Peroxidase des Abwehrmechanismus der Weizenzellwand gegen Diuraphis noxia-Befall

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Verfahren zur Untersuchung und Charakterisierung von zellwandbezogenen Enzymen, hauptsächlich β-1,3-Glucanase und Peroxidase, in Weizenpflanzen. Ihr Aktivitätsniveau nimmt während der Weizen-RWA-Interaktion zu und ist an der pflanzlichen Abwehrreaktion durch Zellwandverstärkung beteiligt, die das Fressen von Blattläusen verhindert.

Zusammenfassung

Weizenpflanzen, die von Russischen Weizenblattläusen (RWA) befallen sind, induzieren eine Kaskade von Abwehrreaktionen, einschließlich der Überempfindlichkeitsreaktionen (HR) und der Induktion von pathogeneseverwandten (PR) Proteinen wie β-1,3-Glucanase und Peroxidase (POD). Ziel dieser Studie ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Zellwand-assoziiertem POD und β-1,3-Glucanase zu charakterisieren und ihren Synergismus auf die Zellwandmodifikation während der RWASA2-Weizen-Interaktion zu bestimmen. Die anfälligen Sorten Tugela, mäßig resistentes Tugela-Dn1 und resistentes Tugela-Dn5 wurden vorgekeimt und unter Gewächshausbedingungen gepflanzt, 14 Tage nach der Pflanzung gedüngt und alle 3 Tage bewässert. Die Pflanzen wurden im 3-Blatt-Stadium mit 20 parthenogenetischen Individuen desselben RWASA2-Klons befallen, und die Blätter wurden 1 bis 14 Tage nach dem Befall geerntet. Die Interzelluläre Waschflüssigkeit (IWF) wurde mittels Vakuumfiltration extrahiert und bei -20 °C gelagert. Blattreste wurden zu Pulver zerkleinert und für Zellwandbestandteile verwendet. Die POD-Aktivität und -Charakterisierung wurden unter Verwendung von 5 mM Guajakol Substrat und H₂O₂ bestimmt, wobei die Änderung der Absorption bei 470 nm überwacht wurde. β-1,3-Glucanase-Aktivität, pH-Wert und Temperatur optimale Bedingungen wurden durch Messung des gesamten reduzierenden Zuckers im Hydrolysat mit DNS-Reagenz unter Verwendung von β-1,3-Glucan- und β-1,3-1,4-Glucan-Substraten, Messung der Absorption bei 540 nm und unter Verwendung der Glukose-Standardkurve nachgewiesen. Das pH-Optimum wurde zwischen pH 4 und 9, das Temperaturoptimum zwischen 25 und 50 °C und die thermische Stabilität zwischen 30 °C und 70 °C bestimmt. Die Spezifität des β-1,3-Glucanase-Substrats wurde bei 25 °C und 40 °C unter Verwendung von Curdlan und Gerste β-1,3-1,4-Glucan-Substraten bestimmt. Zusätzlich wurde der Wirkmechanismus von β-1,3-Glucanase mittels Laminaribiose zu Laminaripentaose bestimmt. Die Muster der Oligosaccharidhydrolyseprodukte wurden qualitativ mit Dünnschichtchromatographie (DC) und quantitativ mit HPLC analysiert. Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode demonstriert einen robusten Ansatz für den Befall von Weizen mit RWA, die Extraktion von Peroxidase und β-1,3-Glucanase aus der Zellwandregion und deren umfassende biochemische Charakterisierung.

Einleitung

Russische Weizenblattläuse (RWA) befallen Weizen und Gerste und verursachen erhebliche Ertragsverluste oder eine Verringerung der Getreidequalität. Weizen reagiert auf einen Befall, indem er verschiedene Abwehrreaktionen hervorruft, einschließlich der Erhöhung der β-1,3-Glucanase- und Peroxidase-Aktivität in den resistenten Sorten, während anfällige Sorten die Aktivität dieser Enzyme in der frühen Befallsphase verringern 1,2,3,4. Zu den Schlüsselfunktionen von β-1,3-Glucanase und POD in der Weizenpflanze gehörten die Regulierung der Callose-....

Protokoll

Die Studie wurde mit Genehmigung und Genehmigung der Ethikkommission für Umwelt- und Biosicherheitsforschung der University of the Free State (UFS-ESD2022/0131/22) durchgeführt. Die Details zu den Reagenzien und der Ausrüstung sind hier in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bedingungen für das Pflanzenwachstum

1. Keimen Sie 250 Samen jeder Weizensorte, d. h. anfälliges Tugela, mäßig resistentes Tugela-Dn1 und resistentes Tugela-Dn5, in getrennten Petrischale.
2. 5 ml destilliertes Wasser in jede Petrischale geben, mit einem Paraffinfilm verschließen und 2 Tage lang in der auf....

Diskussion

Weizen und Gerste sind Getreidepflanzen, die häufig von Blattlausarten befallen werden, zu denen auch die Russische Weizenblattlaus (Diuraphis noxia) ^gehört7,24. Resistente Weizenpflanzen induzieren die Hochregulierung von POD- und β-1,3-Glucanase-Aktivitäten als Abwehrreaktionen während der gesamten Befallsperiode, um die Zellwand zu modifizieren, indem sie die Akkumulation von Callose und Lignin regulieren

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.