عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية لقياس الصلابة باستخدام مجهر القوة الذرية

Summary

لقد حددنا مؤخرا تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين كنموذج جديد لضعف الشبكية المرتبط بمرض السكري. يوضح هذا البروتوكول خطوات عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية من مزارع بطانة الشبكية ، متبوعا بوصف لتقنية قياس الصلابة باستخدام مجهر القوة الذرية.

Abstract

التنكس الشعري الشبكي هو السمة المميزة السريرية للمراحل المبكرة من اعتلال الشبكية السكري (DR). كشفت دراساتنا الحديثة أن تصلب الشعيرات الدموية في الشبكية الناجم عن مرض السكري يلعب دورا سببيا حاسما وغير معترف به سابقا في تنكس الشعيرات الدموية في الشبكية بوساطة الالتهاب. تنتج الزيادة في تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين عن الإفراط في التعبير عن أوكسيديز الليسيل ، وهو إنزيم يتشابك ويقوي المصفوفة تحت البطانية. نظرا لأنه من المتوقع أن يؤدي التعامل مع DR في المرحلة المبكرة إلى منع أو إبطاء تقدم DR وفقدان البصر المرتبط به ، فإن المصفوفة تحت البطانية ، وتصلب الشعيرات الدموية تمثل أهدافا علاجية ذات صلة وجديدة لإدارة DR المبكرة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون القياس المباشر لتصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين بمثابة خطوة حاسمة للتحقق قبل السريري لتطوير تقنيات تصوير جديدة للتقييم غير الجراحي لتصلب الشعيرات الدموية في الشبكية في والبشر. مع وضع هذا الرأي في الاعتبار ، نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لقياس عزل وصلابة الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية باستخدام مجهر القوة الذرية.

Introduction

الشعيرات الدموية في الشبكية ضرورية للحفاظ على توازن الشبكية والوظيفة البصرية. في الواقع ، فإن انحطاطهم في مرض السكري المبكر متورط بقوة في تطور المضاعفات التي تهدد الرؤية لاعتلال الشبكية السكري (DR) ، وهي حالة الأوعية الدموية الدقيقة التي تؤثر على ما يقرب من 40 ٪ من جميع الأفراد المصابين بداء السكري¹. يساهم التهاب الأوعية الدموية بشكل كبير في تنكس الشعيرات الدموية في الشبكية في DR. أظهرت الدراسات السابقة دورا مهما للإشارات الجزيئية والكيميائية الحيوية الشاذة في التهاب الأوعية الدموية في الشبكية الناجم عن مرض السكري ^2,3. ومع ذلك ، فقد قدم العمل الأخير نموذجا جديدا لت....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية وتمت الموافقة عليه من قبل اللجان المؤسسية لاستخدام والرعاية (IACUC ؛ رقم البروتوكول ARC-2020-030) في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (رقم ضمان رعاية لمؤسسة OLAW A3196-01). تم تنفيذ البروتوكول التالي باستخدام الشعيرات الدموية الشبكية المعزولة من الفئران البالغة (البالغة من العمر 20 أسبوعا) C57BL / 6J التي تزن ~ 25 جم (الفئران المصابة بالسكري) و ~ 32 جم (الفئران غير المصابة بالسكري. مختبر جاكسون).

1. عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر لقياس صلابة AFM (الأيام 1-4)

ملاحظة: هذا البروتوكول ، ....

النتائج

الشعيرات الدموية الشبكية للفأر
يتضمن قياس صلابة AFM للشعيرات الدموية الشبكية المعزولة خطوات معالجة العينات التي يمكن أن تلحق الضرر بسلامتها الميكانيكية الهيكلية. لمنع ذلك وبالتالي ضمان جدوى وموثوقية وقابلية استنساخ قياسات AFM ، يتم تثبيت العيون المنزوعة النواة في 5٪ فورمالين طو.......

Discussion

تم استخدام AFM على نطاق واسع لقياس التغيرات المرتبطة بالمرض في تصلب الأوعية الكبيرة ، مثل الشريان الأورطي والشرايين¹⁶. وقد ساعدت هذه النتائج في تحديد دور البيولوجيا الميكانيكية البطانية في مضاعفات القلب والأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين¹⁷. بناء على هذه النتائج ، ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective