Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica

Resumen

Recientemente identificamos el endurecimiento capilar de la retina como un nuevo paradigma para la disfunción retiniana asociada con la diabetes. Este protocolo detalla los pasos para el aislamiento de los capilares de la retina del ratón y la matriz subendotelial de los cultivos endoteliales de la retina, seguido de una descripción de la técnica de medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica.

Resumen

La degeneración capilar de la retina es un sello clínico de las primeras etapas de la retinopatía diabética (RD). Nuestros estudios recientes han revelado que el endurecimiento capilar de la retina inducido por la diabetes desempeña un papel causal crucial y previamente no reconocido en la degeneración de los capilares de la retina mediada por la inflamación. El aumento de la rigidez capilar de la retina es el resultado de la sobreexpresión de la lisil oxidasa, una enzima que se entrecruza y endurece la matriz subendotelial. Dado que se espera que el abordaje de la RD en una etapa temprana prevenga o ralentice la progresión de la RD y la pérdida de visión asociada, la matriz subendotelial y la rigidez capilar representan objetivos terapéuticos relevantes y novedosos para el tratamiento temprano de la RD. Además, la medición directa de la rigidez capilar de la retina puede servir como un paso crucial de validación preclínica para el desarrollo de nuevas técnicas de imagen para la evaluación no invasiva de la rigidez capilar de la retina en sujetos animales y humanos. Con este punto de vista en mente, aquí proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y la medición de la rigidez de los capilares de la retina y la matriz subendotelial de ratón utilizando microscopía de fuerza atómica.

Introducción

Los capilares de la retina son esenciales para mantener la homeostasis de la retina y la función visual. De hecho, su degeneración en la diabetes temprana está fuertemente implicada en el desarrollo de complicaciones amenazantes para la visión de la retinopatía diabética (RD), una afección microvascular que afecta a casi el 40% de todos los individuos^{con diabetes.} La inflamación vascular contribuye significativamente a la degeneración capilar de la retina en la RD. Estudios anteriores han demostrado un papel importante de las señales moleculares y bioquímicas aberrantes en la inflamación vascular de la retina inducida por ....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Uso de Animales y Cuidado (IACUC; número de protocolo ARC-2020-030) de la Universidad de California, Los Ángeles (número de garantía de bienestar animal de la institución OLAW A3196-01). El siguiente protocolo se ha realizado utilizando capilares retinianos aislados de ratones machos C57BL/6J adultos (20 semanas de edad) con un peso de ~25 g (ratones diabéticos) y ~32 g (ratones no diabéticos; Lab....

Discusión

La MFA ha sido ampliamente utilizada para medir los cambios asociados a enfermedades en la rigidez de los vasos más grandes, como la aorta y las arterias¹⁶. Estos hallazgos han ayudado a establecer el papel de la mecanobiología endotelial en complicaciones cardiovasculares como la aterosclerosis¹⁷. Sobre la base de estos hallazgos, hemos comenzado a investigar el papel previamente no reconocido de la mecanobiología endotelial en el desarrollo de lesiones microvasculares .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective