A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.
ניוון נימי הרשתית הוא סימן היכר קליני של השלבים המוקדמים של רטינופתיה סוכרתית (DR). המחקרים האחרונים שלנו גילו כי התקשות נימי רשתית הנגרמת על ידי סוכרת ממלאת תפקיד סיבתי מכריע שלא היה מוכר בעבר בניוון מתווך דלקת של נימי הרשתית. העלייה בנוקשות נימי הרשתית נובעת מביטוי יתר של ליזיל אוקסידאז, אנזים המצליב ומקשיח את המטריצה התת-אנדותלית. מכיוון שהתמודדות עם DR בשלב מוקדם צפויה למנוע או להאט את התקדמות DR ואובדן ראייה נלווה, מטריצה תת-אנדותלית ונוקשות נימים מייצגים מטרות טיפוליות רלוונטיות וחדשניות לניהול DR מוקדם. יתר על כן, מדידה ישירה של נוקשות נימי הרשתית יכולה לשמש כשלב אימות פרה-קליני מכריע לפיתוח טכניקות הדמיה חדשות להערכה לא פולשנית של נוקשות נימי הרשתית בבעלי חיים ובבני אדם. בהתחשב בהשקפה זו, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט למדידת בידוד ונוקשות של נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.
נימי רשתית חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ברשתית ותפקוד הראייה. ואכן, הניוון שלהם בסוכרת מוקדמת מעורב מאוד בהתפתחות סיבוכים מסכני ראייה של רטינופתיה סוכרתית (DR), מצב כלי דם המשפיע על כמעט 40% מכלל האנשים עם סוכרת1. דלקת כלי דם תורמת באופן משמעותי לניוון נימי הרשתית ב- DR. מחקרים קודמים הדגימו תפקיד חשוב לרמזים מולקולריים וביוכימיים חריגים בדלקת כלי דם ברשתיתהנגרמת על ידי סוכרת 2,3. עם זאת, עבודה חדשה הציגה פרדיגמה חדשה לפתוגנזה של DR המזהה התקשות נימי רשתית כגורם מכריע אך לא מוכר בעבר של דלקת כלי דם ברשתית וניוון 4,5,6
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים וטיפול (IACUC; פרוטוקול מספר ARC-2020-030) באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (OLAW institution animal welfare assurance number A3196-01). הפרוטוקול הבא בוצע באמצעות נימי רשתית שבודדו מעכברי C57BL/6J זכרים בוגרים (בני 20 שבועות) במשקל ~25 גרם (עכברים סוכרתיים) ו~32 גרם (עכברים שאינם סוכרתיים; מעבדת ג'קסון).
1. בידוד נימי רשתית עכבר למדידת קשיחות AFM (ימים 1-4)
הערה: פרוטוקול זה, שדווח במחקר4 שנערך לאחרונה, מפרט את ....
נימי רשתית עכבר
מדידת קשיחות AFM של נימי רשתית מבודדים כוללת שלבי טיפול בדגימה שעלולים לפגוע בשלמותם המכנוסטרוקטורלית. כדי למנוע זאת ובכך להבטיח את ההיתכנות, האמינות והשחזור של מדידות AFM, העיניים המצוירות קבועות ב-5% פורמלין למשך הלילה ב-4°C לפני בידוד כלי הדם. פרוטוקול קיבוע מתון ?.......
AFM נמצא בשימוש נרחב כדי למדוד שינויים הקשורים למחלות בנוקשות של כלי דם גדולים יותר, כגון אבי העורקים ועורקים16. ממצאים אלה סייעו לבסס את תפקידה של מכנוביולוגיה אנדותל בסיבוכים קרדיווסקולריים כגון טרשת עורקים17. בהתבסס על ממצאים אלה, התחלנו לחקור את התפקיד שלא היה מ.......
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי R01EY028242 המענקים של המכון הלאומי לעיניים / NIH (לק.ג.), מחקר למניעת עיוורון / פרס Catalyst של הקרן הבינלאומית לחקר הרשתית עבור גישות מחקר חדשניות עבור AMD (לק.ג.), יוזמת סטיבן ריאן למחקר מקולרי (RIMR) מענק מיוחד מקרן W.M. Keck (למכון העיניים דוהני), ומלגת אורסולה מנדל ומלגת גיוון של המועצה לתארים מתקדמים של UCLA (ל- I.S.T). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, Inc. למחלקה לרפואת עיניים באוניברסיטת UCLA. התוכן במאמר זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Retinal Capillary Isolation | |||
0.22 µm PVDF syringe filter | Merck Millipore | SLGVM33RS | Low Protein Binding Durapore |
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium | Corning | 20-031-CV | Final concentration 1X, pH 7.4 |
12-well plate | Falcon Corning | 353043 | |
15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic |
20 mL Luer-Lok TIP syringe | BD | 302830 | |
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | |
60x15 mm Tissue Culture Dish | Falcon Corning | 353002 | |
6-well plate | Falcon Corning | 353046 | |
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
Blade holder | X-ACTO | ||
Carbon Steel Surgical Blade #10 | Bard-Parker | 371110 | |
Dental Wax | Electron Microscopy Sciences | 50-949-027 | |
Dissecting microscope | Am-scope | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Millipore Sigma | HT501128-4L | Final concentration 5% (v/v) |
Kimwipes - wiper tissue | Kimtech Science | 34133 | |
Micro spatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
Orbital Shaker | Lab Genius | SK-O180 | |
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm Tweezer | Ted Pella, Inc. | 5667 | |
Phase contrast microscope | Nikon TS2 | ||
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 302380001 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL | Eppendorf | 22363352 | |
Stereoscope | AmScope | SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X | |
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm | FisherBrand | 1255015 | |
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade | VWR | E553-500ML | pH 8 for trypsin solution |
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade | VWR | VWRV0458-25G | 10 % (w/v) trypsin solution |
Water Molecular Biology Grade | Corning | 46-000-CM | |
Subendothelial Matrix | |||
10X PBS | Corning | 20-031-CV | |
1X PBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | pH 7.4 |
Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Collagen IV antibody | Novus Biologicals | NBP1-26549 | |
DNase I | Qiagen | 79254 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
Fibronectin antibody | Sigma-Aldrich | F6140 | |
Fluoromount | Invitrogen-Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Glass coverslips (12mm) | Fisher | 12-541-000 | |
Glutaraldehyde | Electron microscopy Sciences | 16220 | |
Human retinal endothelial cells (HREC) | Cell Systems Corp | ACBRI 181 | |
MCDB131 medium | Corning | 15-100-CV | |
Mouse retinal endothelial cells (mREC) | Cell Biologics | C57-6065 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-100 | |
Trypsin | Gibco-Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
AFM Measurement | |||
1 µm Probe | Bruker | SAA-SPH-1UM | A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m |
70 nm LC probe | Bruker | PFQNM-LC-V2 | A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius, Spring constant 0.1N/m |
camera | XCAM family | Toupcam | 1080P HDMI |
Desktop to run the camera | Asus | Asus desktop | Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM |
Dish holder for coverslip | Cellvis | D29-14-1.5-N | 29mm glass bottom dish with 14 mm micro-well |
Nanowizard 4 | Bruker | Nanowizard 4 | Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples |
Phase contrast micrscope | Zeiss | Axiovert 200 | Inverted microscope with 10X objective |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved