בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Summary

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

Abstract

ניוון נימי הרשתית הוא סימן היכר קליני של השלבים המוקדמים של רטינופתיה סוכרתית (DR). המחקרים האחרונים שלנו גילו כי התקשות נימי רשתית הנגרמת על ידי סוכרת ממלאת תפקיד סיבתי מכריע שלא היה מוכר בעבר בניוון מתווך דלקת של נימי הרשתית. העלייה בנוקשות נימי הרשתית נובעת מביטוי יתר של ליזיל אוקסידאז, אנזים המצליב ומקשיח את המטריצה התת-אנדותלית. מכיוון שהתמודדות עם DR בשלב מוקדם צפויה למנוע או להאט את התקדמות DR ואובדן ראייה נלווה, מטריצה תת-אנדותלית ונוקשות נימים מייצגים מטרות טיפוליות רלוונטיות וחדשניות לניהול DR מוקדם. יתר על כן, מדידה ישירה של נוקשות נימי הרשתית יכולה לשמש כשלב אימות פרה-קליני מכריע לפיתוח טכניקות הדמיה חדשות להערכה לא פולשנית של נוקשות נימי הרשתית בבעלי חיים ובבני אדם. בהתחשב בהשקפה זו, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט למדידת בידוד ונוקשות של נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

Introduction

נימי רשתית חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ברשתית ותפקוד הראייה. ואכן, הניוון שלהם בסוכרת מוקדמת מעורב מאוד בהתפתחות סיבוכים מסכני ראייה של רטינופתיה סוכרתית (DR), מצב כלי דם המשפיע על כמעט 40% מכלל האנשים עם סוכרת¹. דלקת כלי דם תורמת באופן משמעותי לניוון נימי הרשתית ב- DR. מחקרים קודמים הדגימו תפקיד חשוב לרמזים מולקולריים וביוכימיים חריגים בדלקת כלי דם ברשתית^הנגרמת על ידי סוכרת ^2,3. עם זאת, עבודה חדשה הציגה פרדיגמה חדשה לפתוגנזה של DR המזהה התקשות נימי רשתית כגורם מכריע אך לא מוכר בעבר של דלקת כלי דם ברשתית וניוון ^4,5,6.

באופן ספציפי, העלייה הנגרמת על ידי סוכרת בנוקשות נימי הרשתית נגרמת על ידי upregulation של אנזים crosslinking קולגן ליזיל אוקסידאז (LOX) בתאי אנדותל רשתית (ECs), אשר מקשיח את המטריצה subendothelial (קרום מרתף)^4,5,6. התקשות מטריצה, בתורה, מקשיחה את ECs הרשתית שמעל (עקב הדדיות מכנית), ובכך מובילה לעלייה הכוללת בנוקשות נימי הרשתית⁴. באופן מכריע, התקשות נימי רשתית זו הנגרמת על ידי סוכרת לבדה יכולה לקדם הפעלת EC ברשתית ומוות EC בתיווך דלקת. ניתן לייחס ויסות מכני זה של פגמים ב- EC ברשתית לשינוי במכנוטרנסדוקציה של האנדותל, התהליך שבו רמזים מכניים מומרים לאותות ביוכימיים כדי לייצר תגובה ביולוגית ^7,8,9. חשוב לציין, רמזים מכניים EC משתנים ומבנה מטריצה תת-אנדותל היו מעורבים גם בניוון כלי דם כורואידי הקשור לניוון מקולרי הקשור לגיל מוקדם (AMD)10,11,12, מה שמעיד על ההשלכות הרחבות יותר של מכנוביולוגיה וסקולרית במחלות רשתית ניווניות.

יש לציין כי התקשות נימי הרשתית מתרחשת בשלב מוקדם בסוכרת, אשר עולה בקנה אחד עם הופעת דלקת ברשתית. לפיכך, העלייה בנוקשות נימי הרשתית עשויה לשמש הן כמטרה טיפולית והן כסמן אבחוני מוקדם עבור DR. לשם כך חשוב לקבל מדידות קשיחות אמינות וישירות של נימי הרשתית והמטריצה התת-אנדותלית. ניתן להשיג זאת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), המציע טכניקה ייחודית, רגישה, מדויקת ואמינה למדידה ישירה של קשיחות תאים, מטריצה חוץ-תאית ורקמות¹³. AFM מפעיל כוח הזחה זעיר (ברמת ננו-ניוטון) על הדגימה שקשיחותה קובעת את המידה שבה ה-AFM הנכנס מתכופף - ככל שהדגימה נוקשה יותר, כך הקנטיל מתכופף יותר, ולהיפך. השתמשנו ב-AFM באופן נרחב כדי למדוד את הנוקשות של תאי אנדותל בתרבית, מטריצות תת-אנדותליות ונימי רשתית מבודדים^{של עכבר} 4,5,6,11,12. מדידות קשיחות AFM אלה סייעו לזהות מכנוביולוגיה אנדותל כגורם מפתח של פתוגנזה של DR ו- AMD. כדי לעזור להרחיב את היקף המכנוביולוגיה בחקר הראייה, כאן אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב על השימוש ב- AFM למדידות קשיחות של נימי רשתית עכבר מבודדים ומטריצת תת-אנדותל.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים וטיפול (IACUC; פרוטוקול מספר ARC-2020-030) באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (OLAW institution animal welfare assurance number A3196-01). הפרוטוקול הבא בוצע באמצעות נימי רשתית שבודדו מעכברי C57BL/6J זכרים בוגרים (בני 20 שבועות) במשקל ~25 גרם (עכברים סוכרתיים) ו~32 גרם (עכברים שאינם סוכרתיים; מעבדת ג'קסון).

1. בידוד נימי רשתית עכבר למדידת קשיחות AFM (ימים 1-4)

הערה: פרוטוקול זה, שדווח במחקר⁴ שנערך לאחרונה, מפרט את הקיבוע והקיבוע הקל של עין העכבר, בידוד הרשתית ועיכול טריפסין, ולאחר מכן הרכבה של כלי הדם ברשתית כתוצאה מכך על שקופיות מיקרוסקופיה למדידת קשיחות AFM.

1. חינוך וקיבוע קל (יום 1)
   1. לאחר המתת העכבר בחשיפה לפחמן דו חמצני ואחריו נקע צוואר הרחם, הכנס מיקרו מלקחיים מאחורי גלגל העין, החזק את החיבור השרירי ומשוך בזהירות את העין מבלי לצבוט את המלקחיים הזעירים חזק מדי, מה שעלול לנתק את עצב הראייה.
   2. הניחו את העין המוחדרת בפורמלין 5% (v/v) ב-PBS למשך 24 שעות ב-4°C לקיבוע עדין.
      הערה: בהתבסס על ניסיון⁴, עיניים לא מקובעות או מקובעות קלות יותר מניבות נימים שבירים שהופכים מקוטעים במהלך הכנת דגימת AFM ומדידת נוקשות.
2. בידוד רשתית (יום 2)
   1. הניחו את העין המקובעת על פיסת נייר שעווה מתחת למיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן, באמצעות מיקרו מלקחיים, החזיקו את שאריות השריר ועצב הראייה המחוברים לחלק החיצוני של העין האחורית וכוונו את העין כך שהקרנית תפנה לצד אחד (איור 1).
   2. באמצעות להב כירורגי, לבצע חתך 1-2 מ"מ מאחורי ובמקביל לימבוס (צומת קרנית-סקלרה). לאחר מכן, בזמן שאתם מחזיקים את העין במקומה עם המלקחיים הזעירים, הפעילו כוח כלפי מטה עם הלהב והמשיכו ללחוץ עד שהמקטע הקדמי של העין מופרד לחלוטין מהקצה האחורי (איור 1). יש להשליך את המקטע הקדמי ואת העדשה. אין לראות קדימה ואחורה מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרשתית.
   3. מעבירים את המקטע האחורי (סקלרה, כורויד ורשתית) לצלחת בקוטר 6 ס"מ מלאה ב-PBS (pH 7.4).
   4. באמצעות מרית מיקרו ובו זמנית להחזיק בעדינות את עצב הראייה עם מיקרו מלקחיים, לגרוף החוצה את הרשתית. אחסנו את הרשתית בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל PBS בטמפרטורה של 4°C עד לבידוד נימי.
       
3. שטיפות רשתית
   1. כדי לשטוף רשתית אחת, מלא שש בארות של צלחת 12 בארות עם 1 מ"ל של H₂O מזוקק כפול (ddH₂O). לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר הפוך, להעביר את הרשתית מן צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל לתוך הבאר הראשונה.
   2. שטפו את הרשתית בשייקר המסלול במהירות 120 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   3. בעזרת פיפטה P1000, בזהירות פיפטה מים למעלה ולמטה הסמוך לרשתית, נושף מים על הרשתית כדי לגרום תסיסה עדינה.
   4. בעזרת פיפטת הזכוכית ההפוכה, מעבירים את הרשתית לבאר השנייה וחוזרים על שלבים 1.3.2 ו-1.3.3 4 פעמים, כאשר כל שטיפה נעשית בבאר טרייה (ddH₂O-containing).
   5. לבסוף, העבירו את הרשתית לבאר השישית ושטפו אותה למשך הלילה (O/N) ב-RT על השייקר האורביטלי שנקבע ב-100 סל"ד כדי להקל על הפרדת תאי העצב ברשתית מכלי הדם במהלך עיכול טריפסין.
4. עיכול טריפסין ברשתית (יום 3)
   1. הכינו תמיסת טריפסין 10% (w/v) על ידי המסת אבקת טריפסין 1:250 במאגר Tris (pH 8; 0.1 M). ערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינור החרוטי מספר פעמים כדי למזער את היווצרות הבועות, מה שמקשה על אישור מסיסות הטריפסין.
   2. אזנו את תמיסת הטריפסין 10% באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 10-15 דקות. לאחר שאבקת הטריפסין התמוססה לחלוטין, סננו את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.2 מיקרומטר.
   3. בצלחת של 12 בארות, מוסיפים 2 מ"ל/באר/רשתית של תמיסת טריפסין 10% מסוננת. הוסיפו תמיסת טריפסין נוספת בבאר השכנה (כדי לאזן את דפנות פיפטת הזכוכית לשלבים הבאים).
   4. הוסף 3 מ"ל של ddH₂O בשלוש בארות של צלחת 6 בארות (להקדיש את שלוש הבארות האלה עבור רשתית אחת).
   5. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, הכנס קצה P200 לפני הוספת 4 מ"ל של תמיסת טריפסין 10% מסוננת. העבירו צינור חרוטי זה לאמבטיה בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר לקצה להיות ספוג בטריפסין למשך 2-3 דקות, מכיוון שזה עוזר למנוע מהרשתית להידבק לדפנות הקצה בשלבים האחרונים.
   6. לאחר שטיפת O/N של הרשתית (משלב 1.3.5), יש להשתמש בפיפט P1000 כדי להקפיץ בזהירות מים למעלה ולמטה בסמוך לרשתית, תוך התזת מים על הרשתית כדי לגרום לתסיסה עדינה.
   7. בעזרת פיפטה מזכוכית הפוכה, מעבירים את הרשתית השטופה לבאר המכילה טריפסין של צלחת 12 הבארות (משלב 1.4.3). ודא כי הרשתית מועברת עם כמות מינימלית של ddH_{שיורית 2}O כדי לא לדלל את תמיסת טריפסין באופן משמעותי. לדגור במשך 3 שעות ב 37 ° C.
   8. מרכוז קצה P200 ספוג טריפסין (משלב 1.4.5) על אזור עצב הראייה, מקפיץ בעדינות את כל רשת כלי הדם מעלה ומטה כדי לנתק את הרקמה הלא וסקולרית¹⁴.
   9. בעזרת פיפטה מזכוכית הפוכה שנשטפה מראש בטריפסין (על ידי הזרמת טריפסין למעלה ולמטה 5 פעמים), מעבירים את כלי הדם ברשתית לבאר הראשונה המכילה ddH₂O של צלחת 6 הבארות (משלב 1.4.4).
   10. סובבו את הצלחת והפיפטה את כלי הדם מעלה ומטה באמצעות פיפטת זכוכית הפוכה שטופת טריפסין כדי להסיר שאריות של רקמה לא וסקולרית.
   11. בעזרת פיפטת הזכוכית, מעבירים את כלי הדם ברשתית לבאר השנייה המכילה ddH2O של צלחת 6 הקידוחים ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד להרכבה על המגלשה למדידת קשיחות AFM.
       הערה: כלי דם ברשתית הידרציה (ב-PBS) שלמים מבחינה מבנית ב-4°C למשך עד שבועיים. עם זאת, מדידות נוקשות שגרתיות צריכות להתבצע מנימים טריים מבודדים.
5. הרכבת כלי הדם ברשתית למדידת קשיחות AFM (יום 4)
   1. באמצעות פיפטה זכוכית הפוכה שטופת טריפסין, להעביר את כלי הדם ברשתית לבאר השלישית ddH₂O המכילה את הצלחת 6-well כדי להסיר כל תמיסת טריפסין שיורית.
   2. נקה ביסודיות (באמצעות ddH₂O ורקמת מגב) מגלשת מיקרוסקופ משטח טעונה שתשמש להרכבת רשת כלי הדם למדידת קשיחות AFM.
      הערה: המשטח הטעון של המגלשה מספק קשירה חזקה לרשת כלי הדם במהלך מדידת AFM.
   3. תייג את השקופית וצייר אזור עגול של 4-5 ס"מ סביב המרכז עם עט הידרופובי כדי למנוע שפיכת מים במהלך השלבים הבאים.
   4. באמצעות פיפטה זכוכית שטופת טריפסין הפוכה, בזהירות להעביר את כלי הדם ברשתית למרכז האזור המסומן.
   5. בעזרת פיפטה P200, הסירו בזהירות כמה שיותר עודפי מים מקצה אחד מבלי לשאוף בטעות את כלי הדם לקצה.
   6. הניחו את המגלשה בארון בטיחות ביולוגית (מכסה מנוע BSL-2) קרוב לצד הקדמי (רשת מסוננת) והניחו לשאריות המים להתאדות.
   7. ברגע שכלי הדם כמעט יבשים, תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (הגדלה פי 4), יש לייבש בזהירות את כלי הדם על ידי הוספה איטית של ddH₂O עם פיפטה P200 בצד אחד של האזור המסומן. הוספת ddH₂O ישירות על כלי הדם גורמת לו להתנתק.
   8. צלם תמונות ניגודיות פאזה של כלי הדם המיובשים בהגדלות של 4x ו- 20x כדי להבטיח שיש לו שלמות מבנית טובה והוא פרוש כראוי (לא מתקפל על עצמו) ומחובר למגלשת זכוכית, שהם קריטריונים חיוניים למדידת קשיחות AFM אמינה.

2. קבלת מטריצה תת-אנדותל מתרביות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית (REC) (ימים 1-17)

הערה: פרוטוקול זה, הותאם מ- Beacham et al.¹⁵ ודווח במחקרים אחרונים ^4,5,6, מתאר תרבית REC על כיסויי זכוכית מותאמים, ולאחר מכן דה-צלולריזציה כדי לקבל מטריצה תת-אנדותל למדידת קשיחות AFM עוקבת.

1. הכנת כיסויי זכוכית מצופים ג'לטין וציפוי תאים (יום 1)
   הערה: בצע את ציפוי הג'לטין ואת שלבי השטיפה הבאים של ^PBS++ במכסה מנוע של תרבית רקמה לפני המעבר למכסה אדים כימי לשלבי הטיפול הבאים בגלוטאראלדהיד ובאתנולמין.
   1. מניחים כיסוי זכוכית עגול אחד בקוטר 12 מ"מ לכל באר של צלחת סטרילית בת 24 בארות ומוסיפים 500 μL של ג'לטין סטרילי 0.2% (w/v) שחומם מראש (מדולל ב-PBS המכיל סידן ומגנזיום; PBS⁺⁺) לכל באר המכילה כיסוי. לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   2. שאפו את תמיסת הג'לטין, שטפו את החלקות פעם אחת עם ^PBS++ סטרילי, והצליבו את הג'לטין המצופה על ידי הוספת 500 μL של 1% (v/v) גלוטראלדהיד למשך 30 דקות ב-RT.
   3. יש לאסוף ולסלק כראוי (בהתאם להנחיות המוסדיות) את תמיסת הגלוטראלדהיד לפני שטיפת החלקות עם ^PBS++ למשך 5 דקות על שייקר אורביטלי במהירות 100 סל"ד ב-RT. חזור על שלב שטיפה זה 5 פעמים. במהלך שלוש השטיפות הראשונות, הרימו את הכיסויים באמצעות פינצטה סטרילית כדי לאפשר שטיפה יסודית של הגלוטראלדהיד. כל כמות שיורית יכולה להפחית את כדאיות התא.
   4. הוסף 800 μL של אתנולמין 1M לכיסוי הצולב-ג'לטין למשך 30 דקות ב- RT כדי להרוות את כל שאריות הגלוטאראלדהיד בבאר.
   5. יש לאסוף ולסלק כראוי (בהתאם להנחיות המוסדיות) את תמיסת האתנולמין ולשטוף את הכיסויים 5 פעמים עם ^PBS++ למשך 5 דקות על שייקר אורביטלי ב-100 סל"ד ב-RT. במהלך שלוש השטיפות הראשונות, הרימו את הכיסויים באמצעות פינצטה סטרילית כדי לאפשר שטיפה יסודית של האתנולמין. כל כמות שיורית יכולה להפחית את כדאיות התא.
   6. הכיסויים הצולבים מוכנים כעת לציפוי תאים.
      הערה: למרות שאנו לוחצים תאים באופן שגרתי מיד לאחר הכנת הכיסוי, ייתכן שיהיה כדאי להשוות ציפוי תאים על כיסויי ג'לטין מוצלבים המאוחסנים ב- ^PBS++ ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים.
   7. בתנאים סטריליים בתרבית רקמה, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הרשתית (RECs) ב-500 מיקרוליטר בינוני/באר בצפיפות המשיגה 100% מפגש תוך 24 שעות, כפי שאושר במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
      הערה: חשוב להגיע למפגש תוך 24 שעות, שכן שתיית REC המתקבלת תגדיל את יכולתם של תאים להפריש מטריצה (עיין בשלב הבא). מניסיוננו עם RECs אנושיים, צפיפות ציפוי של 4 x 10⁴ תאים/ס"מ² מספיקה כדי להגיע למפגש תוך 24 שעות. עם זאת, מכיוון שגודל ה-REC משתנה בהתאם למינים (למשל, RECs של עכברים קטנים משמעותית), ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות הציפוי הראשונית.
2. ייצור מטריצה תת-אנדותל על ידי תרבית REC (יום 2-16)
   1. לאחר שהתאים מגיעים למפגש (~ 24 שעות), החלף את מדיום התרבית בתווך טרי בתוספת חומצה אסקורבית מסוננת סטרילית (ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל).
      הערה: כל טיפול REC עם גורמי סיכון למחלות (למשל, גלוקוז גבוה, תוצרי גליקציה מתקדמים וכו ') או חומרים פרמקולוגיים יכול להתחיל עכשיו, יחד עם טיפול בחומצה אסקורבית.
   2. החליפו את מדיום התרבית עם תוספת חומצה אסקורבית אחת ליומיים למשך 15 יום.
      הערה: חומצה אסקורבית אינה יציבה בתמיסה. הכינו תמיסת מלאי 100X טרייה פעם ביומיים לתוספת בינונית.
3. דה-צלולריזציה של תרביות REC כדי לקבל את המטריצה התת-אנדותל (יום 16)
   1. לאחר 15 יום של טיפול בחומצה אסקורבית, הסירו את המדיום ושטפו את התאים עם PBS נטול סידן/מגנזיום.
   2. נטרל את תרביות REC על ידי הוספת 250 μL/לכל באר של חיץ דה-צלולריזציה חם (20 mM אמוניום הידרוקסיד ו-0.5% Triton X-100 ב-PBS) למשך ~2-3 דקות. אשר את הסרת התאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (הגדלה פי 10).
   3. הסר בעדינות את מאגר הדה-צלולריזציה מבלי להפריע למטריצה התת-אנדותל המופרשת על ידי REC והוסף 0.5 מ"ל PBS לכל באר.
      הערה: כדי להבטיח שהמטריצה התת-אנדותלית לא תתנתק במהלך שלב זה ושלבי השטיפה הבאים, בצע שטיפה עדינה רק עם פיפטה P1000. אין לבצע שאיפת ואקום.
   4. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי לייצב את המטריצה המופרשת על ידי REC.
4. טיפול DNase במטריצה תת-אנדותל לסילוק פסולת תאית (יום 17)
   1. שטפו את המטריצה התת-אנדותל משלב 2.3.4 עם 800 מיקרוליטר של PBS/באר.
   2. הסר בעדינות את PBS ודגר על המטריצה עם 200 μL של DNase I נטול RNase (30 K יחידות) ב 37 ° C למשך 30 דקות כדי להסיר את כל עקבות הפסולת התאית. בדוק את יעילות הטיפול ב- DNase על ידי חיפוש זהיר אחר פסולת תאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
   3. הסר בעדינות את תמיסת DNase I ושטוף את המטריצה התת-אנדותל פעמיים עם 800 μL של PBS/well.
   4. בדקו שהמטריצה התת-אנדותל הסיבית בקנה מידה מאקרו נראית תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (הגדלה של פי 10). הדמיה של סיבי מטריצה ננומטריים עדינים יותר דורשת סריקה טופוגרפית AFM או הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של חלבוני מטריצה בעלי תווית חיסונית בהגדלה של פי 100.
   5. השתמש מיד במטריצה תת-אנדותל טרייה (לא קבועה) למדידת קשיחות AFM.
   6. לאחר מדידת AFM, יש לתקן דגימות מטריצה עם 1% (v/v) paraformaldehyde (15 דקות בטמפרטורת החדר) ולאחסן בטמפרטורה של 4°C לצורך תיוג חיסוני עם נוגדנים כנגד חלבוני מטריצה תת-אנדותליים ו/או אנזימי crosslinking.

3. מדידת קשיחות AFM

הערה: פרוטוקול זה, שהותאם ממדריך למשתמש סטנדרטי של AFM ודווח במחקרים אחרונים ^4,5, מפרט את הרכישה והניתוח של נתוני קשיחות מנימי הרשתית וממטריצה תת-אנדותלית באמצעות תוכנת AFM וניתוח נתונים. למרות שהשלבים המתוארים להלן מבוססים על מודל ספציפי של AFM (ראה טבלת חומרים), העקרונות הבסיסיים ישימים בדרך כלל לכל דגמי AFM.

1. בחירת בדיקה Cantilever
   הערה: דגימות ביולוגיות רכות דורשות מיכלים רכים שיכולים להתכופף עם כניסת הדגימה בזמן שמידות הבדיקה נבחרות כך שיתאימו למידות הדגימה.
   1. למדידת קשיחות של כלי רשתית עכבר בקוטר 5-8 מיקרומטר, השתמש בבדיקה מסוג 1 μm רדיוס cantilever עם קבוע קפיץ (k) של 0.2-0.3 N/m. למדידת קשיחות של מטריצה תת-אנדותל המורכבת מסיבים ננומטריים, השתמש בבדיקה של רדיוס 70 ננומטר עם קבוע קפיץ (k) של 0.06-0.1 N/m.
2. הרכבה של קנטיליבר
   1. במחשב ה-AFM, פתח את התוכנה השולטת ביחידת ה-AFM ואת המצלמה המחוברת למיקרוסקופ ניגודיות פאזה המשמש להמחשת המזנון והדגימה.
   2. קבע את מחזיק השען על מעמד ההחתלה והרכיב את המגן שנבחר על המחזיק באמצעות מלקחיים של שען תחת סטריאוסקופ מבלי לגרום נזק פיזי למחזן. הדקו את הבורג על המחזיק כדי לאבטח את המזנון.
   3. הניחו ונעלו את מחזיק המגן על ראש ה-AFM המונח על המעמד.
   4. באמצעות פונקציית מנוע השלבים בתוכנת AFM, משוך את ראש ה-AFM לנקודה הגבוהה ביותר והגדר מיקום זה כנקודת אפס בתוכנה. שלב זה מונע מכלי ה-AFM לפגוע בטעות בשלב הדגימה בעת הרכבת ראש ה-AFM (השלב הבא).
   5. הרימו בזהירות את ראש ה-AFM מהמעמד שלו והרכיבו אותו על במת הדגימה של AFM על ידי הנחת הרגליים בחריצים המתאימים.
3. יישור לייזר
   הערה: יישור הלייזר הראשוני מתבצע ללא כל דגימה (כלומר, במצב אוויר) מכיוון שהוא מבטיח יישור מדויק יותר של קרן הלייזר על קצה הלייזר (על ידי מניעת שבירת לייזר בנוזל). עם זאת, מכיוון שדגימות ביולוגיות שקועות בתווך בעל מקדם שבירה שונה מזה של האוויר, חשוב ליישר מחדש את הלייזר בתווך לפני מדידת הנוקשות.
   1. ליישור לייזר באוויר, מקם את ראש ה-AFM על במת הדגימה והשתמש במטרה של 10x ובמצלמה המחוברת כדי להציג את המגן על הצג במצב חי. לייזר אינפרא אדום מוסתר מעיני המשתמש אך גלוי עם מצלמת CCD.
   2. בחר את הפונקציה Contact Mode Force Spectroscopy בתוכנה ופתח את החלון שכותרתו יישור לייזר.
   3. באמצעות שני הברגים המסומנים כלייזר רוחבי על ראש ה-AFM, מקדו את קרן הלייזר על הפתח כך שערך ה-SUM בחלון יישור הלייזר הוא הגבוה ביותר. כדי להשיג זאת, מקדו את הלייזר במרכז הקנטיליבר או סביבו.
   4. באמצעות ברגי הכוונון של הגלאי, כוונן את הגלאי כך שנקודת הלייזר תהיה במרכז חלון יישור הלייזר.
   5. באמצעות בורג כוונון המראה, כוונן את המראה כדי להבטיח שערך SUM יהיה בערך הגבוה ביותר האפשרי.
      הערה: ערך SUM גבוה מבטיח הערכה רגישה ומדויקת של קשיחות המדגם. לפיכך, יש לבצע הן את שלבי יישור הלייזר והן את שלבי התאמת המראה כדי להשיג את ערך הסכום הגבוה ביותר.
   6. לאחר מכן, ליישור לייזר בנוזל, הוסיפו את מדיום התרבית הרצוי בצלחת והרכיבו אותו בחוזקה על הבמה כדי למנוע רטט או סחף, מה שיוצר ממצאי מדידה במהלך הזחת הדגימה.
   7. תוך כדי התבוננות בהזנת המצלמה החיה הממוקדת בקנטיליבר, הורידו אותו לתוך הנוזל באמצעות פונקציית מנוע השלבים.
   8. חזור על שלבים 3.3.4 ו- 3.3.5 כדי להבטיח שערך SUM יישאר הגבוה ביותר ושנקודת הלייזר תהיה במרכז חלון יישור הלייזר.
4. כיול קבוע קפיץ הקפיצים
   הערה: למרות שגשושיות Cantilever מגיעות עם קבוע קפיץ מכויל על-ידי היצרן (k), מומלץ לאמת באופן עצמאי את ערכו (בנוזל) לפני תחילת המדידה. השתמשו במשטח זכוכית נקי שממזער את האינטראקציות בין הגשושית לבין משטח הזכוכית.
   1. כוח הסטנקופוינט המופעל על ידי הקנטיל קובע את הסטת הלייזר המרבית מהקנטליבר המותרת לכניסת כוח. הגדר אותו בתחילה על 1.5 V. אם הקנטיל אינו מתקרב בכוח נתון זה, הגדל אותו בהדרגה עד שהוא יוזח פנימה את הדגימה ויוצר עקומת הזחת כוח.
   2. אורך Z מציין את המרחק המרבי שבו ה-z-piezo נסוג לאחר שהקנטיל הגיע לנקודת ההתחלה במהלך הזחת הדגימה. אורך Z צריך להיות לפחות מספיק כדי להבטיח שהבדיקה תיפרד בצורה נקייה מהדגימה. לכיול קבוע קפיץ על משטח זכוכית, קבעו את אורך Z על 1 מיקרומטר.
   3. מהירות Z מתייחסת למהירות שבה z-piezo מזיז את הקנטיל אנכית כלפי מטה לכיוון הדגימה במהלך הזחת כוח. זה צריך להיות אופטימלי כי מהירות נמוכה מאוד יהיה בעיקר ללכוד את ההתנהגות צמיג של הדגימה, בעוד מהירות גבוהה מאוד יהיה בעיקר ללכוד את ההתנהגות האלסטית. המהירות האופטימלית צפויה ללכוד את האופי הוויסקו-אלסטי האמיתי של דגימות ביולוגיות. הגדר את מהירות Z ל- 2 מיקרומטר לשנייה עבור הדגימות הביולוגיות הוויסקו-אלסטיות.
   4. גובה היעד בטווח Z מציין את המרחק המשוער מהמדגם שבו מונח z-piezo לאחר מדידת עקומת כוח ולפני מעבר למיקום אחר בדגימה. גובה היעד של טווח Z צריך להיות גדול מהגובה של תכונות הדגימה. הגדר גובה יעד בטווח Z של 7.5 מיקרומטר.
   5. באמצעות הפונקציה Step Motor , קרב את הקנטיל די קרוב למשטח הדגימה (אם לשפוט לפי המיקוד בתמונת ניגודיות הפאזה בהגדלה של 10x) לפני בחירת הפונקציה Approach בחלון ספקטרוסקופיית הכוח של מצב מגע כדי להוריד את הקנטליבר במרווחים קטנים יותר של 15 מיקרומטר.
   6. לחץ על Acquisition כדי ללכוד עקומת כוח.
   7. בחר את עקומת הכוח, פתח אותה בחלון מנהל הכיול ובחר מצב מבוסס איש קשר במקטע השיטה.
   8. בעזרת הפונקציה Select-fit Range , בחרו ב-Cantilever Retraction Curve להתאמת עקומה ליניארית. לאחר מכן, סמן את תיבת הסימון רגישות כדי להמיר את יחידת הכוח מ- V ל- N.
   9. הרימו את הנוזל ב-100-200 מיקרומטר ובחרו בפונקציית הרעש התרמי . שוב, באמצעות Select Fit Range, התאם את עקומת פעמון הרעש התרמי עם עקומת לורנץ. לאחר התאמת העקומה, בחר בתיבה קבוע קפיץ (k). ודא שקבוע הקפיץ (k) קרוב לערך היצרן ורשום אותו להתייחסות עתידית. לאחר הכיול, היחידה עבור setpoint תשתנה מ- mV ל- nN.
      הערה: רעש תרמי הוא התדר הטבעי של המזנון בטמפרטורה מסוימת. נדרש תיקון לרעש תרמי למדידה מדויקת של קבוע הקפיץ.
5. רכישת עקומות כוח-מרחק
   1. מקם את הדגימה המותקנת בשקופית (כלי דם ברשתית או מטריצה תת-אנדותלית) על במת AFM ובחר ספקטרוסקופיית כוח במצב מגע באזור הניסוי של התוכנה.
   2. הגדר את כוח נקודת המוצא על 0.5 nN ולחץ על גישה, שהוא גבוה משמעותית מהסטייה התרמית של בדיקות SAA-SPH 1 μm ו- PFQNM-LC-A 70 nm cantilever, מה שמבטיח גישה חלקה לכיוון הדגימה.
   3. לאחר שהקנטיליבר זיהה את פני השטח וחזר לגובה יעד המנוחה שלו, הגדר את נקודת הקבע על 0.2 nN עבור הגשושית הנוקשה יותר SAA-SPH 1 μm cantilever או 0.1 nN עבור הגשושית PFQNM-LC-A 70 nm cantilever הרכה יותר. כוונון נקודת הגדרה זה מבטיח שקצוות קשיחים ורכים כאחד יתכופפו בקלות במהלך כניסת הדגימה (עיין בסעיף 3.1).
   4. הגדר את אורך Z ב~2.5 מיקרומטר כדי להבטיח הפרדה נקייה של הגשושית מדגימות ביולוגיות במהלך נסיגה (עיין בשלב 3.4.2) ומהירות Z ב- 2 מיקרומטר לשנייה (עיין בשלב 3.4.3).
   5. באמצעות ברגי הבמה על במת AFM, מקם בזהירות את הגשושית במיקום הרצוי על הדגימה.
      הערה: מכיוון שנימים לא תמיד מתפשטים שטוחים על המגלשה, בטוח למשוך את המגן עוד 10-20 מיקרומטר מגובה יעד המנוחה שלו לפני הזזת הבמה.
   6. לחץ על גישה כדי לקרב תחילה את הקנטיל לדגימה ולאחר מכן לחץ על רכוש כדי ללכוד את עקומות הכוח עבור המיקומים הרצויים. שמור את כל עקומות הכוח לניתוח.
6. ניתוח נתונים
   1. פתח את עקומת הכוח בתוכנת עיבוד הנתונים.
   2. בחר את Retraction Force Curve לניתוח נתונים (בדומה לשלב 3.4.8).
   3. באמצעות פונקציית החלקת הנתונים, החלק את עקומת הכוח באמצעות מסנן גאוס כדי להסיר את הרעש הלא רצוי בנתונים שנרכשו.
   4. באמצעות פונקציית החיסור 'קו בסיס', התאם את ערך השיפוע והגודל של חלק הבסיס (ללא מגע) של עקומת הכוח לאפס.
   5. לחץ על הפונקציה Contact Point כדי להביא באופן אוטומטי את נקודת המגע של עקומת הכוח לקואורדינטות (0,0) בצירי X ו- Y.
   6. באמצעות הפונקציה Vertical Tip Position , חשב את המיקום האנכי בפועל של הקנטיל על ציר Y על-ידי תיקון עבור כל כניסת דגימה.
   7. בעקומת הכוח המעובד, החילו את פונקציית Elasticity Fit על ידי בחירת צורת הקצה והרדיוס (בהתבסס על הגשושית שנבחרה), ולאחר מכן התאמת עקומת כוח באמצעות מודל הרץ/סנדון.
      1. אם כניסת מטריצה ברדיוס של 70 ננומטר עולה על 70 ננומטר, כפי שקורה בדרך כלל, בחר את צורת קצה הפרבולואיד . למדידת קשיחות נימית, הזחת הדגימה על ידי בדיקת רדיוס 1 מיקרומטר לעולם אינה עולה על 1 מיקרומטר, לכן בחר את צורת קצה הכדור . יתר על כן, אם נקודת המגע של העקומה המותאמת אינה חופפת לנקודת המגע של עקומת הפסילה בפועל, בחר בתיבת הסימון הזזה עקומה .
   8. שים לב ושמור את הערך של מודולוס של יאנג (קשיחות).

תוצאות

נימי רשתית עכבר
מדידת קשיחות AFM של נימי רשתית מבודדים כוללת שלבי טיפול בדגימה שעלולים לפגוע בשלמותם המכנוסטרוקטורלית. כדי למנוע זאת ובכך להבטיח את ההיתכנות, האמינות והשחזור של מדידות AFM, העיניים המצוירות קבועות ב-5% פורמלין למשך הלילה ב-4°C לפני בידוד כלי הדם. פרוטוקול קיבוע מתון ?...

Discussion

AFM נמצא בשימוש נרחב כדי למדוד שינויים הקשורים למחלות בנוקשות של כלי דם גדולים יותר, כגון אבי העורקים ועורקים¹⁶. ממצאים אלה סייעו לבסס את תפקידה של מכנוביולוגיה אנדותל בסיבוכים קרדיווסקולריים כגון טרשת עורקים¹⁷. בהתבסס על ממצאים אלה, התחלנו לחקור את התפקיד שלא היה מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective