A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

Abstract

ניוון נימי הרשתית הוא סימן היכר קליני של השלבים המוקדמים של רטינופתיה סוכרתית (DR). המחקרים האחרונים שלנו גילו כי התקשות נימי רשתית הנגרמת על ידי סוכרת ממלאת תפקיד סיבתי מכריע שלא היה מוכר בעבר בניוון מתווך דלקת של נימי הרשתית. העלייה בנוקשות נימי הרשתית נובעת מביטוי יתר של ליזיל אוקסידאז, אנזים המצליב ומקשיח את המטריצה התת-אנדותלית. מכיוון שהתמודדות עם DR בשלב מוקדם צפויה למנוע או להאט את התקדמות DR ואובדן ראייה נלווה, מטריצה תת-אנדותלית ונוקשות נימים מייצגים מטרות טיפוליות רלוונטיות וחדשניות לניהול DR מוקדם. יתר על כן, מדידה ישירה של נוקשות נימי הרשתית יכולה לשמש כשלב אימות פרה-קליני מכריע לפיתוח טכניקות הדמיה חדשות להערכה לא פולשנית של נוקשות נימי הרשתית בבעלי חיים ובבני אדם. בהתחשב בהשקפה זו, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט למדידת בידוד ונוקשות של נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

Introduction

נימי רשתית חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ברשתית ותפקוד הראייה. ואכן, הניוון שלהם בסוכרת מוקדמת מעורב מאוד בהתפתחות סיבוכים מסכני ראייה של רטינופתיה סוכרתית (DR), מצב כלי דם המשפיע על כמעט 40% מכלל האנשים עם סוכרת1. דלקת כלי דם תורמת באופן משמעותי לניוון נימי הרשתית ב- DR. מחקרים קודמים הדגימו תפקיד חשוב לרמזים מולקולריים וביוכימיים חריגים בדלקת כלי דם ברשתיתהנגרמת על ידי סוכרת 2,3. עם זאת, עבודה חדשה הציגה פרדיגמה חדשה לפתוגנזה של DR המזהה התקשות נימי רשתית כגורם מכריע אך לא מוכר בעבר של דלקת כלי דם ברשתית וניוון 4,5,6

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים וטיפול (IACUC; פרוטוקול מספר ARC-2020-030) באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (OLAW institution animal welfare assurance number A3196-01). הפרוטוקול הבא בוצע באמצעות נימי רשתית שבודדו מעכברי C57BL/6J זכרים בוגרים (בני 20 שבועות) במשקל ~25 גרם (עכברים סוכרתיים) ו~32 גרם (עכברים שאינם סוכרתיים; מעבדת ג'קסון).

1. בידוד נימי רשתית עכבר למדידת קשיחות AFM (ימים 1-4)

הערה: פרוטוקול זה, שדווח במחקר4 שנערך לאחרונה, מפרט את ....

תוצאות

נימי רשתית עכבר
מדידת קשיחות AFM של נימי רשתית מבודדים כוללת שלבי טיפול בדגימה שעלולים לפגוע בשלמותם המכנוסטרוקטורלית. כדי למנוע זאת ובכך להבטיח את ההיתכנות, האמינות והשחזור של מדידות AFM, העיניים המצוירות קבועות ב-5% פורמלין למשך הלילה ב-4°C לפני בידוד כלי הדם. פרוטוקול קיבוע מתון ?.......

Discussion

AFM נמצא בשימוש נרחב כדי למדוד שינויים הקשורים למחלות בנוקשות של כלי דם גדולים יותר, כגון אבי העורקים ועורקים16. ממצאים אלה סייעו לבסס את תפקידה של מכנוביולוגיה אנדותל בסיבוכים קרדיווסקולריים כגון טרשת עורקים17. בהתבסס על ממצאים אלה, התחלנו לחקור את התפקיד שלא היה מ.......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי R01EY028242 המענקים של המכון הלאומי לעיניים / NIH (לק.ג.), מחקר למניעת עיוורון / פרס Catalyst של הקרן הבינלאומית לחקר הרשתית עבור גישות מחקר חדשניות עבור AMD (לק.ג.), יוזמת סטיבן ריאן למחקר מקולרי (RIMR) מענק מיוחד מקרן W.M. Keck (למכון העיניים דוהני), ומלגת אורסולה מנדל ומלגת גיוון של המועצה לתארים מתקדמים של UCLA (ל- I.S.T). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, Inc. למחלקה לרפואת עיניים באוניברסיטת UCLA. התוכן במאמר זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filterMerck MilliporeSLGVM33RSLow Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesiumCorning20-031-CVFinal concentration 1X, pH 7.4
12-well plateFalcon Corning353043
15 mL centrifuge tubeCorning430791Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringeBD302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipetteFisherBrand13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture DishFalcon Corning353002
6-well plateFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL PenScientific Device Laboratory9804-02
Blade holderX-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10Bard-Parker371110
Dental WaxElectron Microscopy Sciences50-949-027
Dissecting microscopeAm-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%Millipore SigmaHT501128-4LFinal concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissueKimtech Science34133
Micro spatulaFine Science Tools10089-11
Orbital ShakerLab GeniusSK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  TweezerTed Pella, Inc.5667
Phase contrast microscopeNikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetLabconco302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mLEppendorf22363352
StereoscopeAmScopeSM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mmFisherBrand1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology GradeVWRE553-500MLpH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture GradeVWRVWRV0458-25G10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology GradeCorning46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBSCorning20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesiumThermo Fisher Scientific14040-117pH 7.4
Ammonium hydroxideSigma-Aldrich338818
Ascorbic AcidSigma-AldrichA4034
Collagen IV antibodyNovus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
EthanolamineSigma-Aldrich398136
Fibronectin antibodySigma-AldrichF6140
FluoromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
GelatinSigma-AldrichG1890
Glass coverslips (12mm)Fisher12-541-000
GlutaraldehydeElectron microscopy Sciences16220
Human retinal endothelial cells (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 mediumCorning15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)Cell BiologicsC57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Scientific BP151-100
TrypsinGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM Measurement
1 µm ProbeBrukerSAA-SPH-1UMA 19 micron tall hemispherical probe with 1
micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probeBrukerPFQNM-LC-V2A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,
 Spring constant 0.1N/m
 cameraXCAM familyToupcam1080P HDMI
Desktop to run the cameraAsusAsus desktopIntel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslipCellvisD29-14-1.5-N29mm glass bottom dish with
 14 mm micro-well
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscopeZeissAxiovert 200Inverted microscope with 10X objective

References

  1. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751 (2017).
  2. Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved