Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

요약

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

초록

망막 모세혈관 변성은 당뇨병성 망막병증(DR)의 초기 단계의 임상적 특징입니다. 우리의 최근 연구는 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직이 염증 매개 망막 모세혈관 퇴행에 중요하고 이전에는 인식되지 않았던 인과 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 망막 모세혈관 경직도의 증가는 내피하 기질을 가교하고 경직시키는 효소인 lysyl oxidase의 과발현으로 인해 발생합니다. DR을 조기에 치료하면 DR 진행 및 관련 시력 상실을 예방하거나 늦출 것으로 예상되기 때문에 내피하 기질 및 모세혈관 강성은 조기 DR 관리를 위한 적절하고 새로운 치료 목표를 나타냅니다. 또한 망막 모세혈관 강성의 직접 측정은 동물 및 인간 피험자의 망막 모세관 강성의 비침습적 평가를 위한 새로운 이미징 기술 개발을 위한 중요한 전임상 검증 단계 역할을 할 수 있습니다. 이러한 관점을 염두에 두고, 여기에서는 원자력 현미경을 사용하여 생쥐 망막 모세혈관 및 내피하 기질의 분리 및 강성 측정을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

망막 모세혈관은 망막 항상성과 시각 기능을 유지하는 데 필수적입니다. 실제로, 초기 당뇨병에서의 퇴행은 당뇨병 환자의 거의 40%에 영향을 미치는 미세혈관 질환인 당뇨병성 망막병증(DR)의 시력을 위협하는 합병증의 발병과 밀접한 관련이 있습니다¹. 혈관 염증은 DR에서 망막 모세혈관 변성에 크게 기여합니다. 과거 연구에서는 당뇨병으로 인한 망막 혈관 염증에서 비정상적인 분자 및 생화학적 신호에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다 ^2,3. 그러나 최근의 연구는 DR 발병에 대한 새로운 패러다임을 도입하여 망막 모세혈관 경직이 망막 혈관 염증 및 퇴행의 중요하지만 이전에는 인식되지 않은 결정 요인으로 식별되었습니다 ^4,5,6.

특히, 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직도의 증가는 망막 내피 세포(ECs)에서 콜라겐 교차결합 효소인 라이실 산화효소(LOX)의 상향 조절에 의해 발생하며, 이로 인해 내피하 기질(기저^막)이 경직됩니다^4,5,6. 매트릭스 경직(matrix stiffening)은 차례로 (기계적 상호성으로 인해) 위에 놓인 망막 EC를 경직시켜 망막 모세관 강성의 전반적인 증가를 초래한다⁴. 결정적으로, 이러한 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경화만으로도 망막 EC 활성화와 염증 매개 EC 사멸을 촉진할 수 있습니다. 망막 EC 결손의 이러한 기계적 조절은 기계적 단서가 생화학적 신호로 변환되어 생물학적 반응을 생성하는 과정인 내피 내피 기계 전달의 변화에 기인할 수 있습니다 ^7,8,9. 중요한 것은 변경된 EC 기계적 단서와 내피하 기질 구조가 조기 연령 관련 황반 변성(AMD)과 관련된 맥락막 혈관 변성과 관련이 있다는 것입니다.10,11,12 이는 퇴행성 망막 질환에서 혈관 기계생물학의 광범위한 의미를 입증합니다.

특히 당뇨병 초기에 망막 모세혈관 경직이 발생하는데, 이는 망막 염증의 발병과 일치합니다. 따라서 망막 모세혈관 경직성의 증가는 DR의 치료 표적 및 조기 진단 마커 역할을 할 수 있습니다. 이를 위해서는 망막 모세혈관과 내피하 기질의 신뢰할 수 있고 직접적인 강성 측정을 얻는 것이 중요합니다. 이는 세포, 세포외 기질 및 조직의 강성을 직접 측정할 수 있는 독특하고 민감하며 정확하고 신뢰할 수 있는 기술을 제공하는 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 달성할 수 있습니다¹³. AFM은 샘플에 미세(나노뉴턴 수준) 압입력을 가하며, 강성에 따라 압흔 AFM 캔틸레버가 구부러지는 정도가 결정되며, 샘플이 뻣뻣할수록 캔틸레버가 더 많이 구부러지고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 우리는 배양된 내피 세포, 내피하 기질 및 분리된 마우스 망막 모세혈관 4,5,6,11,12의 강성을 측정하기 위해 AFM을 광범위하게 사용했습니다. 이러한 AFM 강성 측정은 내피 역학이 DR 및 AMD 발병의 주요 결정 요인임을 확인하는 데 도움이 되었습니다. 시력 연구에서 기계생물학의 범위를 넓히는 데 도움이 되도록 여기에서는 분리된 마우스 망막 모세혈관 및 내피하 기질의 강성 측정에 AFM을 사용하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 안과 및 안과 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서에 따라 수행되었으며 University of California, Los Angeles의 Institutional Animal and Care Use Committees(IACUC; 프로토콜 번호 ARC-2020-030)의 승인을 받았습니다(OLAW 기관 동물 복지 보증 번호 A3196-01). 다음 프로토콜은 ~25g(당뇨병성 마우스) 및 ~32g(비당뇨병 마우스) 무게의 성인(20주) 남성 C57BL/6J 마우스에서 분리한 망막 모세혈관을 사용하여 수행되었습니다. Jackson Laboratory)에 등록되어 있습니다.

1. AFM 경직도 측정을 위한 마우스 망막 모세혈관 분리(1-4일)

참고: 최근 연구⁴에서 보고된 이 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 경미한 고정, 망막 분리 및 트립신 소화, 그리고 AFM 강성 측정을 위해 현미경 슬라이드에 결과 망막 혈관을 장착하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

1. 적출 및 경미한 고정(1일차)
   1. 이산화탄소에 노출된 쥐를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 한 후 안구 뒤에 마이크로 집게를 삽입하고 근육 부착물을 잡고 시신경을 절단할 수 있는 마이크로 집게를 너무 꽉 조이지 않도록 조심스럽게 눈을 빼냅니다.
   2. 가벼운 고정을 위해 적출된 눈을 PBS의 5%(v/v) 포르말린에 4°C에서 24시간 동안 놓습니다.
      참고: 경험⁴에 따르면, 고정되지 않았거나 약간 고정된 눈은 AFM 샘플 준비 및 강성 측정 중에 단편화되는 깨지기 쉬운 모세혈관을 생성합니다.
2. 망막 격리(2일차)
   1. 해부 현미경 아래의 왁스 종이 조각에 고정 눈을 놓습니다. 다음으로 미세 겸자를 사용하여 안구 뒤쪽에 붙어있는 근육과 시신경의 잔재를 잡고 각막이 한쪽을 향하도록 눈의 방향을 맞춥니다(그림 1).
   2. 수술용 칼날을 사용하여 림버스(각막-공막 접합부)에서 1-2mm 뒤쪽과 평행하게 절개합니다. 다음으로, 마이크로 집게로 눈을 제자리에 고정하면서 칼날로 아래쪽으로 힘을 가하고 눈의 앞쪽 부분이 뒤쪽 끝에서 완전히 분리될 때까지 계속 누릅니다(그림 1). 앞쪽 분절과 수정체를 폐기합니다. 망막 손상을 유발할 수 있으므로 앞뒤로 톱질하지 마십시오.
   3. 후방 분절(공막, 맥락막 및 망막)을 PBS(pH 7.4)로 채워진 6cm 접시에 옮깁니다.
   4. 마이크로 주걱을 사용함과 동시에 마이크로 겸자로 시신경을 부드럽게 잡고 망막을 퍼냅니다. 모세관이 분리될 때까지 4°C에서 PBS가 포함된 2mL 미세 원심분리기 튜브에 망막을 보관합니다.
       
3. 망막 헹굼
   1. 하나의 망막을 헹구려면 12웰 플레이트의 6웰을 1mL의 이중 증류 H₂O(ddH₂O)로 채웁니다. 다음으로, 역파스퇴르 피펫을 사용하여 2mL 미세 원심분리 튜브의 망막을 첫 번째 웰로 옮깁니다.
   2. 실온(RT)에서 120RPM으로 30분 동안 궤도 셰이커의 망막을 헹굽니다.
   3. P1000 피펫을 사용하여 망막에 인접한 물을 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 망막에 물을 불어넣어 부드러운 교반을 일으킵니다.
   4. 거꾸로 된 유리 피펫을 사용하여 망막을 두 번째 웰로 옮기고 1.3.2 및 1.3.3 단계를 4 번 반복하고 각 헹굼은 새로운(ddH₂O 함유) 웰에서 수행됩니다.
   5. 마지막으로, 망막을 여섯 번째 웰로 옮기고 트립신 소화 중 혈관에서 망막 신경교세포의 분리를 용이하게 하기 위해 100RPM으로 설정된 안와 쉐이커에서 RT에서 밤새(O/N) 헹굽니다.
4. 망막 트립신 소화(3일차)
   1. Tris buffer(pH 10, 250 M)에 트립신 1:250 분말을 용해시켜 0.1%(w/v) 트립신 용액을 준비합니다. 트립신 용해도를 확인하기 어렵게 만드는 기포 형성을 최소화하기 위해 원뿔형 튜브를 여러 번 뒤집어 부드럽게 혼합합니다.
   2. 10% 트립신 용액을 37°C 수조에서 10-15분 동안 평형화합니다. 트립신 분말이 완전히 용해되면 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
   3. 12웰 플레이트에 여과된 10% 트립신 용액의 2mL/웰/망막을 추가합니다. 인접한 웰에 추가 트립신 용액을 추가합니다(후속 단계를 위해 유리 피펫 벽을 평형화하기 위해).
   4. 6-웰 플레이트의 3개의 웰에 3mL의 ddH₂O를 추가합니다(이 3개의 웰을 하나의 망막에 전용).
   5. 15mL 원뿔형 튜브에 P200 팁을 삽입한 후 여과된 10% 트립신 용액 4mL를 추가합니다. 이 원뿔형 튜브를 37°C 수조로 옮겨 팁을 트립신에 2-3분 동안 담가두면 후반 단계에서 망막이 팁 벽에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다.
   6. 망막의 O/N 헹굼 후(1.3.5단계부터) P1000 피펫을 사용하여 망막에 인접한 물을 위아래로 조심스럽게 피펫팅하고 망막에 물을 분사하여 부드러운 교반을 일으킵니다.
   7. 역유리 피펫을 사용하여 헹굼한 망막을 12웰 플레이트의 트립신 함유 웰로 옮깁니다(1.4.3단계에서). 트립신 용액이 크게 희석되지 않도록 망막이 최소한의 잔류 ddH₂O로 전달되는지 확인하십시오. 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.
   8. 트립신에 적신 P200 팁(단계 1.4.5)을 시신경 영역의 중앙에 놓고 전체 혈관 네트워크를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 비혈관 조직¹⁴을 해리합니다.
   9. 트립신으로 미리 헹구어진 도립 유리 피펫을 사용하여(트립신을 위아래로 5회 피펫팅하여) 망막 혈관을 6웰 플레이트의 첫 번째 ddH₂O 함유 웰로 옮깁니다(1.4.4단계에서).
   10. 플레이트를 소용돌이치게 하고 역트립신으로 헹군 유리 피펫을 사용하여 혈관을 위아래로 피펫팅하여 잔류 비혈관 조직을 제거합니다.
   11. 유리 피펫을 사용하여 망막 혈관을 6-웰 플레이트의 두 번째 ddH2O 함유 웰로 옮기고 AFM 강성 측정을 위해 슬라이드에 장착할 때까지 4°C에서 보관합니다.
       참고: 수화된 망막 혈관(PBS)은 4°C에서 최대 2주 동안 구조적으로 손상되지 않습니다. 그러나 일상적인 강성 측정은 새로 분리된 모세관에서 수행해야 합니다.
5. AFM 경직도 측정을 위한 망막 혈관 장착(4일)
   1. 역트립신 헹굼 유리 피펫을 사용하여 망막 혈관 구조를 6웰 플레이트의 세 번째 ddH₂O 함유 웰로 이송하여 잔류 트립신 용액을 제거합니다.
   2. AFM 강성 측정을 위해 혈관 네트워크를 장착하는 데 사용할 하전 표면 현미경 슬라이드를 철저히 청소합니다(ddH₂O 및 와이퍼 조직 사용).
      알림: 슬라이드의 하전 표면은 AFM 측정 중에 혈관 네트워크에 강력한 결합을 제공합니다.
   3. 슬라이드에 레이블을 지정하고 다음 단계에서 물이 엎질러지지 않도록 소수성 펜으로 중앙 주위에 4-5cm의 원형 영역을 그립니다.
   4. 역트립신으로 헹군 유리 피펫을 사용하여 망막 혈관을 표시된 영역의 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다.
   5. P200 피펫을 사용하여 혈관 조직을 팁으로 흡입하지 않고 한쪽 가장자리에서 가능한 한 많은 과도한 물을 조심스럽게 제거합니다.
   6. 슬라이드를 전면(여과된 메쉬)에 가까운 생물안전 캐비닛(BSL-2 후드)에 놓고 잔류 물을 증발시킵니다.
   7. 혈관이 거의 건조되면 위상차 현미경(4배 확대)으로 표시된 영역의 한쪽에 P200 피펫으로 ddH₂O를 천천히 추가하여 혈관에 조심스럽게 수분을 보충합니다. ddH₂O를 혈관에 직접 첨가하면 혈관이 분리됩니다.
   8. 4x 및 20x 배율에서 재수화된 혈관의 위상차 이미지를 촬영하여 구조적 무결성이 우수하고 적절하게 펼쳐지며(자체적으로 접히지 않음) 신뢰할 수 있는 AFM 강성 측정을 위한 필수 기준인 유리 슬라이드에 부착되었는지 확인합니다.

2. 망막 미세혈관 내피 세포(REC) 배양에서 내피하 기질 얻기(1-17일)

참고: 이 프로토콜은 Beacham et al.에서 채택되었습니다.¹⁵ 및 최근 연구 ^4,5,6에서 보고된 내용은 변형된 유리 커버슬립에 대한 REC 배양과 후속 AFM 강성 측정을 위한 내피하 매트릭스를 얻기 위한 탈세포화에 대해 설명합니다.

1. 젤라틴 코팅된 유리 커버슬립 및 셀 도금의 준비(1일차)
   참고: 후속 글루타르알데히드 및 에탄올아민 처리 단계를 위해 화학 흄 후드로 이동하기 전에 조직 배양 후드에서 젤라틴 코팅 및 후속 PBS⁺⁺ 헹굼 단계를 수행합니다.
   1. 멸균 24웰 플레이트의 웰당 하나의 오토클레이브 12mm 직경 원형 유리 커버슬립을 놓고 500μL의 예열된 멸균 0.2%(w/v) 젤라틴(칼슘과 마그네슘을 함유한 PBS에 희석)을 추가합니다. PBS⁺⁺)를 커버슬립이 포함된 각 웰에 추가합니다. 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 젤라틴 용액을 흡인하고 멸균 PBS⁺⁺로 커버슬립을 한 번 헹구고 코팅된 젤라틴을 RT에서 30분 동안 1%(v/v) 글루타르알데히드 500μL를 첨가하여 가교합니다.
   3. RT에서 100RPM의 궤도 셰이커에서 5분 동안 PBS⁺⁺ 로 커버슬립을 헹구기 전에 글루타르알데히드 용액을 수집하고 적절하게 폐기합니다. 이 헹굼 단계를 5번 반복합니다. 처음 세 번 헹구는 동안 멸균 핀셋을 사용하여 커버슬립을 들어 올려 글루타르알데히드를 철저히 헹굴 수 있도록 합니다. 잔류량은 세포 생존율을 감소시킬 수 있습니다.
   4. 800μL의 1M 에탄올아민을 RT에서 30분 동안 젤라틴 가교 커버슬립에 추가하여 웰에 남아 있는 글루타르알데히드의 흔적을 제거합니다.
   5. 에탄올아민 용액을 수집하여 적절하게 폐기하고(기관 지침에 따라) RT에서 100rpm의 궤도 셰이커에서 PBS⁺⁺ 로 커버슬립을 5분 동안 헹굽니다. 처음 세 번 헹구는 동안 멸균 핀셋을 사용하여 커버슬립을 들어 올려 에탄올아민을 철저히 헹굴 수 있도록 합니다. 잔류량은 세포 생존율을 감소시킬 수 있습니다.
   6. 가교 커버슬립은 이제 셀 도금할 준비가 되었습니다.
      참고: 우리는 일반적으로 커버슬립 준비 직후 셀을 플레이트하지만, 4°C에서 1-2일 동안 PBS⁺⁺ 에 보관된 가교 젤라틴 커버슬립의 셀 플레이팅을 비교하는 것이 좋습니다.
   7. 조직 배양 후드의 무균 조건에서 위상차 현미경으로 확인된 바와 같이 24시간 이내에 100% 합류를 달성하는 밀도로 500μL 배지/웰에 망막 미세혈관 내피 세포(REC)를 플레이트합니다.
      참고: 결과적으로 REC 정지가 매트릭스를 분비하는 세포의 능력을 증가시키기 때문에 24시간 이내에 합류점에 도달하는 것이 중요합니다(다음 단계 참조). 인간 REC에 대한 우리의 경험에 따르면 4 x 10⁴ cells/cm² 의 도금 밀도는 24시간 이내에 합류점에 도달하기에 충분합니다. 그러나 REC 크기가 종에 따라 다르기 때문에(예: 마우스 REC가 훨씬 더 작음) 초기 도금 밀도를 최적화해야 할 수 있습니다.
2. REC 배양에 의한 내피하 기질 생성(2-16일)
   1. 세포가 합류(~24시간)에 도달한 후 배양 배지를 멸균 여과된 아스코르브산(최종 농도 200μg/mL)이 보충된 새 배지로 교체합니다.
      참고: 질병 위험 요인(예: 고포도당, 고급 당화 최종 산물 등) 또는 약리학적 제제를 사용한 모든 REC 치료는 아스코르브산 치료와 함께 지금 시작할 수 있습니다.
   2. 아스코르브산이 보충된 배양 배지를 15일 동안 격일로 교체합니다.
      알림: 아스코르브산은 용액에서 불안정합니다. 중간 정도의 보충제를 위해 이틀에 한 번씩 새로운 100X 스톡 용액을 준비하십시오.
3. 내피하 기질을 얻기 위한 REC 배양의 탈세포화(16일)
   1. 아스코르브산 처리 15일 후 배지를 제거하고 칼슘/마그네슘이 없는 PBS로 세포를 헹굽니다.
   2. 따뜻한 탈세포화 완충액(20mM 수산화암모늄 및 PBS의 0.5% Triton X-100)당 250μL를 ~2-3분 동안 추가하여 REC 배양을 탈세포화합니다. 위상차 현미경(10배 확대)으로 세포 제거를 확인합니다.
   3. REC 분비된 내피하 기질을 방해하지 않고 탈세포화 완충액을 부드럽게 제거하고 각 웰에 0.5mL의 PBS를 추가합니다.
      알림: 이 헹굼 단계와 후속 헹굼 단계에서 내피하 기질이 분리되지 않도록 하려면 P1000 피펫으로만 부드럽게 헹굼을 수행하십시오. 진공 흡입을 수행하지 마십시오.
   4. REC 분비 매트릭스를 안정화하기 위해 플레이트를 4°C에서 밤새 보관합니다.
4. 세포 파편을 제거하기 위한 내피하 기질의 DNase 처리(17일)
   1. 2.3.4단계에서 800μL의 PBS/웰로 내피하 기질을 헹굽니다.
   2. PBS를 부드럽게 제거하고 37°C에서 30분 동안 200μL의 RNase-free DNase I(30K 단위)로 매트릭스를 배양하여 세포 파편의 모든 흔적을 제거합니다. 위상차 현미경으로 세포 파편을 주의 깊게 찾아 DNase 처리의 효율성을 확인합니다.
   3. DNase I 용액을 부드럽게 제거하고 800μL의 PBS/well로 내피하 기질을 두 번 헹굽니다.
   4. 거대적 크기의 섬유질하피 기질이 위상차 현미경(10배 확대)에서 보이는지 확인합니다. 더 미세한 나노 스케일 매트릭스 섬유를 시각화하려면 100x 배율에서 면역 표지된 매트릭스 단백질의 AFM 지형 스캐닝 또는 고해상도 컨포칼 이미징이 필요합니다.
   5. AFM 강성 측정을 위해 새로운(고정되지 않은) 내피하 매트릭스를 즉시 사용하십시오.
   6. AFM 측정 후 매트릭스 샘플을 1%(v/v) 파라포름알데히드(실온에서 15분)로 고정하고 4°C에서 보관하여 내피하 기질 단백질 및/또는 가교 효소에 대한 항체로 면역 라벨링합니다.

3. AFM 강성 측정

참고: 이 프로토콜은 표준 AFM 사용자 매뉴얼에서 채택되고 최근 연구 ^4,5에서 보고된 것으로, AFM 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 망막 모세혈관 및 내피하 기질에서 강성 데이터를 획득하고 분석하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 아래에 설명된 단계는 AFM의 특정 모델을 기반으로 하지만(재료 표 참조) 기본 원칙은 일반적으로 모든 AFM 모델에 적용됩니다.

1. 캔틸레버 프로브 선택
   참고: 부드러운 생물학적 샘플에는 샘플 압흔 시 구부러질 수 있는 부드러운 캔틸레버가 필요하며, 프로브 치수는 샘플의 치수와 일치하도록 선택됩니다.
   1. 5-8 μm 직경의 마우스 망막 혈관의 강성 측정은 스프링 상수(k)가 0.2-0.3 N/m인 1 μm 반경 캔틸레버 프로브를 사용합니다. 나노 크기 섬유로 구성된 내피하 기질의 강성 측정을 위해 스프링 상수(k)가 0.06-0.1N/m인 70nm 반경 캔틸레버 프로브를 사용하십시오.
2. 캔틸레버 장착
   1. AFM 컴퓨터에서 캔틸레버와 샘플을 시각화하는 데 사용되는 위상차 현미경에 연결된 AFM 장치와 카메라를 제어하는 소프트웨어를 엽니다.
   2. 캔틸레버 홀더를 캔틸레버 교환대에 고정하고 캔틸레버를 물리적으로 손상시키지 않고 스테레오스코프 아래에서 워치메이커 집게를 사용하여 선택한 캔틸레버를 홀더에 장착합니다. 홀더의 나사를 조여 캔틸레버를 고정합니다.
   3. 캔틸레버 홀더를 스탠드에 놓인 AFM 헤드에 놓고 잠급니다.
   4. AFM 소프트웨어의 스텝 모터 기능을 사용하여 AFM 헤드를 가장 높은 지점으로 빼내고 해당 위치를 소프트웨어에서 포인트 0으로 설정합니다. 이 단계는 AFM 헤드를 장착하는 동안 AFM 캔틸레버가 실수로 샘플에 부딪히는 것을 방지합니다.tage(다음 단계).
   5. 스탠드에서 AFM 헤드를 조심스럽게 들어 올려 AFM 샘플에 장착합니다.tage는 다리를 해당 슬롯에 배치합니다.
3. 레이저 정렬
   참고: 초기 레이저 정렬은 캔틸레버 팁에서 레이저 빔의 보다 정확한 정렬을 보장하기 때문에(액체에서 레이저 굴절을 방지함으로써) 샘플 없이(즉, 공기 모드에서) 수행됩니다. 그러나 생물학적 샘플은 공기와 굴절률이 다른 매체에 담그기 때문에 강성을 측정하기 전에 매체에서 레이저를 재정렬하는 것이 중요합니다.
   1. 공기 중 레이저 정렬을 위해 AFM 헤드를 샘플 스테이지에 놓고 10x 대물렌즈 및 부착된 카메라를 사용하여 라이브 모드에서 모니터의 캔틸레버를 시각화합니다. 적외선 레이저는 사용자의 시야에서 숨겨져 있지만 CCD 카메라로 볼 수 있습니다.
   2. 소프트웨어에서 Contact Mode Force Spectroscopy 기능을 선택하고 Laser alignment라는 제목의 창을 엽니다.
   3. AFM 헤드에 레이저 측면으로 표시된 두 개의 나사를 사용하여 레이저 정렬 창의 SUM 값이 가장 높도록 캔틸레버에 레이저 빔의 초점을 맞춥니다. 이를 달성하려면 캔틸레버의 중심 또는 그 주변에 레이저를 집중시킵니다.
   4. Detector 조정 나사를 사용하여 레이저 스폿이 레이저 정렬 창의 중앙에 오도록 광검출기를 조정합니다.
   5. 미러 조정 나사를 사용하여 미러를 조정하여 SUM 값이 가능한 가장 높은 값이 되도록 합니다.
      참고: SUM 값이 높으면 시료 강성에 대한 민감하고 정확한 평가가 보장됩니다. 따라서 가장 높은 SUM 값을 얻기 위해 레이저 정렬 및 미러 조정 단계를 모두 수행해야 합니다.
   6. 다음으로, 액체에서 레이저 정렬을 위해 원하는 배양 배지를 접시에 추가하고 스테이지에 단단히 장착하여 시료 압입 중에 측정 아티팩트가 생성되는 진동이나 드리프트를 방지합니다.
   7. 캔틸레버에 초점을 맞춘 라이브 카메라 피드를 보면서 스텝 모터 기능을 사용하여 캔틸레버를 액체 속으로 내립니다.
   8. 3.3.4단계와 3.3.5단계를 반복하여 SUM 값이 가장 높게 유지되고 레이저 스폿이 레이저 정렬 창의 중앙에 오도록 합니다.
4. 캔틸레버 스프링 상수의 교정
   알림: 캔틸레버 프로브는 제조업체에서 보정한 스프링 상수(k)와 함께 제공되지만 측정을 시작하기 전에 해당 값(액체)을 독립적으로 확인하는 것이 좋습니다. 캔틸레버 프로브와 유리 표면 사이의 상호 작용을 최소화하는 깨끗한 유리 표면을 사용하십시오.
   1. 캔틸레버에 의해 가해지는 설정값은 힘 압입에 허용되는 캔틸레버로부터의 최대 레이저 편향을 설정합니다. 처음에는 1.5V로 설정하십시오. 캔틸레버가 이 주어진 설정값 힘에 접근하지 못하면 샘플이 움푹 들어가고 힘 압입 곡선이 생성될 때까지 점진적으로 증가시킵니다.
   2. Z 길이는 캔틸레버가 샘플 압입 중 설정점에 도달한 후 z-피에조가 철회되는 최대 거리를 나타냅니다. Z 길이는 최소한 캔틸레버 프로브가 샘플에서 깨끗하게 분리될 수 있을 만큼 충분해야 합니다. 유리 표면의 스프링 상수를 보정하려면 Z 길이를 1μm로 설정합니다.
   3. Z 속도는 힘 압입 중에 z-피에조가 캔틸레버를 샘플 쪽으로 수직으로 아래로 이동하는 속도를 나타냅니다. 매우 낮은 속도는 주로 샘플의 점성 거동을 포착하는 반면 매우 빠른 속도는 주로 탄성 거동을 포착하기 때문에 최적화해야 합니다. 최적의 속도는 생물학적 샘플의 진정한 점탄성 특성을 포착할 것으로 예상됩니다. 점탄성 생물학적 샘플에 대해 Z 속도를 2μm/s로 설정합니다.
   4. Z 범위의 목표 높이는 힘 곡선을 측정한 후 샘플의 다른 위치로 이동하기 전에 z-피에조가 놓이는 샘플로부터의 대략적인 거리를 나타냅니다. Z Range 대상 높이는 샘플 피처의 높이보다 커야 합니다. Z 범위의 목표 높이를 7.5μm로 설정합니다.
   5. 스텝 모터 기능을 사용하여 캔틸레버를 시료 표면에 상당히 가깝게 가져온 다음(10배 배율에서 위상차 이미지의 초점으로 판단) 접촉 모드 힘 분광법 창에서 접근 기능을 선택하여 캔틸레버를 15μm의 작은 증분으로 내려갑니다.
   6. Acquire를 클릭하여 힘 곡선을 캡처합니다.
   7. Force Curve를 선택하고, 캘리브레이션 매니저 창에서 연 다음, Method 섹션에서 Contact-based Mode를 선택합니다.
   8. Select-fit Range 기능을 사용하여 선형 곡선 맞춤을 위한 캔틸레버 수축 곡선을 선택합니다. 그런 다음 감도 체크 상자를 선택하여 힘 단위를 V에서 N으로 변환합니다.
   9. 액체에서 캔틸레버를 100-200μm 들어 올리고 열 소음 기능을 선택합니다. 다시 Select Fit Range를 사용하여 열 노이즈 벨 곡선을 로렌츠 곡선에 맞춥니다. 곡선 맞춤 후 스프링 상수(k) 상자를 선택합니다. 스프링 상수(k)가 제조업체의 값에 가까운지 확인하고 나중에 참조할 수 있도록 기록해 둡니다. 보정 후 설정값의 단위가 mV에서 nN으로 변경됩니다.
      알림: 열 소음은 특정 온도에서 캔틸레버의 고유 주파수입니다. 정확한 스프링 상수 측정을 위해 열 소음을 보정해야 합니다.
5. 힘-거리 곡선 획득
   1. 슬라이드 장착 샘플(망막 혈관 또는 내피하 기질)을 AFM 스테이지에 놓고 소프트웨어의 실험 섹션에서 Contact Mode Force Spectroscopy 를 선택합니다.
   2. 설정점 하중을 0.5nN으로 설정하고 SAA-SPH 1μm 및 PFQNM-LC-A 70nm 캔틸레버 프로브의 열 변형보다 훨씬 높은 접근 방식을 클릭하여 시료에 대한 부드러운 캔틸레버 접근을 보장합니다.
   3. 캔틸레버가 표면을 감지하고 정지 대상 높이로 돌아간 후 더 단단한 SAA-SPH 1μm 캔틸레버 프로브의 경우 0.2nN, 더 부드러운 PFQNM-LC-A 70nm 캔틸레버 프로브의 경우 0.1nN으로 설정값을 설정합니다. 이 설정값 조정은 뻣뻣한 캔틸레버와 부드러운 캔틸레버가 모두 샘플 압흔 중에 쉽게 구부러지도록 합니다(섹션 3.1 참조).
   4. Z 길이를 ~2.5μm로 설정하여 수축 중(3.4.2단계 참조) 생물학적 샘플에서 캔틸레버 프로브를 깨끗하게 분리하고 Z 속도를 2μm/s(3.4.3단계 참조)로 설정합니다.
   5. AFM 스테이지의 스테이지 나사를 사용하여 캔틸레버 프로브를 샘플의 원하는 위치에 조심스럽게 배치합니다.
      알림: 모세관이 슬라이드에서 항상 평평하게 퍼지는 것은 아니기 때문에 스테이지를 이동하기 전에 캔틸레버를 정지 목표 높이에서 10-20μm 더 빼내는 것이 안전합니다.
   6. Approach(접근)를 클릭하여 먼저 캔틸레버를 샘플에 더 가깝게 가져온 다음 Acquire(획득)를 클릭하여 원하는 위치에 대한 힘 곡선을 캡처합니다. 해석을 위해 모든 하중 곡선을 저장합니다.
6. 데이터 분석
   1. 데이터 처리 소프트웨어에서 힘 곡선을 엽니다.
   2. 데이터 분석을 위해 수축력 곡선 을 선택합니다(3.4.8단계와 유사).
   3. 데이터 스무딩 기능을 사용하여 가우스 필터로 힘 곡선을 매끄럽게 하여 수집된 데이터에서 원치 않는 노이즈를 제거합니다.
   4. 기준선 빼기 기능을 사용하여 힘 곡선의 (비접촉) 기준선 부분의 경사 값과 크기를 0으로 조정합니다.
   5. Contact Point 기능을 클릭하면 힘 곡선의 접점을 X축과 Y축의 (0,0) 좌표로 자동으로 가져옵니다.
   6. Vertical Tip Position 기능을 사용하여 샘플 압흔을 보정하여 Y축에서 캔틸레버의 실제 수직 위치를 계산합니다.
   7. 처리된 힘 곡선에서 먼저 팁 모양과 반경(선택한 캔틸레버 프로브 기준)을 선택하여 Elasticity Fit 기능을 적용한 다음 Hertz/Sneddon 모델을 사용하여 힘 곡선 피팅을 적용합니다.
      1. 70 nm 반경 프로브에 의한 매트릭스 압흔이 70 nm를 초과하는 경우(일반적으로 경우) 파라볼로이드 팁 형상을 선택합니다. 모세관 강성 측정의 경우 1 μm 반경 프로브에 의한 샘플 압흔은 1 μm를 초과하지 않으므로 Sphere tip shape를 선택하십시오. 또한 피팅된 곡선의 접점이 실제 후퇴 곡선의 접점과 일치하지 않는 경우 곡선 이동(Shift Curve ) 확인란을 선택합니다.
   8. Young's modulus (stiffness)의 값을 기록하고 저장합니다.

결과

생쥐 망막 모세혈관
분리된 망막 모세혈관의 AFM 강성 측정에는 기계구조적 무결성을 잠재적으로 손상시킬 수 있는 시료 처리 단계가 포함됩니다. 이를 방지하여 AFM 측정의 타당성, 신뢰성 및 재현성을 보장하기 위해 적출된 눈은 혈관 격리 전에 4°C에서 하룻밤 동안 5% 포르말린으로 고정됩니다. 포르말린 농도 감소, 낮은 고정 온도, 제한된 고정 시간 및 각막 천자가 없는 이 가벼운...

토론

AFM은 대동맥 및 동맥과 같은 더 큰 혈관의 경직도에서 질병 관련 변화를 측정하는 데 널리 사용되어 왔습니다¹⁶. 이러한 발견은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)과 같은 심혈관 합병증에서 내피 기계생물학(endothelial mechanobiology)의 역할을 규명하는 데 도움이 되었다¹⁷. 이러한 연구 결과를 바탕으로 우리는 초기 DR에서 망막 미세혈관 병변의 발달에 있어 이전에는 인?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective