Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

요약

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

초록

망막 모세혈관 변성은 당뇨병성 망막병증(DR)의 초기 단계의 임상적 특징입니다. 우리의 최근 연구는 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직이 염증 매개 망막 모세혈관 퇴행에 중요하고 이전에는 인식되지 않았던 인과 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 망막 모세혈관 경직도의 증가는 내피하 기질을 가교하고 경직시키는 효소인 lysyl oxidase의 과발현으로 인해 발생합니다. DR을 조기에 치료하면 DR 진행 및 관련 시력 상실을 예방하거나 늦출 것으로 예상되기 때문에 내피하 기질 및 모세혈관 강성은 조기 DR 관리를 위한 적절하고 새로운 치료 목표를 나타냅니다. 또한 망막 모세혈관 강성의 직접 측정은 동물 및 인간 피험자의 망막 모세관 강성의 비침습적 평가를 위한 새로운 이미징 기술 개발을 위한 중요한 전임상 검증 단계 역할을 할 수 있습니다. 이러한 관점을 염두에 두고, 여기에서는 원자력 현미경을 사용하여 생쥐 망막 모세혈관 및 내피하 기질의 분리 및 강성 측정을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

망막 모세혈관은 망막 항상성과 시각 기능을 유지하는 데 필수적입니다. 실제로, 초기 당뇨병에서의 퇴행은 당뇨병 환자의 거의 40%에 영향을 미치는 미세혈관 질환인 당뇨병성 망막병증(DR)의 시력을 위협하는 합병증의 발병과 밀접한 관련이 있습니다¹. 혈관 염증은 DR에서 망막 모세혈관 변성에 크게 기여합니다. 과거 연구에서는 당뇨병으로 인한 망막 혈관 염증에서 비정상적인 분자 및 생화학적 신호에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다 ^2,3. 그러나 최근의 연구는 DR 발병에 대한 새로운 패러다임을 도입하여 망막 모세혈관 경직이 망막 혈관 염증 및 퇴행의 중요하지만 이전에는 인식되지 않은 결정 요인으로 식별되었습니다 ^4,5,6.

특히, 당뇨병으로 인한 망막 모세혈관 경직도의 증가는 망막 내피 세포(ECs)에서 콜라겐 교차결합 효소인 라이실 산화효소(LOX)의 상향 조절에 의해 발생하며, 이로 ....

프로토콜

모든 동물 시술은 안과 및 안과 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서에 따라 수행되었으며 University of California, Los Angeles의 Institutional Animal and Care Use Committees(IACUC; 프로토콜 번호 ARC-2020-030)의 승인을 받았습니다(OLAW 기관 동물 복지 보증 번호 A3196-01). 다음 프로토콜은 ~25g(당뇨병성 마우스) 및 ~32g(비당뇨병 마우스) 무게의 성인(20주) 남성 C57BL/6J 마우스에서 분리한 망막 모세혈관을 사용하여 수행되었습니다. Jackson Laboratory)에 등록되어 있습니다.

1. AFM 경직도 측정을 위한 마우스 망막 모세혈관 분리(1-4일)

참고: 최근 연구⁴에서 보고된 이 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 경미한 고정, 망막 분리 및 트립신 소화, 그리고 AFM 강성 측정을 위해 현미경 슬라이드에 결과 망막 혈관을 장착하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

1. 적출 및 경미한 고정(1일차)<....

토론

AFM은 대동맥 및 동맥과 같은 더 큰 혈관의 경직도에서 질병 관련 변화를 측정하는 데 널리 사용되어 왔습니다¹⁶. 이러한 발견은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)과 같은 심혈관 합병증에서 내피 기계생물학(endothelial mechanobiology)의 역할을 규명하는 데 도움이 되었다¹⁷. 이러한 연구 결과를 바탕으로 우리는 초기 DR에서 망막 미세혈관 병변의 발달에 있어 이전에는 인?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective