原子間力顕微鏡を用いた剛性測定のためのマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離

要約

私たちは最近、糖尿病に関連する網膜機能障害の新しいパラダイムとして網膜毛細血管硬化を特定しました。このプロトコルでは、網膜内皮培養物からマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスを単離する手順を詳しく説明し、続いて原子間力顕微鏡を用いた剛性測定技術について説明します。

要約

網膜毛細血管変性症は、糖尿病性網膜症 (DR) の初期段階の臨床的特徴です。私たちの最近の研究では、糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化が、炎症媒介性網膜毛細血管の変性において、これまで認識されていなかった重要な因果関係を果たしていることが明らかになりました。網膜毛細血管の硬直の増加は、内皮下マトリックスを架橋して硬化させる酵素であるリシルオキシダーゼの過剰発現に起因します。DRを早期に解決することで、DRの進行やそれに伴う視力低下の予防や遅延が期待されるため、内皮下マトリックスや毛細血管の硬直は、早期のDR管理に適切で新しい治療標的となります。さらに、網膜毛細血管の硬さを直接測定することは、動物およびヒトの被験者における網膜毛細血管の硬直を非侵襲的に評価するための新しいイメージング技術を開発するための重要な前臨床検証ステップとして役立ちます。この見解を念頭に置いて、ここでは、原子間力顕微鏡を使用したマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離および剛性測定のための詳細なプロトコルを提供します。

概要

網膜毛細血管は、網膜の恒常性と視覚機能を維持するために不可欠です。実際、初期の糖尿病における彼らの変性は、糖尿病患者の全個人のほぼ40%が罹患している微小血管疾患である糖尿病性網膜症(DR)の視力を脅かす合併症の発症に強く関与しています¹。過去の研究では、糖尿病誘発性網膜血管炎症における異常な分子的および生化学的手がかりに重要な役割があることが実証されています^2,3。しかし、最近の研究では、網膜毛細血管硬化が網膜血管の炎症と変性の決定要因でありながらこれまで認識されていなかった重要であると特定するDR病因の新しいパラダイムが導入されました^4,5,6。

具体的には、糖尿病による網膜毛細血管硬化の増加は、網膜内皮細胞(EC)におけるコラーゲン架橋酵素リシルオキシダーゼ(LOX)のアップレギュレーションによって引き起こされ、それが内皮下マトリックス(基底^膜)を硬化させます^4,5,6。マトリックスの硬化は、次に、その上にある網膜ECを硬化させ(機械的相互性による)、したがって、網膜毛細血管の剛性^{4の全体的な増加}をもたらす。重要なことは、この糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化だけで、網膜ECの活性化と炎症媒介性EC死を促進することができるということです。この網膜EC欠損の機械的調節は、内皮メカノトランスダクションの変化、すなわち機械的な手がかりが生化学的シグナルに変換されて^{生物学的応答を}生じさせるプロセスに起因する可能性がある^7,8,9。重要なことに、ECの機械的手がかりの変化と内皮下マトリックス構造の変化は、早期の加齢性黄斑変性症(AMD)に関連する脈絡膜血管変性にも関与しており10,11,12、これは、変性網膜疾患における血管メカノバイオロジーのより広範な意味を証明しています。

特に、網膜毛細血管硬化は糖尿病の早期に起こり、これは網膜炎症の発症と一致します。したがって、網膜毛細血管の硬直の増加は、DRの治療標的および早期診断マーカーの両方として機能する可能性があります。この目的のためには、網膜毛細血管と内皮下マトリックスの信頼性の高い直接的な剛性測定を得ることが重要です。これは、細胞、細胞外マトリックス、および組織の剛性を直接測定するための、ユニークで高感度、正確、かつ信頼性の高い技術を提供する原子間力顕微鏡(AFM)を使用することによって達成することができる¹³。AFMは、サンプルに微小(ナノニュートンレベル)のインデンテーション力を加え、その剛性によってインデントAFMカンチレバーの曲がり具合が決まります。サンプルが硬いほど、カンチレバーは曲がり、その逆も同様です。私たちは、培養内皮細胞、内皮下マトリックス、および単離されたマウス網膜毛細血管^4,5,6,11,12の剛性を測定するために、AFMを広く使用してきました。これらのAFM剛性測定は、DRおよびAMDの病因の主要な決定要因として内皮メカノバイオロジーを特定するのに役立ちました。視覚研究におけるメカノバイオロジーの範囲を広げるために、ここでは、単離されたマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの剛性測定にAFMを使用するためのステップバイステップのガイドを提供します。

プロトコル

すべての動物処置は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に従って実施され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物およびケア委員会(IACUC;プロトコル番号ARC-2020-030)(OLAW機関動物福祉保証番号A3196-01)によって承認されました。以下のプロトコルは、体重が ~25 g (糖尿病マウス) および ~32 g (非糖尿病マウス;ジャクソン研究所)。

1. AFM剛性測定のためのマウス網膜毛細血管の単離(1-4日目)

注:このプロトコルは、最近の研究⁴で報告され、マウスの眼の摘出術と軽度の固定、網膜の分離、トリプシン消化、およびその後のAFM剛性測定のための顕微鏡スライド上の結果として生じる網膜血管系の取り付けについて詳しく説明します。

1. 摘出術と軽度の固定(1日目)
   1. マウスを二酸化炭素曝露とそれに続く頸部脱臼で安楽死させた後、眼球の後ろに微小鉗子を挿入し、筋肉の付着部をつかみ、視神経を切断する可能性のある微小鉗子を強くつまむことなく慎重に眼を引き出します。
   2. 除核した眼をPBS中の5%(v / v)ホルマリンに4°Cで24時間置き、軽度の固定を行います。.
      注:経験⁴に基づくと、固定されていない、またはより穏やかに固定された目は、AFMサンプルの準備と剛性測定中に断片化する壊れやすい毛細血管を生成します。
2. 網膜分離(2日目)
   1. 固定された目をパラフィン紙の上に置きます 解剖顕微鏡下。次に、マイクロ鉗子を用いて、後眼の外側に付着した筋肉と視神経の残骸を持ち、角膜が片側を向くように眼を向けます(図1)。
   2. 外科用ブレードを使用して、輪部(角膜-強膜接合部)の後ろに平行に1〜2 mm切開します。次に、マイクロ鉗子で目を固定しながら、ブレードで下向きの力を加え、目の前部が後端から完全に分離するまで押し続けます(図1)。前眼部とレンズを捨てます。網膜の損傷を引き起こす可能性があるため、前後に見ないでください。
   3. 後部セグメント(強膜、脈絡膜、網膜)をPBS(pH 7.4)で満たされた6cmの皿に移します。
   4. マイクロスパチュラを使用し、同時にマイクロ鉗子で視神経を優しく保持し、網膜をすくい取ります。網膜をPBSを含む2mLの微量遠心チューブに4°Cで保存し、毛細血管が分離されるまで保存します。
       
3. レチナールリンス
   1. 1つの網膜をすすぐには、12ウェルプレートの6ウェルに1 mLの再蒸留H₂O(ddH₂O)を充填します。次に、倒立パスツールピペットを使用して、2 mLの微量遠心チューブから網膜を最初のウェルに移します。
   2. 眼窩シェーカーで網膜を120 RPMで室温(RT)で30分間すすぎます。
   3. P1000ピペットを使用して、網膜に隣接して水を慎重に上下にピペットで動かし、網膜に水を吹き付けて穏やかに攪拌します。
   4. 倒立ガラスピペットを使用して、網膜を2番目のウェルに移し、ステップ1.3.2と1.3.3を4回繰り返し、各すすぎは新しい(ddH₂Oを含む)ウェルで行われます。
   5. 最後に、網膜を6番目のウェルに移し、100RPMに設定されたオービタルシェーカーのRTで一晩(O / N)すすぎ、トリプシン消化中の血管からの網膜神経膠細胞の分離を促進します。
4. レチナールトリプシン消化(3日目)
   1. トリプシン 1:250 粉末をトリス緩衝液 (pH 8; 0.1 M) に溶解して、10% (w/v) トリプシン溶液を調製します。円錐管を数回反転させて穏やかに混合し、トリプシンの溶解性を確認するのを難しくする気泡の形成を最小限に抑えます。
   2. 10%トリプシン溶液を37°Cの水浴中で10〜15分間平衡化します。トリプシン粉末が完全に溶解したら、0.2μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。
   3. 12ウェルプレートに、ろ過した10%トリプシン溶液の2 mL/ウェル/網膜を加えます。隣接するウェルにトリプシン溶液を追加します(後続のステップのためにガラスピペットの壁を平衡化するため)。
   4. 6ウェルプレートの3つのウェルに3mLのddH₂Oを添加します(これらの3つのウェルを1つの網膜専用にします)。
   5. 15 mLのコニカルチューブにP200チップを挿入してから、ろ過した10%トリプシン溶液を4 mL加えます。この円錐管を37°C浴に移し、先端をトリプシンに2〜3分間浸すと、後のステップで網膜が先端壁にくっつくのを防ぐことができます。
   6. 網膜のO / Nすすぎ(ステップ1.3.5から)後、P1000ピペットを使用して、網膜に隣接する水を慎重に上下にピペットで動かし、網膜に水を噴射して穏やかに攪拌します。
   7. 倒立ガラスピペットを使用して、すすぎた網膜を12ウェルプレートのトリプシン含有ウェルに移します(ステップ1.4.3から)。トリプシン溶液が大幅に希釈されないように、網膜が最小限の残留ddH₂Oで転写されていることを確認してください。37°Cで3時間インキュベートします。
   8. トリプシンに浸したP200チップ(ステップ1.4.5から)を視神経領域の中央に置き、血管ネットワーク全体を上下に静かにピペットで動かして、非血管組織¹⁴を解離させる。
   9. トリプシンで事前にすすいだ倒立ガラスピペットを使用して(トリプシンを5回上下にピペッティング)、網膜血管系を6ウェルプレートの最初のddH₂O含有ウェルに移します(ステップ1.4.4から)。
   10. プレートを回転させ、逆トリプシンすすぎガラスピペットを使用して血管系を上下にピペットで動かし、残留した非血管組織を除去します。
   11. ガラスピペットを使用して、網膜血管系を6ウェルプレートの2番目のddH2O含有ウェルに移し、AFM剛性測定のためにスライドに取り付けるまで4°Cで保存します。
       注:水和網膜血管系(PBS中)は、4°Cで最大2週間構造的に無傷です。ただし、定期的な剛性測定は、新たに分離された毛細血管から行う必要があります。
5. AFM剛性測定のための網膜血管系の装着(4日目)
   1. 倒立トリプシン洗浄ガラスピペットを使用して、網膜血管系を6ウェルプレートの3番目のddH₂O含有ウェルに移し、残留トリプシン溶液を除去します。
   2. AFM剛性測定のための血管ネットワークの取り付けに使用する帯電表面顕微鏡スライドを(ddH₂Oとワイパー組織を使用して)完全に洗浄します。
      注:スライドの帯電した表面は、AFM測定中に血管ネットワークに強力な結合を提供します。
   3. スライドにラベルを付け、疎水性ペンで中心の周りに4〜5 cmの円形の領域を描き、後続のステップで水がこぼれないようにします。
   4. 逆トリプシンすすぎガラスピペットを使用して、網膜血管系をマークされた領域の中心に慎重に移します。
   5. P200ピペットを使用して、誤って血管系を先端に吸引しないように、片方の端からできるだけ多くの余分な水分を慎重に取り除きます。
   6. スライドを前面(ろ過されたメッシュ)に近いバイオセーフティキャビネット(BSL-2フード)に置き、残留水を蒸発させます。
   7. 血管系がほぼ乾いたら、位相差顕微鏡(4倍倍)で、P200ピペットでddH₂Oをマークされた領域の片側にゆっくりと追加することにより、血管系を慎重に再水和します。ddH₂Oを血管系に直接加えると、血管系が剥離します。
   8. 再水和した血管系の位相コントラスト画像を4倍および20倍の倍率で撮影し、構造的完全性が良好で、信頼性の高いAFM剛性測定に不可欠な基準であるスライドガラスに適切に広がっている(それ自体が折りたたまれていない)ことを確認します。

2. 網膜微小血管内皮細胞(REC)培養物からの内皮下マトリックスの取得(1-17日目)

注:このプロトコルは、Beachamらから適応されています。^図15および最近の研究で報告された^4,5,6は、改質ガラスカバースリップ上でのREC培養、続いて脱細胞化してその後のAFM剛性測定のための内皮下マトリックスを得ることを説明している。

1. ゼラチンコーティングされたガラスカバースリップとセルプレーティングの調製(1日目)
   注:ゼラチンコーティングとその後のPBS ⁺⁺すすぎステップを組織培養フードで実行してから、その後のグルタルアルデヒドとエタノールアミンの処理ステップのために化学ヒュームフードに移動します。
   1. 滅菌24ウェルプレートのウェルごとにオートクレーブ処理した直径12 mmの円形ガラスカバースリップを1枚置き、予熱した滅菌0.2%(w / v)ゼラチン(カルシウムとマグネシウムを含むPBSで希釈)500μLを追加します。PBS⁺⁺)をカバースリップを含む各ウェルに貼り付けます。37°Cで1時間インキュベートします。
   2. ゼラチン溶液を吸引し、滅菌PBS⁺⁺でカバーガラスを一度すすぎ、RTで500μLの1%(v / v)グルタルアルデヒドを30分間加えてコーティングされたゼラチンを架橋します。
   3. RTで100 RPMのオービタルシェーカーでPBS ⁺⁺ でカバーガラスを5分間すすぐ前に、グルタルアルデヒド溶液を収集し、適切に廃棄します(機関のガイドラインに従って)。 このすすぎステップを5回繰り返します。最初の3回のすすぎでは、滅菌ピンセットを使用してカバーガラスを持ち上げ、グルタルアルデヒドを完全にすすぎます。残留量があると、細胞の生存率が低下する可能性があります。
   4. ゼラチン架橋カバースリップに800 μLの1 Mエタノールアミンを室温で30分間加え、ウェルに残っている微量のグルタルアルデヒドをクエンチします。
   5. エタノールアミン溶液を収集して(機関のガイドラインに従って)適切に廃棄し、RTで100rpmのオービタルシェーカーでPBS ⁺⁺ で5分間カバーガラスを5回すすぎます。最初の3回のすすぎでは、滅菌ピンセットを使用してカバーガラスを持ち上げ、エタノールアミンを完全にすすぎます。.残留量があると、細胞の生存率が低下する可能性があります。
   6. 架橋されたカバースリップは、セルめっきの準備が整いました。
      注:カバースリップ調製直後に細胞をプレート化することは一般的ですが、PBS⁺⁺ に4°Cで1〜2日間保存した架橋ゼラチンカバースリップの細胞プレーティングを比較する価値があるかもしれません。
   7. 組織培養フード内の無菌条件下で、500 μLの培地/ウェルで網膜微小血管内皮細胞(REC)を、位相差顕微鏡で確認されたように、24時間以内に100%のコンフルエンスを達成する密度でプレート化します。
      注:結果として生じるREC静止により、細胞がマトリックスを分泌する能力が増加するため、24時間以内にコンフルエンスに到達することが重要です(次のステップを参照)。ヒトRECでの経験では、4 x 10⁴ 細胞/cm² のめっき密度は、24時間以内にコンフルエンスに達するのに十分です。ただし、RECサイズは種によって異なるため(たとえば、マウスRECは大幅に小さい)、初期めっき密度を最適化する必要がある場合があります。
2. REC培養による内皮下マトリックス作製(2-16日目)
   1. 細胞がコンフルエンスに達した後(~24時間)、培地を滅菌ろ過されたアスコルビン酸(最終濃度200 μg/mL)を添加した新鮮な培地と交換します。
      注:病気の危険因子(例:.、高グルコース、進行糖化最終産物など)または薬理学的薬剤によるREC治療は、アスコルビン酸治療とともに今すぐ開始できます。.
   2. アスコルビン酸を添加した培地を15日間、1日おきに交換してください。
      注:アスコルビン酸は溶液中で不安定です。中程度のサプリメントのために、1日おきに新鮮な100倍ストック溶液を準備します。
3. 内皮下マトリックスを得るためのREC培養物の脱細胞化(16日目)
   1. アスコルビン酸治療を15日間行った後、培地を取り出し、カルシウム/マグネシウムを含まないPBSで細胞をすすぎます。
   2. 温かい脱細胞化バッファー(20 mM水酸化アンモニウムと0.5% Triton X-100 in PBS)をウェルあたり250 μL/ウェルで2~3分間添加して、REC培養物を脱細胞化します。位相差顕微鏡(倍率10倍)で細胞の除去を確認します。
   3. REC分泌内皮下マトリックスを乱さずに脱細胞化バッファーを穏やかに除去し、各ウェルに0.5mLのPBSを添加します。
      注:このすすぎステップとその後のすすぎステップで内皮下マトリックスが剥がれないようにするには、P1000ピペットでのみ穏やかなすすぎを行ってください。.真空吸引は行わないでください。
   4. プレートを4°Cで一晩保存し、REC分泌マトリックスを安定させます。
4. 細胞破片を除去するための内皮下マトリックスのDNase処理(17日目)
   1. ステップ 2.3.4 の内皮下マトリックスを 800 μL の PBS/ウェルですすぎます。
   2. PBSを静かに除去し、マトリックスを200 μLのRNaseフリーDNase I(30 Kユニット)と37°Cで30分間インキュベートして、細胞の破片の痕跡をすべて除去します。DNase処理の効率を確認するには、位相差顕微鏡で細胞の破片を注意深く探します。
   3. DNase I溶液を静かに除去し、800 μLのPBS/wellで内皮下マトリックスを2回すすぎます。
   4. マクロスケールの線維性内皮下マトリックスが位相差顕微鏡(10倍倍)で見えることを確認します。より微細なナノスケールのマトリックスファイバーを可視化するには、AFMトポグラフィースキャンまたは免疫標識マトリックスタンパク質の100倍倍率での高分解能共焦点イメージングが必要です。
   5. AFM剛性測定には、新鮮な(固定されていない)内皮下マトリックスをすぐに使用してください。
   6. AFM測定後、マトリックスサンプルを1%(v / v)パラホルムアルデヒドで固定し(室温で15分間)、4°Cで保存して、内皮下マトリックスタンパク質および/または架橋酵素に対する抗体による免疫標識を行います。

3. AFM剛性測定

注:このプロトコルは、標準的なAFMユーザーマニュアルから採用され、最近の研究^4,5で報告されており、AFMおよびデータ分析ソフトウェアを使用して、網膜毛細血管および内皮下マトリックスからの剛性データの取得と分析を詳しく説明しています。以下に概説する手順は、特定のAFMモデルに基づいていますが(資料の表を参照)、基本原理は一般的にすべてのAFMモデルに適用できます。

1. カンチレバープローブの選択
   注:柔らかい生物学的サンプルには、サンプルの寸法に合わせてプローブの寸法が選択されている間、サンプルのくぼみで曲がる可能性のある柔らかいカンチレバーが必要です。
   1. 直径5〜8μmのマウス網膜血管の剛性測定には、スプリング定数(k)が0.2〜0.3N / mの半径1μmのカンチレバープローブを使用します。ナノスケールの繊維で構成された内皮下マトリックスの剛性測定には、ばね定数(k)が0.06-0.1 N / mの半径70 nmのカンチレバープローブを使用します。
2. カンチレバー取り付け
   1. AFMコンピュータで、AFMユニットを制御するソフトウェアと、カンチレバーとサンプルを視覚化するために使用される位相差顕微鏡に取り付けられたカメラを開きます。
   2. カンチレバーホルダーをカンチレバー交換スタンドに固定し、カンチレバーを物理的に損傷することなく、ステレオスコープの下で時計メーカーの鉗子を使用して選択したカンチレバーをホルダーに取り付けます。ホルダーのネジを締めて、カンチレバーを固定します。
   3. スタンドに置かれているAFMヘッドにカンチレバーホルダーを置き、ロックします。
   4. AFMソフトウェアのステップモーター機能を使用して、AFMヘッドを最高点まで引き出し、その位置をソフトウェアでポイントゼロに設定します。このステップにより、AFMヘッドの取り付け中にAFMカンチレバーが誤ってサンプルステージにぶつかるのを防ぎます(次のステップ)。
   5. AFMヘッドをスタンドから慎重に持ち上げ、脚をそれぞれのスロットに配置してAFMサンプルステージに取り付けます。
3. レーザーアライメント
   注:最初のレーザーアライメントは、カンチレバー先端上のレーザービームのより正確なアライメントを保証するため、サンプルなしで(つまり、エアモードで)実行されます(液体中のレーザー屈折を防ぐことにより)。ただし、生体サンプルは空気とは異なる屈折率を持つ媒体に浸漬されるため、剛性測定の前にレーザーを媒体内で再調整することが重要です。
   1. 空中でのレーザーアライメントを行うには、AFMヘッドをサンプルステージに置き、10倍対物レンズと付属のカメラを使用して、ライブモードでモニター上のカンチレバーを視覚化します。赤外線レーザーはユーザーの視界から隠されていますが、CCDカメラで見ることができます。
   2. ソフトウェアで接触モード力分光法機能を選択し、レーザーアライメントというタイトルのウィンドウを開きます。
   3. AFMヘッドのレーザー横方向にマークされた2本のネジを使用して、レーザーアライメントウィンドウのSUM値が最大になるようにレーザービームをカンチレバーに集束させます。これを実現するには、カンチレバーの中心またはその周囲にレーザーを集束させます。
   4. 検出器調整ネジを使用して、レーザースポットがレーザーアライメントウィンドウの中心に来るように光検出器を調整します。
   5. ミラー調整ネジを使用して、ミラーを調整し、SUM値が可能な限り高い値になるようにします。
      注:SUM値が高いと、サンプルの剛性を高感度かつ正確に評価できます。したがって、レーザーアライメントとミラー調整の両方のステップを実行して、最高のSUM値を取得する必要があります。
   6. 次に、液体中でのレーザーアライメントのために、サンプルのインデント中に測定アーチファクトを引き起こす振動やドリフトを防ぐために、必要な培地をディッシュに入れ、ステージにしっかりと取り付けます。
   7. カンチレバーにピントを合わせたライブカメラ映像を見ながら、ステップモーター機能を使って液中に沈めます。
   8. 手順3.3.4と3.3.5を繰り返して、SUM値が最大に保たれ、レーザースポットがレーザーアライメントウィンドウの中心にあることを確認します。
4. カンチレバースプリング定数の校正
   注:カンチレバープローブにはメーカーが校正したスプリング定数(k)が付属していますが、測定を開始する前にその値(液体中)を個別に確認することをお勧めします。カンチレバープローブとガラス表面との間の相互作用を最小限に抑える清潔なガラス表面を使用してください。
   1. カンチレバーによって加えられる設定点の力は、力のインデントに許容されるカンチレバーからの最大レーザーたわみを設定します。最初は 1.5 V に設定します。カンチレバーがこの特定の設定値力で接近できない場合は、サンプルがインデントして力のインデント曲線が生成されるまで、カンチレバーを段階的に増やします。
   2. Z長さは、サンプルのインデンテーション中にカンチレバーが設定値に達した後にZピエゾが引き抜かれる最大距離を示します。Zの長さは、少なくともカンチレバープローブがサンプルからきれいに分離するのに十分な長さである必要があります。ガラス表面のばね定数を校正するには、Z長さを1 μmに設定します。
   3. Z速度とは、力の押し込み中にZピエゾがカンチレバーをサンプルに向かって垂直に下降させる速度を指します。非常に低速は主にサンプルの粘性挙動を捕捉し、非常に高速は主に弾性挙動を捕捉するため、最適化する必要があります。最適な速度は、生物学的サンプルの真の粘弾性特性を捉えることが期待されます。粘弾性生体サンプルのZ速度を2μm/sに設定します。
   4. Z範囲のターゲット高さは、力曲線を測定した後、サンプル上の別の場所に移動する前に、Zピエゾが静止するサンプルからのおおよその距離を示します。Z 範囲のターゲット高さは、サンプル フィーチャの高さよりも大きくする必要があります。Zレンジの目標高さを7.5μmに設定します。
   5. ステップモーター機能を使用して、カンチレバーをサンプル表面にかなり近づけてから(10倍率の位相差画像の焦点から判断)、接触モード力分光ウィンドウでアプローチ機能を選択してカンチレバーを15 μmの小さな増分で下げます。
   6. Acquireをクリックして、フォースカーブをキャプチャします。
   7. フォースカーブを選択してキャリブレーションマネージャーウィンドウで開き、メソッドセクションで接触ベースのモードを選択します。
   8. Select-fit Range 関数を使用して、線形カーブ フィットのカンチレバー リトラクション カーブを選択します。次に、 感度 チェックボックスを使用して、力の単位をVからNに変換します。
   9. 液体中でカンチレバーを100〜200μm持ち上げ、 サーマルノイズ 機能を選択します。再度、[ Select Fit Range] を使用して、熱雑音ベル曲線をローレンツ曲線にフィットさせます。カーブフィット後、 スプリング定数(k) ボックスを選択します。ばね定数(k)がメーカーの値に近いことを確認し、後で参照できるようにメモしておきます。キャリブレーション後、設定値の単位はmVからnNに変わります。
      注:熱雑音は、特定の温度でのカンチレバーの固有振動数です。正確なばね定数測定には、熱雑音の補正が必要です。
5. 力-距離曲線の取得
   1. スライドマウントしたサンプル(網膜血管または内皮下マトリックス)をAFMステージに置き、ソフトウェアの実験セクションで Contact Mode Force Spectroscopy を選択します。
   2. 設定値力を 0.5 nN に設定し、[ アプローチ]をクリックします。これは、SAA-SPH 1 μm および PFQNM-LC-A 70 nm カンチレバープローブの熱たわみよりも大幅に高く、サンプルへのスムーズなカンチレバーアプローチを実現します。
   3. カンチレバーが表面を検出し、静止目標の高さに戻ったら、より硬い SAA-SPH 1 μm カンチレバープローブの場合は 0.2 nN に、より柔らかい PFQNM-LC-A 70 nm カンチレバープローブの場合は 0.1 nN に設定します。このセットポイント調整により、サンプルのインデント中に硬いカンチレバーと柔らかいカンチレバーの両方が容易に曲がるようになります(セクション3.1を参照)。
   4. Z Lengthを~2.5 μmに設定して、リトラクション中(ステップ3.4.2を参照)、Z速度を2 μm/s(ステップ3.4.3を参照)でカンチレバープローブを生物学的サンプルからきれいに分離します。
   5. AFMステージのステージネジを使用して、カンチレバープローブをサンプル上の目的の場所に慎重に配置します。
      注:キャピラリーは常にスライド上に平らに広がるとは限らないため、ステージを移動する前に、カンチレバーを静止目標高さからさらに10〜20μm引き出すのが安全です。
   6. 「アプローチ」をクリックして、まずカンチレバーをサンプルに近づけてから、「取得」をクリックして、目的の位置の力曲線をキャプチャーします。解析のためにすべてのフォースカーブを保存します。
6. データ分析
   1. データ処理ソフトウェアで力曲線を開きます。
   2. データ分析のために Retraction Force Curve を選択します(手順3.4.8と同様)。
   3. データ平滑化機能を使用して、ガウスフィルターで力曲線を平滑化し、取得したデータの不要なノイズを除去します。
   4. 基線減算機能を使用して、力曲線の(非接触)基線部分の傾きと大きさの値をゼロに調整します。
   5. Contact Point機能をクリックすると、フォースカーブの接触点がX軸とY軸の(0,0)座標に自動的に移動します。
   6. Vertical Tip Position関数を使用して、サンプルのくぼみを補正することにより、Y軸上のカンチレバーの実際の垂直位置を計算します。
   7. 処理されたフォースカーブに、最初に先端の形状と半径(選択したカンチレバープローブに基づく)を選択して 弾性フィット 機能を適用し、次にヘルツ/スネドンモデルを使用してフォースカーブフィッティングを適用します。
      1. 半径70 nmのプローブによるマトリックスのくぼみが70 nmを超える場合(通常はこれにあたります)、 パラボロイド 先端の形状を選択します。キャピラリー剛性の測定では、半径1 μmのプローブによるサンプルのくぼみが1 μmを超えないようにするため、 球 体先端形状を選択します。さらに、フィット曲線の接触点が実際の収縮曲線の接触点と一致しない場合は、 シフト曲線 チェックボックスを選択します。
   8. ヤング率(剛性)の値をメモして保存します。

結果

マウス網膜毛細血管
孤立した網膜毛細血管のAFM剛性測定には、その機構的完全性を損なう可能性のあるサンプルの取り扱い手順が含まれます。これを防ぎ、AFM測定の実現可能性、信頼性、再現性を確保するために、除核眼を5%ホルマリンに4°Cで一晩固定してから、血管を分離します。ホルマリン濃度の低下、固定温度の低下、固定時間の制限、角膜穿刺の欠如を伴うこの穏や?...

ディスカッション

AFMは、大動脈や動脈などの大きな血管の硬直の疾患関連の変化を測定するために広く使用されています¹⁶。これらの知見は、アテローム性動脈硬化症などの心血管合併症における内皮メカノバイオロジーの役割を確立するのに役立ちました¹⁷。これらの発見に基づいて、私たちは、早期のDRにおける網膜微小血管病変の発症における内皮メカノバイオロジー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective