Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

Özet

Yakın zamanda retina kapiller sertleşmesini diyabetle ilişkili retina disfonksiyonu için yeni bir paradigma olarak tanımladık. Bu protokol, fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin retinal endotel kültürlerinden izolasyon adımlarını detaylandırır ve ardından atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik ölçüm tekniğinin bir açıklaması yapılır.

Özet

Retinal kılcal dejenerasyon, diyabetik retinopatinin (DR) erken evrelerinin klinik bir özelliğidir. Son çalışmalarımız, diyabetin neden olduğu retina kılcal damar sertleşmesinin, retina kılcal damarlarının inflamasyon aracılı dejenerasyonunda çok önemli ve daha önce tanınmayan nedensel bir rol oynadığını ortaya koymuştur. Retina kılcal sertliğindeki artış, subendotel matrisini çapraz bağlayan ve sertleştiren bir enzim olan lizil oksidazın aşırı ekspresyonundan kaynaklanır. Erken evrede DR ile mücadelenin DR ilerlemesini ve buna bağlı görme kaybını önlemesi veya yavaşlatması beklendiğinden, subendotelyal matriks ve kapiller sertlik, erken DR yönetimi için ilgili ve yeni terapötik hedefleri temsil eder. Ayrıca, retina kılcal damar sertliğinin doğrudan ölçümü, hayvan ve insan deneklerde retina kılcal damar sertliğinin non-invaziv değerlendirmesi için yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi için çok önemli bir klinik öncesi doğrulama adımı olarak hizmet edebilir. Bu görüşü göz önünde bulundurarak, burada atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin izolasyonu ve sertlik ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Giriş

Retina kılcal damarları, retina homeostazını ve görme fonksiyonunu korumak için gereklidir. Gerçekten de, erken diyabetteki dejenerasyonları, diyabetli tüm bireylerin yaklaşık %40'ını etkileyen mikrovasküler bir durum olan diyabetik retinopatinin (DR) görmeyi tehdit eden komplikasyonlarının gelişiminde güçlü bir şekilde rol oynar¹. Vasküler inflamasyon, DR'de retinal kılcal dejenerasyona önemli ölçüde katkıda bulunur. Geçmiş çalışmalar, diyabetin neden olduğu retinal vasküler inflamasyonda anormal moleküler ve biyokimyasal ipuçları için önemli bir rol olduğunu göstermiştir ^2,3

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Görme ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Beyanı'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles'taki Kurumsal Hayvan ve Bakım Kullanımı Komiteleri (IACUC; protokol numarası ARC-2020-030) tarafından onaylanmıştır (OLAW kurumu hayvan refahı güvence numarası A3196-01). Aşağıdaki protokol, ~ 25 g (diyabetik fareler) ve ~ 32 g (diyabetik olmayan fareler; Jackson Laboratuvarı).

1. AFM sertlik ölçümü için fare retina kılcal damarlarının izolasyonu (1-4. Gün)

NOT: Yakın tarihli bir çalışm....

Tartışmalar

AFM, aort ve arterler gibi daha büyük damarların sertliğindeki hastalığa bağlı değişiklikleri ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁶. Bu bulgular, ateroskleroz¹⁷ gibi kardiyovasküler komplikasyonlarda endotelyal mekanobiyolojinin rolünün belirlenmesine yardımcı olmuştur. Bu bulgulara dayanarak, erken DR'de retinal mikrovasküler lezyonların gelişiminde endotelyal mekanobiyolojinin daha önce tanınmayan rolünü araştırmaya başladık. Bununl.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective