Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

Özet

Yakın zamanda retina kapiller sertleşmesini diyabetle ilişkili retina disfonksiyonu için yeni bir paradigma olarak tanımladık. Bu protokol, fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin retinal endotel kültürlerinden izolasyon adımlarını detaylandırır ve ardından atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik ölçüm tekniğinin bir açıklaması yapılır.

Özet

Retinal kılcal dejenerasyon, diyabetik retinopatinin (DR) erken evrelerinin klinik bir özelliğidir. Son çalışmalarımız, diyabetin neden olduğu retina kılcal damar sertleşmesinin, retina kılcal damarlarının inflamasyon aracılı dejenerasyonunda çok önemli ve daha önce tanınmayan nedensel bir rol oynadığını ortaya koymuştur. Retina kılcal sertliğindeki artış, subendotel matrisini çapraz bağlayan ve sertleştiren bir enzim olan lizil oksidazın aşırı ekspresyonundan kaynaklanır. Erken evrede DR ile mücadelenin DR ilerlemesini ve buna bağlı görme kaybını önlemesi veya yavaşlatması beklendiğinden, subendotelyal matriks ve kapiller sertlik, erken DR yönetimi için ilgili ve yeni terapötik hedefleri temsil eder. Ayrıca, retina kılcal damar sertliğinin doğrudan ölçümü, hayvan ve insan deneklerde retina kılcal damar sertliğinin non-invaziv değerlendirmesi için yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi için çok önemli bir klinik öncesi doğrulama adımı olarak hizmet edebilir. Bu görüşü göz önünde bulundurarak, burada atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin izolasyonu ve sertlik ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Giriş

Retina kılcal damarları, retina homeostazını ve görme fonksiyonunu korumak için gereklidir. Gerçekten de, erken diyabetteki dejenerasyonları, diyabetli tüm bireylerin yaklaşık %40'ını etkileyen mikrovasküler bir durum olan diyabetik retinopatinin (DR) görmeyi tehdit eden komplikasyonlarının gelişiminde güçlü bir şekilde rol oynar¹. Vasküler inflamasyon, DR'de retinal kılcal dejenerasyona önemli ölçüde katkıda bulunur. Geçmiş çalışmalar, diyabetin neden olduğu retinal vasküler inflamasyonda anormal moleküler ve biyokimyasal ipuçları için önemli bir rol olduğunu göstermiştir ^2,3. Bununla birlikte, son çalışmalar, retinal vasküler inflamasyon ve dejenerasyonun çok önemli ancak daha önce tanınmayan bir belirleyicisi olarak retinal kılcal damar sertleşmesini tanımlayan DR patogenezi için yeni bir paradigma ortaya koymuştur ^4,5,6.

Spesifik olarak, retinal kılcal damar sertliğindeki diyabetin neden olduğu artışa, retinal endotel hücrelerinde (EC'ler) kollajen çapraz bağlama enzimi lizil oksidazın (LOX) yukarı regülasyonu neden olur ve bu da subendotel matrisini (bazal membran) sertleştirir4,5,6. Matriks sertleştirme, sırayla, üstteki retinal EC'leri (mekanik karşılıklılık nedeniyle) sertleştirir, böylece retina kılcal sertliğinde genel artışa yol açar⁴. En önemlisi, bu diyabetin neden olduğu retina kılcal damar sertleşmesi tek başına retinal EC aktivasyonunu ve inflamasyon aracılı EC ölümünü teşvik edebilir. Retinal EC kusurlarının bu mekanik regülasyonu, mekanik ipuçlarının biyolojik bir yanıt üretmek için biyokimyasal sinyallere dönüştürüldüğü süreç olan değiştirilmiş endotelyal mekanotransdüksiyona bağlanabilir ^7,8,9. Daha da önemlisi, değişen EC mekanik ipuçları ve subendotelyal matriks yapısı, erken yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili koroidal vasküler dejenerasyonda da rol oynamaktadır10,11,12, bu da dejeneratif retina hastalıklarında vasküler mekanobiyolojinin daha geniş etkilerini kanıtlamaktadır.

Özellikle, retina kılcal damar sertleşmesi, retina iltihabının başlangıcı ile aynı zamana denk gelen diyabetin erken dönemlerinde meydana gelir. Bu nedenle, retinal kılcal sertlikteki artış, DR için hem terapötik bir hedef hem de erken tanısal bir belirteç olarak hizmet edebilir. Bu amaçla, retina kılcal damarlarının ve subendotelyal matriksin güvenilir ve doğrudan sertlik ölçümlerinin elde edilmesi önemlidir. Bu, hücrelerin, hücre dışı matrisin ve dokuların sertliğini doğrudan ölçmek için benzersiz, hassas, doğru ve güvenilir bir teknik sunan bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak elde edilebilir¹³. Bir AFM, sertliği girintili AFM konsolunun bükülme derecesini belirleyen numuneye çok küçük (nanoNewton seviyesinde) girinti kuvveti uygular - numune ne kadar sert olursa, konsol o kadar fazla bükülür ve bunun tersi de geçerlidir. Kültürlenmiş endotel hücrelerinin, subendotel matrislerinin ve izole fare retina kılcal damarlarının^sertliğini ölçmek için AFM'yi yaygın olarak kullandık 4,5,6,11,12. Bu AFM sertlik ölçümleri, endotelyal mekanobiyolojinin DR ve AMD patogenezinin anahtar belirleyicisi olarak tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Görme araştırmalarında mekanobiyolojinin kapsamını genişletmeye yardımcı olmak için, burada izole fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin sertlik ölçümleri için AFM'nin kullanımı hakkında adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Görme ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Beyanı'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles'taki Kurumsal Hayvan ve Bakım Kullanımı Komiteleri (IACUC; protokol numarası ARC-2020-030) tarafından onaylanmıştır (OLAW kurumu hayvan refahı güvence numarası A3196-01). Aşağıdaki protokol, ~ 25 g (diyabetik fareler) ve ~ 32 g (diyabetik olmayan fareler; Jackson Laboratuvarı).

1. AFM sertlik ölçümü için fare retina kılcal damarlarının izolasyonu (1-4. Gün)

NOT: Yakın tarihli bir çalışmada⁴ bildirilen bu protokol, fare gözünün enükleasyonunu ve hafif fiksasyonunu, retina izolasyonunu ve tripsin sindirimini ve ardından elde edilen retina damar sisteminin AFM sertlik ölçümü için mikroskopi slaytlarına monte edilmesini detaylandırır.

1. Enükleasyon ve hafif fiksasyon (1. Gün)
   1. Fareyi karbondioksite maruz kalma ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yaptıktan sonra, göz küresinin arkasına mikro forseps yerleştirin, kas ekini tutun ve mikro forsepsleri çok sıkı sıkıştırmadan gözü dikkatlice dışarı çekin, bu da optik siniri kesebilir.
   2. Hafif fiksasyon için enükleasyonlu gözü 4 ° C'de 24 saat boyunca PBS'de% 5 (h / h) formalin içine yerleştirin.
      NOT:^{Deneyim 4'e} dayanarak, sabitlenmemiş veya daha hafif sabit gözler, AFM numune hazırlama ve sertlik ölçümü sırasında parçalanan kırılgan kılcal damarlar verir.
2. Retina izolasyonu (2. gün)
   1. Sabit gözü diseksiyon mikroskobu altında bir parça yağlı kağıda yerleştirin. Daha sonra, mikro forseps kullanarak, arka gözün dışına bağlı kas ve optik sinirin kalıntılarını tutun ve gözü, kornea bir tarafa bakacak şekilde yönlendirin (Şekil 1).
   2. Cerrahi bir bıçak kullanarak, limbusun 1-2 mm arkasında ve ona paralel bir kesi yapın (kornea-sklera bileşkesi). Daha sonra, mikro forseps ile gözü yerinde tutarken, bıçakla aşağı doğru bir kuvvet uygulayın ve gözün ön segmenti arka uçtan tamamen ayrılana kadar bastırmaya devam edin (Şekil 1). Ön segmenti ve lensi atın. Retina hasarına neden olabileceğinden ileri geri görmeyin.
   3. Arka segmenti (sklera, koroid ve retina) PBS (pH 7.4) ile doldurulmuş 6 cm'lik bir tabağa aktarın.
   4. Bir mikro spatula kullanarak ve aynı anda optik siniri mikro forseps ile nazikçe tutarak retinayı çıkarın. Retinayı, kılcal izolasyona kadar 4 ° C'de PBS içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın.
       
3. Retina durulamaları
   1. Bir retinayı durulamak için, 12 oyuklu bir plakanın altı kuyusunu 1 mL çift damıtılmış H₂O (ddH₂O) ile doldurun. Daha sonra, ters çevrilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak, retinayı 2 mL mikrosantrifüj tüpünden ilk kuyucuğa aktarın.
   2. Retinayı orbital çalkalayıcı üzerinde 120 RPM'de oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca durulayın.
   3. Bir P1000 pipeti kullanarak, retinanın yanındaki suyu dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin ve hafif ajitasyona neden olmak için retinaya su üfleyin.
   4. Ters çevrilmiş cam pipeti kullanarak, retinayı ikinci kuyucuğa aktarın ve 1.3.2 ve 1.3.3 adımlarını 4 kez tekrarlayın, her durulama taze (ddH₂O içeren) bir kuyuda yapılır.
   5. Son olarak, retinayı altıncı kuyucuğa aktarın ve tripsin sindirimi sırasında retinal nöroglianın kan damarlarından ayrılmasını kolaylaştırmak için 100 RPM'ye ayarlanmış orbital çalkalayıcı üzerinde RT'de gece boyunca (O / N) durulayın.
4. Retinal tripsin sindirimi (3. gün)
   1. Tripsin 1:250 tozunu Tris tamponunda (pH 8; 0.1 M) çözerek% 10 (a/h) tripsin çözeltisi hazırlayın. Kabarcık oluşumunu en aza indirmek için konik tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın, bu da tripsin çözünürlüğünü doğrulamayı zorlaştırır.
   2. % 10'luk tripsin çözeltisini 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika dengeleyin. Tripsin tozu tamamen çözüldüğünde, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
   3. 12 oyuklu bir plakada, filtrelenmiş% 10 tripsin çözeltisinden 2 mL / kuyu / retina ekleyin. Komşu kuyucuğa bir miktar ekstra tripsin çözeltisi ekleyin (sonraki adımlar için cam pipet duvarlarını dengelemek için).
   4. 6 oyuklu bir plakanın üç oyuğuna 3 mL ddH₂O ekleyin (bu üç oyuğu bir retina için ayırın).
   5. 15 mL'lik konik bir tüpe, filtrelenmiş %200 tripsin çözeltisinden 4 mL eklemeden önce bir P10 ucu yerleştirin. Bu konik tüpü 37 ° C'lik banyoya aktarın ve ucun 2-3 dakika boyunca tripsin içinde ıslatılmasına izin verin, çünkü bu, sonraki adımlarda retinanın uç duvarlarına yapışmasını önlemeye yardımcı olur.
   6. Retinanın O/N durulamasından sonra (adım 1.3.5'ten itibaren), retinanın yanındaki suyu dikkatlice yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipeti kullanın ve hafif ajitasyona neden olmak için retinaya su püskürtün.
   7. Ters çevrilmiş bir cam pipet kullanarak, durulanmış retinayı 12 oyuklu plakanın tripsin içeren kuyucuğuna aktarın (adım 1.4.3'ten itibaren). Tripsin çözeltisini önemli ölçüde seyreltmemek için retinanın minimum miktarda kalıntı ddH₂O ile aktarıldığından emin olun. 37 °C'de 3 saat inkübe edin.
   8. Tripsinle ıslatılmış P200 ucunu (adım 1.4.5'ten itibaren) optik sinir bölgesinde ortalayarak, vasküler olmayan dokuyu ayırmak için tüm vasküler ağı nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin¹⁴.
   9. Tripsin içinde önceden durulanmış ters çevrilmiş bir cam pipet kullanarak (tripsini 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek), retina damar sistemini 6 oyuklu plakanın ilk ddH₂O içeren kuyucuğuna aktarın (adım 1.4.4'ten itibaren).
   10. Plakayı döndürün ve kalan vasküler olmayan dokuları çıkarmak için ters tripsin ile durulanmış bir cam pipet kullanarak damar sistemini yukarı ve aşağı pipetleyin.
   11. Cam pipeti kullanarak, retina damar sistemini 6 oyuklu plakanın ikinci ddH2O içeren kuyucuğuna aktarın ve AFM sertlik ölçümü için lam üzerine monte edilene kadar 4 ° C'de saklayın.
       NOT: Hidratlı retina damar sistemi (PBS'de) 4 ° C'de 2 haftaya kadar yapısal olarak sağlamdır. Ancak rutin sertlik ölçümleri yeni izole edilmiş kılcal damarlardan yapılmalıdır.
5. AFM sertlik ölçümü için retina damar sisteminin montajı (4. Gün)
   1. Ters çevrilmiş tripsin ile durulanmış bir cam pipet kullanarak, retina damar sistemini, herhangi bir kalıntı tripsin çözeltisini çıkarmak için 6 oyuklu plakanın üçüncü ddH₂O içeren kuyucuğuna aktarın.
   2. AFM sertlik ölçümü için vasküler ağı monte etmek için kullanılacak yüklü bir yüzey mikroskobu slaytını iyice temizleyin (ddH₂O ve silecek mendili kullanarak).
      NOT: Sürgünün yüklü yüzeyi, AFM ölçümü sırasında vasküler ağ için güçlü bir bağlanma sağlar.
   3. Slaytı etiketleyin ve sonraki adımlarda su dökülmesini önlemek için hidrofobik bir kalemle merkezin etrafına 4-5 cm'lik dairesel bir bölge çizin.
   4. Ters çevrilmiş tripsin ile durulanmış bir cam pipet kullanarak, retina damar sistemini dikkatlice işaretli bölgenin merkezine aktarın.
   5. Bir P200 pipeti kullanarak, damar sistemini yanlışlıkla uca aspire etmeden bir kenardan mümkün olduğunca fazla suyu dikkatlice çıkarın.
   6. Sürgüyü ön tarafa (filtreli ağ) yakın bir biyogüvenlik kabinine (BSL-2 davlumbaz) yerleştirin ve kalan suyun buharlaşmasına izin verin.
   7. Damar sistemi neredeyse kuruduktan sonra, bir faz kontrast mikroskobu (4x büyütme) altında, işaretli bölgenin bir tarafına bir P200 pipeti ile ddH₂O ekleyerek damar sistemini dikkatlice yeniden sulandırın. ddH₂O'nun doğrudan damar sistemine eklenmesi damar sisteminin ayrılmasına neden olur.
   8. İyi bir yapısal bütünlüğe sahip olduğundan ve düzgün bir şekilde yayıldığından (kendi üzerine katlanmadığından) ve güvenilir AFM sertlik ölçümü için temel kriterler olan cam slayta tutturulduğundan emin olmak için 4x ve 20x büyütmelerde rehidre edilmiş damar sisteminin faz kontrast görüntülerini alın.

2. Retinal mikrovasküler endotel hücre (REC) kültürlerinden subendotelyal matriks elde edilmesi (1-17. günler)

NOT: Bu protokol, Beacham ve ark.¹⁵ ve son çalışmalarda rapor edilmiştir ^4,5,6, modifiye edilmiş cam lameller üzerinde REC kültürünü tanımlar, ardından sonraki AFM sertlik ölçümü için subendotelyal matris elde etmek için hücreden arındırma yapılır.

1. Jelatin kaplı cam lamellerin hazırlanması ve hücre kaplaması (1. Gün)
   NOT: Sonraki glutaraldehit ve etanolamin işleme adımları için kimyasal çeker ocaklara geçmeden önce jelatin kaplamayı ve sonraki PBS⁺⁺ durulama adımlarını bir doku kültürü davlumbazında gerçekleştirin.
   1. Steril 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına bir otoklavlanmış 12 mm çapında dairesel cam lamel yerleştirin ve 500 μL önceden ısıtılmış steril% 0.2 (a/h) jelatin (kalsiyum ve Magnezyum içeren PBS'de seyreltilmiş; PBS⁺⁺) içeren her bir kuyucuğa. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   2. Jelatin çözeltisini aspire edin, lamelleri steril PBS⁺⁺ ile bir kez durulayın ve RT'de 30 dakika boyunca 500 μL %1 (h/h) glutaraldehit ekleyerek kaplanmış jelatini çapraz bağlayın.
   3. Lamelleri RT'de 100 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca PBS⁺⁺ ile durulamadan önce glutaraldehit çözeltisini toplayın ve uygun şekilde atın (kurumsal yönergelere göre). Bu durulama adımını 5 kez tekrarlayın. İlk üç durulama sırasında, glutaraldehitin iyice durulanmasını sağlamak için steril bir cımbız kullanarak lamelleri kaldırın. Herhangi bir kalıntı miktar hücre canlılığını azaltabilir.
   4. Kuyuda kalan glutaraldehit izlerini söndürmek için RT'de 30 dakika boyunca jelatin çapraz bağlı lamele 800 μL 1 M etanolamin ekleyin.
   5. Etanolamin çözeltisini toplayın ve uygun şekilde atın (kurumsal yönergelere göre) ve lamelleri RT'de 100 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca PBS⁺⁺ ile 5 kez durulayın. İlk üç durulama sırasında, etanolaminin iyice durulanmasını sağlamak için steril bir cımbız kullanarak lamelleri kaldırın. Herhangi bir kalıntı miktar hücre canlılığını azaltabilir.
   6. Çapraz bağlı lameller artık hücre kaplaması için hazırdır.
      NOT: Lamel hazırlığından hemen sonra hücreleri rutin olarak plakalamamıza rağmen, 1-2 gün boyunca PBS⁺⁺ 'da 4 °C'de saklanan çapraz bağlı jelatin lameller üzerindeki hücre kaplamasını karşılaştırmak faydalı olabilir.
   7. Bir doku kültürü başlığındaki steril koşullar altında, faz kontrast mikroskobu ile onaylandığı gibi, 24 saat içinde %100 birleşme sağlayan bir yoğunlukta 500 μL ortamda/kuyuda plaka retinal mikrovasküler endotel hücreleri (REC'ler).
      NOT: 24 saat içinde birleşmeye ulaşmak önemlidir, çünkü ortaya çıkan REC sessizliği hücrelerin matris salgılama yeteneğini artıracaktır (aşağıdaki adıma bakın). İnsan REC'leri ile olan deneyimimize göre, 24 saat içinde birleşmeye ulaşmak için 4 x 10⁴ hücre/^cm2'lik bir kaplama yoğunluğu yeterlidir. Bununla birlikte, REC boyutu türe göre değiştiğinden (örneğin, fare REC'leri önemli ölçüde daha küçüktür), ilk kaplama yoğunluğunun optimize edilmesi gerekebilir.
2. REC kültürü ile subendotelyal matriks üretimi (Gün 2-16)
   1. Hücreler birleştikten sonra (~ 24 saat), kültür ortamını steril filtrelenmiş askorbik asit (200 μg / mL'lik nihai konsantrasyon) ile takviye edilmiş taze ortamla değiştirin.
      NOT: Hastalık risk faktörleri (ör., yüksek glikoz, ileri glikasyon son ürünleri, vb.) veya farmakolojik ajanlarla yapılan herhangi bir REC tedavisi, askorbik asit tedavisi ile birlikte şimdi başlayabilir.
   2. Askorbik asit takviyeli kültür ortamını 15 gün boyunca her gün değiştirin.
      NOT: Askorbik asit çözelti içinde kararsızdır. Orta takviye için her gün taze 100X stok solüsyonu hazırlayın.
3. Subendotelyal matrisi elde etmek için REC kültürlerinin hücreden arındırılması (16. Gün)
   1. 15 günlük askorbik asit tedavisinden sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri kalsiyum / magnezyum içermeyen PBS ile durulayın.
   2. ~2-3 dakika boyunca 250 μL/kuyu başına ılık hücre giderme tamponu (20 mM amonyum hidroksit ve PBS'de %0.5 Triton X-100) ekleyerek REC kültürlerini hücrelerden arındırın. Faz kontrast mikroskobu (10x büyütme) altında hücrelerin çıkarıldığını onaylayın.
   3. REC tarafından salgılanan subendotelyal matrisi bozmadan hücre giderme tamponunu nazikçe çıkarın ve her oyuğa 0,5 mL PBS ekleyin.
      NOT: Bu ve sonraki durulama adımları sırasında subendotelyal matrisin ayrılmamasını sağlamak için, yalnızca bir P1000 pipeti ile nazikçe durulama yapın. Vakum aspirasyonu yapmayın.
   4. REC tarafından salgılanan matrisi stabilize etmek için plakaları gece boyunca 4 °C'de saklayın.
4. Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için subendotelyal matriksin DNaz tedavisi (17. Gün)
   1. Subendotelyal matrisi adım 2.3.4'ten itibaren 800 μL PBS/kuyucuk ile durulayın.
   2. PBS'yi nazikçe çıkarın ve tüm hücresel kalıntı izlerini gidermek için matrisi 200 μL RNaz içermeyen DNaz I (30 K birimi) ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu altında hücre kalıntılarını dikkatlice arayarak DNaz işleminin verimliliğini kontrol edin.
   3. DNaz I solüsyonunu nazikçe çıkarın ve subendotelyal matrisi 800 μL PBS / kuyucuk ile iki kez durulayın.
   4. Makro ölçekli fibröz subendotelyal matrisin bir faz kontrast mikroskobu (10x büyütme) altında görünür olup olmadığını kontrol edin. Daha ince nano ölçekli matris liflerinin görselleştirilmesi, AFM topografik taramasını veya immün etiketli matris proteinlerinin 100x büyütmede yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesini gerektirir.
   5. AFM sertlik ölçümü için hemen taze (sabitlenmemiş) subendotelyal matrisi kullanın.
   6. AFM ölçümünü takiben, matris numunelerini %1 (h/h) paraformaldehit (oda sıcaklığında 15 dakika) ile sabitleyin ve subendotelyal matriks proteinlerine ve/veya çapraz bağlama enzimlerine karşı antikorlarla immünoetiketleme için 4 ° C'de saklayın.

3. AFM sertlik ölçümü

NOT: Standart bir AFM kullanım kılavuzundan uyarlanan ve son çalışmalarda ^4,5 rapor edilen bu protokol, bir AFM ve veri analiz yazılımı kullanılarak retina kılcal damarlarından ve subendotelyal matristen sertlik verilerinin elde edilmesini ve analizini detaylandırır. Aşağıda özetlenen adımlar belirli bir AFM modeline dayansa da (Malzeme Tablosuna bakınız), temel ilkeler genellikle tüm AFM modelleri için geçerlidir.

1. Konsol probu seçimi
   NOT: Yumuşak biyolojik numuneler, prob boyutları numunenin boyutlarına uyacak şekilde seçilirken numune girintisi üzerine bükülebilen yumuşak konsollar gerektirir.
   1. 5-8 μm çaplı fare retina damarlarının sertlik ölçümü için, yay sabiti (k) 0.2-0.3 N/m olan 1 μm yarıçaplı konsol probu kullanın. Nano ölçekli liflerden oluşan bir subendotelyal matrisin sertlik ölçümü için, 0.06-0.1 N / m'lik bir yay sabiti (k) olan 70 nm yarıçaplı bir konsol probu kullanın.
2. Konsol montajı
   1. AFM bilgisayarında, konsolu ve numuneyi görselleştirmek için kullanılan bir faz kontrast mikroskobuna bağlı AFM ünitesini ve kamerayı kontrol eden yazılımı açın.
   2. Konsol tutucuyu konsol değiştirme sehpasına sabitleyin ve konsola fiziksel olarak zarar vermeden bir stereoskop altında saat ustası forsepslerini kullanarak seçilen konsolu tutucuya monte edin. Konsolu sabitlemek için tutucudaki vidayı sıkın.
   3. Konsol tutucuyu sehpa üzerinde duran AFM kafasına yerleştirin ve kilitleyin.
   4. AFM yazılımındaki step motor işlevini kullanarak, AFM kafasını en yüksek noktaya çekin ve bu konumu yazılımda sıfır noktası olarak ayarlayın. Bu adım, AFM konsolunun yanlışlıkla s'ye çarpmasını önler.ampAFM kafasını monte ederken aşama (sonraki adım).
   5. AFM kafasını dikkatlice standından kaldırın ve AFM s'ye monte edin.ampbacakları ilgili yuvalarına yerleştirerek.
3. Lazer hizalama
   NOT: İlk lazer hizalaması, lazer ışınının konsol ucu üzerinde daha hassas bir şekilde hizalanmasını sağladığı için (sıvıda lazer kırılmasını önleyerek) herhangi bir numune olmadan (yani Hava modunda) gerçekleştirilir. Bununla birlikte, biyolojik numuneler havadan farklı bir kırılma indisine sahip bir ortama daldırıldığından, sertlik ölçümünden önce lazerin ortamda yeniden hizalanması önemlidir.
   1. Havada lazer hizalama için, AFM kafasını s'ye yerleştirinamp ve konsol monitörde canlı modda görselleştirmek için 10x objektifi ve takılı kamerayı kullanın. Kızılötesi lazer, kullanıcının görüş alanından gizlenir, ancak bir CCD kamera ile görülebilir.
   2. Yazılımda Temas Modu Kuvvet Spektroskopisi işlevini seçin ve Lazer hizalama başlıklı pencereyi açın.
   3. AFM kafasında lazer yanal olarak işaretlenmiş iki vidayı kullanarak, lazer hizalama penceresindeki SUM değeri en yüksek olacak şekilde lazer ışınını konsol üzerine odaklayın. Bunu başarmak için lazeri konsolun merkezine veya çevresine odaklayın.
   4. Dedektör ayar vidalarını kullanarak, fotodedektörü, lazer noktası lazer hizalama penceresinin merkezinde olacak şekilde ayarlayın.
   5. Ayna ayar vidasını kullanarak, SUM değerinin mümkün olan en yüksek değerde olduğundan emin olmak için aynayı ayarlayın.
      NOT: Yüksek bir SUM değeri, numune sertliğinin hassas ve doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu nedenle, en yüksek SUM değerini elde etmek için hem lazer hizalama hem de ayna ayarlama adımları gerçekleştirilmelidir.
   6. Daha sonra, sıvı içinde lazer hizalama için, istenen kültür ortamını bir tabağa ekleyin ve numune girintisi sırasında ölçüm artefaktları oluşturan herhangi bir titreşim veya kaymayı önlemek için sahneye sıkıca monte edin.
   7. Konsola odaklanan canlı kamera beslemesine bakarken, step motor işlevini kullanarak sıvıya indirin.
   8. SUM değerinin en yüksek kaldığından ve lazer noktasının lazer hizalama penceresinin merkezinde olduğundan emin olmak için 3.3.4 ve 3.3.5 adımlarını tekrarlayın.
4. Konsol yay sabitinin kalibrasyonu
   NOT: Konsol probları, üretici tarafından kalibre edilmiş bir yay sabiti (k) ile birlikte gelse de, bir ölçüme başlamadan önce değerini (sıvı içinde) bağımsız olarak doğrulamak iyi bir uygulamadır. Konsol probu ile cam yüzey arasındaki etkileşimleri en aza indiren temiz bir cam yüzey kullanın.
   1. Konsol tarafından uygulanan ayar noktası kuvveti, bir kuvvet girintisi için izin verilen konsoldan maksimum lazer sapmasını ayarlar. Başlangıçta 1,5 V'a ayarlayın. Konsol bu verilen ayar noktası kuvvetine yaklaşamazsa, numuneyi girintileyene ve bir kuvvet girinti eğrisi oluşturana kadar kademeli olarak artırın.
   2. Z Uzunluğu, numune girintisi sırasında konsol ayar noktasına ulaştıktan sonra z-piezo'nun çekildiği maksimum mesafeyi belirtir. Z uzunluğu, konsol probunun numuneden temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak için en az yeterli olmalıdır. Bir cam yüzeyde yay sabitinin kalibrasyonu için Z Uzunluğunu 1 μm olarak ayarlayın.
   3. Z hızı, z-piezo'nun kuvvet girintisi sırasında konsolu numuneye doğru dikey olarak aşağı hareket ettirdiği hızı ifade eder. Optimize edilmelidir, çünkü çok düşük bir hız öncelikle numunenin viskoz davranışını yakalayacak, çok yüksek bir hız ise öncelikle elastik davranışı yakalayacaktır. Optimum hızın, biyolojik numunelerin gerçek viskoelastik doğasını yakalaması beklenmektedir. Viskoelastik biyolojik numuneler için Z hızını 2 μm/s'ye ayarlayın.
   4. Z aralığındaki Hedef yükseklik, bir kuvvet eğrisini ölçtükten sonra ve numune üzerinde farklı bir konuma hareket etmeden önce z-piezo'nun durduğu numuneden yaklaşık mesafeyi gösterir. Z Aralığı hedef yüksekliği, örnek özelliklerin yüksekliğinden daha büyük olmalıdır. Z aralığında hedef yüksekliği 7,5 μm olarak ayarlayın.
   5. Step Motor fonksiyonunu kullanarak, konsolu 10 μm'lik daha küçük artışlarla aşağı indirmek için temas modu kuvvet spektroskopisi penceresinde Yaklaşma fonksiyonunu seçmeden önce konsolu numune yüzeyine oldukça yaklaştırın (15x büyütmede faz kontrast görüntüsündeki odağa bakılırsa).
   6. Bir kuvvet eğrisi yakalamak için Al'ı tıklayın.
   7. Kuvvet Eğrisi'ni seçin, kalibrasyon yöneticisi penceresinde açın ve yöntem bölümünde Temas Tabanlı Mod'u seçin.
   8. Sığdırma Aralığını Seç işlevini kullanarak, doğrusal bir eğri uyumu için Konsol Geri Çekme Eğrisi'ni seçin. Ardından, kuvvet birimini V'den N'ye dönüştürmek için Hassasiyet Onay kutusunu işaretleyin.
   9. Konsolu sıvı içinde 100-200 μm kaldırın ve Termal Gürültü işlevini seçin. Yine, Uygun Aralığı Seç'i kullanarak, termal gürültü çan eğrisini bir Lorentz eğrisi ile eşleştirin. Eğri uydurduktan sonra, Yay Sabiti (k) kutusunu seçin. Yay sabitinin (k) üreticinin değerine yakın olduğunu onaylayın ve ileride başvurmak üzere not edin. Kalibrasyondan sonra, ayar noktası birimi mV'den nN'ye değişecektir.
      NOT: Termal gürültü, konsolun belirli bir sıcaklıktaki doğal frekansıdır. Doğru yay sabiti ölçümü için termal gürültünün düzeltilmesi gereklidir.
5. Kuvvet-mesafe eğrilerinin elde edilmesi
   1. Kayar monteli numuneyi (retina damarları veya subendotelyal matriks) AFM tablasına yerleştirin ve yazılımın deney bölümünde Temas Modu Kuvvet Spektroskopisi'ni seçin.
   2. Ayar noktası kuvvetini 0,5 nN'ye ayarlayın ve hem SAA-SPH 1 μm hem de PFQNM-LC-A 70 nm konsol problarının termal sapmasından önemli ölçüde daha yüksek olan Yaklaşım'a tıklayın, bu da numuneye doğru düzgün bir konsol yaklaşımı sağlar.
   3. Konsol yüzeyi algıladıktan ve dinlenme hedef yüksekliğine geri döndükten sonra, ayar noktasını daha sert SAA-SPH 0.2 μm konsol probu için 1 nN veya daha yumuşak PFQNM-LC-A 0.1 nm konsol probu için 70 nN olarak ayarlayın. Bu ayar noktası ayarı, numune girintisi sırasında hem sert hem de yumuşak konsolların kolayca bükülmesini sağlar (bkz. bölüm 3.1).
   4. Geri çekme sırasında konsol probunun biyolojik numunelerden temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak için Z Uzunluğunu ~2.5 μm'ye ayarlayın (bkz. adım 3.4.2) ve Z hızını 2 μm/s'ye (bkz. adım 3.4.3).
   5. AFM tablasındaki s'yi kullanaraktage, konsol probunu numune üzerinde istenen bir yere dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Kılcal damarlar kızak üzerinde her zaman düz bir şekilde yayılmadığından, sahneyi hareket ettirmeden önce konsolu dinlenme hedef yüksekliğinden 10-20 μm daha çekmek güvenlidir.
   6. Önce konsolu örneğe yaklaştırmak için Yaklaşım'a tıklayın ve ardından istenen konumlar için kuvvet eğrilerini yakalamak için Al'a tıklayın. Analiz için tüm kuvvet eğrilerini kaydedin.
6. Veri analizi
   1. Veri işleme yazılımında kuvvet eğrisini açın.
   2. Veri analizi için Geri Çekme Kuvveti Eğrisi'ni seçin (adım 3.4.8'e benzer).
   3. Veri yumuşatma işlevini kullanarak, elde edilen verilerdeki istenmeyen gürültüyü gidermek için kuvvet eğrisini bir Gauss filtresiyle düzeltin.
   4. Taban çizgisi çıkarma işlevini kullanarak, kuvvet eğrisinin (temassız) temel kısmının eğiminin ve büyüklüğünün değerini sıfıra ayarlayın.
   5. Kuvvet eğrisinin temas noktasını otomatik olarak X ve Y eksenlerindeki (0,0) koordinatlarına getirmek için Temas Noktası işlevine tıklayın.
   6. Dikey Uç Konumu işlevini kullanarak, herhangi bir numune girintisini düzelterek konsolun Y ekseni üzerindeki gerçek dikey konumunu hesaplayın.
   7. İşlenmiş kuvvet eğrisinde, önce uç şeklini ve yarıçapını (seçilen konsol probuna bağlı olarak) seçerek, ardından Hertz/Sneddon modelini kullanarak kuvvet eğrisi uydurarak Esneklik Uyumu işlevini uygulayın.
      1. 70 nm yarıçaplı probun matris girintisi 70 nm'yi aşarsa, ki bu tipik olarak böyledir, Paraboloid uç şeklini seçin. Kılcal sertlik ölçümü için, 1 μm yarıçaplı prob tarafından numune girintisi hiçbir zaman 1 μm'yi aşmaz, bu nedenle Küre ucu şeklini seçin. Ayrıca, takılan eğrinin temas noktası gerçek geri çekme eğrisinin temas noktasıyla çakışmıyorsa, Eğriyi Kaydır onay kutusunu seçin.
   8. Young modülünün (sertlik) değerini not edin ve kaydedin.

Sonuçlar

Fare retina kılcal damarları
İzole retina kılcal damarlarının AFM sertlik ölçümü, mekanoyapısal bütünlüklerine potansiyel olarak zarar verebilecek numune işleme adımlarını içerir. Bunu önlemek ve böylece AFM ölçümlerinin fizibilitesini, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için, enükleasyonlu gözler, damar izolasyonundan önce gece boyunca 4 °C'de% 5 formalin içinde sabitlenir. Düşük formalin konsantrasyonu, düşük fiksasyon sıcaklığı, sınırlı ...

Tartışmalar

AFM, aort ve arterler gibi daha büyük damarların sertliğindeki hastalığa bağlı değişiklikleri ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁶. Bu bulgular, ateroskleroz¹⁷ gibi kardiyovasküler komplikasyonlarda endotelyal mekanobiyolojinin rolünün belirlenmesine yardımcı olmuştur. Bu bulgulara dayanarak, erken DR'de retinal mikrovasküler lezyonların gelişiminde endotelyal mekanobiyolojinin daha önce tanınmayan rolünü araştırmaya başladık. Bununl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective