JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Недавно мы определили ригидность капилляров сетчатки как новую парадигму дисфункции сетчатки, связанной с диабетом. В этом протоколе подробно описаны этапы выделения капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши из эндотелиальных культур сетчатки с последующим описанием методики измерения жесткости с помощью атомно-силовой микроскопии.

Аннотация

Капиллярная дегенерация сетчатки является клиническим признаком ранних стадий диабетической ретинопатии (ДР). Наши недавние исследования показали, что индуцированное диабетом ригидность капилляров сетчатки играет решающую и ранее непризнанную причинно-следственную роль в воспалительной дегенерации капилляров сетчатки. Увеличение жесткости капилляров сетчатки происходит в результате гиперэкспрессии лизилоксидазы, фермента, который сшивает и укрепляет субэндотелиальный матрикс. Поскольку ожидается, что борьба с ДР на ранней стадии предотвратит или замедлит прогрессирование ДР и связанную с ней потерю зрения, субэндотелиальный матрикс и жесткость капилляров представляют собой актуальные и новые терапевтические мишени для раннего лечения ДР. Кроме того, прямое измерение жесткости капилляров сетчатки может послужить важным этапом доклинической валидации для разработки новых методов визуализации для неинвазивной оценки жесткости капилляров сетчатки у животных и людей. Учитывая эту точку зрения, мы представляем подробный протокол для изоляции и измерения жесткости капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши с помощью атомно-силовой микроскопии.

Введение

Капилляры сетчатки необходимы для поддержания гомеостаза сетчатки и зрительной функции. Действительно, их дегенерация на ранних стадиях диабета тесно связана с развитием угрожающих зрению осложнений диабетической ретинопатии (ДР), микрососудистого заболевания, которое поражает почти 40% всех людей с диабетом1. Воспаление сосудов вносит значительный вклад в капиллярную дегенерацию сетчатки при ДР. Прошлые исследования продемонстрировали важную роль аберрантных молекулярных и биохимических сигналов в воспалении сосудов сетчатки, вызванном диабетом 2,3. Тем не менее, недавняя работа представила новую парадигму патогенеза DR, которая определяет ригидность капилляров сетчатки как ключевую, но ранее непризнанную детерминанту воспаления и дегенерации сосудов сетчатки 4,5,6.

В частности, вызванное диабетом увеличение жесткости капилляров сетчатки вызвано повышением активности фермента поперечной сшивки коллагена лизилоксидазы (LOX) в эндотелиальных клетках сетчатки (ЭК), что делает субэндотелиальный матрикс (базальную мембрану) более жестким.4,5,6. Жесткость матрицы, в свою очередь, делает более жесткими вышележащие ЭК сетчатки (за счет механической взаимности), что приводит к общему увеличению жесткости капилляров сетчатки4. Важно отметить, что это вызванное диабетом ригидность капилляров сетчатки сама по себе может способствовать активации ЭК сетчатки и опосредованной воспалением смерти ЭК. Эта механическая регуляция дефектов ЭК сетчатки может быть связана с измененной эндотелиальной механотрансдукцией, процессом, посредством которого механические сигналы преобразуются в биохимические сигналы для создания биологической реакции 7,8,9. Важно отметить, что измененные механические сигналы ЭК и структура субэндотелиального матрикса также были вовлечены в сосудистую дегенерацию хориоидеи, связанную с ранней возрастной макулярной дегенерацией (ВМД)10,11,12, что свидетельствует о более широком применении сосудистой механобиологии при дегенеративных заболеваниях сетчатки.

Примечательно, что ригидность капилляров сетчатки происходит на ранних стадиях сахарного диабета, что совпадает с началом воспаления сетчатки. Таким образом, увеличение жесткости капилляров сетчатки может служить как терапевтической мишенью, так и ранним диагностическим маркером ДР. С этой целью важно получить надежные и прямые измерения жесткости капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса. Это может быть достигнуто с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ), который предлагает уникальный, чувствительный, точный и надежный метод прямого измерения жесткости клеток, внеклеточного матрикса итканей. АСМ прикладывает к образцу мельчайшую (наноньютоновскую) силу вдавливания на образец, жесткость которого определяет степень изгиба кантилевера с вдавливанием АСМ - чем жестче образец, тем сильнее изгибается кантилевер, и наоборот. Мы широко использовали АСМ для измерения жесткости культивируемых эндотелиальных клеток, субэндотелиальных матриц и изолированных капилляров сетчатки мыши 4,5,6,11,12. Эти измерения жесткости АСМ помогли определить, что эндотелиальная механобиология является ключевым фактором, определяющим патогенез ДР и ВМД. Чтобы помочь расширить область применения механобиологии в исследованиях зрения, здесь мы приводим пошаговое руководство по использованию АСМ для измерения жесткости изолированных капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры на животных были выполнены в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и одобрены Институциональными комитетами по использованию животных и ухода за ними (IACUC; номер протокола ARC-2020-030) в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (номер A3196-01 учреждения OLAW по обеспечению благополучия животных). Следующий протокол был выполнен с использованием капилляров сетчатки, выделенных от взрослых (20-недельных) самцов мышей C57BL/6J весом ~25 г (мыши с диабетом) и ~32 г (мыши без диабета; Лаборатория Джексона).

1. Выделение капилляров сетчатки мыши для измерения жесткости АСМ (1-4 дни)

Примечание: В этом протоколе, представленном внедавнем исследовании4, подробно описывается энуклеация и мягкая фиксация мышиного глаза, изоляция сетчатки и расщепление трипсина, а также последующее наложение полученной сосудистой сети сетчатки на предметные стекла микроскопии для измерения жесткости АСМ.

  1. Энуклеация и легкая фиксация (день 1)
    1. После усыпления мыши с воздействием углекислого газа с последующим вывихом шейки матки вставьте микрощипцы за глазное яблоко, возьмитесь за мышечное крепление и осторожно вытащите глаз, не сжимая микрощипцы слишком сильно, что может привести к разрыву зрительного нерва.
    2. Поместите энуклеированный глаз в 5% (v/v) формалина в PBS на 24 ч при 4 °C для мягкой фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из опыта4, нефиксированные или более слабо зафиксированные глаза дают хрупкие капилляры, которые фрагментируются во время подготовки образцов АСМ и измерения жесткости.
  2. Изоляция сетчатки (день 2)
    1. Поместите неподвижный глаз на лист вощеной бумаги под препарирующим микроскопом. Далее, с помощью микрощипцов, удерживайте остатки мышцы и зрительного нерва, прикрепленные к внешней стороне заднего глаза, и ориентируйте глаз так, чтобы роговица была обращена в одну сторону (рисунок 1).
    2. С помощью хирургического лезвия сделайте разрез на 1-2 мм позади и параллельно лимбу (соединение роговицы и склеры). Затем, удерживая глаз на месте с помощью микрощипцов, приложите усилие лезвием вниз и продолжайте надавливать до тех пор, пока передний сегмент глаза полностью не отделится от заднего конца (Рисунок 1). Выбросьте передний сегмент и хрусталик. Не пилите вперед и назад, так как это может привести к повреждению сетчатки.
    3. Перенесите задний сегмент (склеру, сосудистую оболочку и сетчатку) в чашку размером 6 см, наполненную PBS (pH 7,4).
    4. С помощью микрошпателя и одновременно аккуратно удерживая зрительный нерв микрощипцами, вычерпните сетчатку. Храните сетчатку в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл, содержащей PBS, при температуре 4 °C до капиллярной изоляции.
       
  3. Ополаскиватели для сетчатки глаза
    1. Чтобы промыть одну сетчатку, заполните шесть лунок 12-луночного планшета 1 мл двойной дистилляции H2O (ddH2O). Далее с помощью перевернутой пипетки Пастера перенесите сетчатку из микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл в первую лунку.
    2. Промойте сетчатку на орбитальном шейкере при 120 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
    3. С помощью пипетки P1000 осторожно нагнетайте воду вверх и вниз по сетчатке, выдувая воду на сетчатку, чтобы вызвать легкое возбуждение.
    4. С помощью пипетки из перевернутого стекла перенесите сетчатку во вторую лунку и повторите шаги 1.3.2 и 1.3.3 4 раза, при этом каждое полоскание выполняется в свежей (ddH2O-содержащей) лунке.
    5. Наконец, перенесите сетчатку в шестую лунку и промойте ее на ночь (O/N) в режиме ЛТ на орбитальном шейкере, установленном на 100 об/мин, чтобы облегчить отделение нейроглии сетчатки от кровеносных сосудов во время расщепления трипсина.
  4. Усвоение трипсина сетчатки (День 3)
    1. Приготовьте 10% (масс./об.) раствор трипсина, растворив порошок трипсина 1:250 в буфере Tris (pH 8; 0,1 M). Осторожно перемешивайте, несколько раз перевернув коническую трубку, чтобы свести к минимуму образование пузырьков, что затрудняет подтверждение растворимости трипсина.
    2. Уравновесить 10% раствор трипсина на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут. Как только порошок трипсина полностью растворится, отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм.
    3. В 12-луночный планшет добавьте 2 мл/лунку/сетчатку отфильтрованного 10% раствора трипсина. Добавьте немного дополнительного раствора трипсина в соседнюю лунку (чтобы уравновесить стеклянные стенки пипетки для последующих этапов).
    4. Добавьте 3 мл ddH2O в три лунки 6-луночного планшета (выделите эти три лунки для одной сетчатки).
    5. В коническую пробирку объемом 15 мл вставьте наконечник P200 перед добавлением 4 мл отфильтрованного 10% раствора трипсина. Перенесите эту коническую трубку в ванну с температурой 37 °C, чтобы наконечник пропитался трипсином на 2-3 минуты, так как это помогает предотвратить прилипание сетчатки к стенкам кончика на последних этапах.
    6. После промывания сетчатки с помощью O/N (из шага 1.3.5) с помощью пипетки P1000 осторожно проводите пипеткой воду вверх и вниз по прилегающей к сетчатке, разбрызгивая воду на сетчатку, чтобы вызвать легкое возбуждение.
    7. С помощью пипетки из перевернутого стекла перенесите промытую сетчатку в трипсинсодержащую лунку 12-луночного планшета (из шага 1.4.3). Убедитесь, что сетчатка переносится с минимальным количеством остаточногоddH2O, чтобы не разбавлять раствор трипсина значительно. Выдерживать в течение 3 ч при 37 °C.
    8. Центрируя пропитанный трипсином наконечник P200 (из шага 1.4.5) в области зрительного нерва, аккуратно пипетируйте всю сосудистую сеть вверх и вниз, чтобы диссоциировать несосудистую ткань14.
    9. С помощью пипетки из перевернутого стекла, предварительно промытой в трипсине (путем пипетирования трипсина вверх и вниз 5 раз), перенесите сосудистую сеть сетчатки в первуюddH2O-содержащую лунку 6-луночного планшета (с шага 1.4.4).
    10. Вращайте пластину и пипеткой сосудистую сеть вверх и вниз с помощью перевернутой стеклянной пипетки, ополаскиваемой трипсином, чтобы удалить остатки несосудистой ткани.
    11. С помощью стеклянной пипетки перенесите сосудистую сеть сетчатки во вторую ddH2O-содержащую лунку 6-луночного планшета и храните при температуре 4 °C до установки на предметное стекло для измерения жесткости АСМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидратированная сосудистая сеть сетчатки (при PBS) структурно неповреждена при 4 °C в течение 2 недель. Тем не менее, рутинные измерения жесткости должны проводиться из свежевыделенных капилляров.
  5. Монтаж сосудистой сети сетчатки для измерения жесткости АСМ (4-й день)
    1. С помощью перевернутой стеклянной пипетки, ополаскиваемой трипсином, перенесите сосудистую сеть сетчатки в третьюddH2O-содержащую лунку 6-луночного планшета, чтобы удалить остаточный раствор трипсина.
    2. Тщательно очистите (с помощью ddH, 2O и салфетки салфетки) предметное стекло для микроскопии заряженной поверхности, которое будет использоваться для монтажа сосудистой сетки для измерения жесткости АСМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заряженная поверхность предметного стекла обеспечивает прочное связывание сосудистой сетки во время измерения АСМ.
    3. Подпишите предметное стекло и нарисуйте гидрофобной ручкой круглую область размером 4-5 см вокруг центра, чтобы избежать пролития воды на последующих этапах.
    4. С помощью перевернутой стеклянной пипетки, ополаскиваемой трипсином, осторожно перенесите сосудистую сеть сетчатки к центру отмеченной области.
    5. С помощью пипетки P200 осторожно удалите как можно больше лишней воды с одного края, чтобы случайно не аспирировать сосудистую сеть в наконечник.
    6. Поместите предметное стекло в шкаф биобезопасности (вытяжка BSL-2) ближе к лицевой стороне (фильтрованная сетка) и дайте остаточной воде испариться.
    7. Когда сосудистая сеть станет почти сухой, под помощью фазово-контрастного микроскопа (4-кратное увеличение) осторожно регидратируйте сосудистую сеть, медленно добавляя ddH2O с помощью пипетки P200 на одну сторону помеченной области. Добавление ddH2O непосредственно в сосудистую сеть приводит к ее отделению.
    8. Сделайте фазово-контрастные изображения регидратированной сосудистой сети с 4-кратным и 20-кратным увеличением, чтобы убедиться, что она имеет хорошую структурную целостность и правильно распределена (не складывается на себя) и прикреплена к предметному стеклу, что является важным критерием для надежного измерения жесткости АСМ.

2. Получение субэндотелиального матрикса из культур микрососудистых эндотелиальных клеток (РЭК) сетчатки (1-17 дни)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол, адаптированный из Beacham et al.15 и сообщается в последних исследованиях 4,5,6, описывается культивирование REC на модифицированных стеклянных покровных стеклах с последующей децеллюляризацией для получения субэндотелиального матрикса для последующего измерения жесткости АСМ.

  1. Приготовление покровных покрытий из стекла с желатиновым покрытием и ячеистое покрытие (День 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните нанесение желатинового покрытия и последующие этапы промывки PBS++ в шкафу для культуры тканей перед перемещением в вытяжной шкаф для химических веществ для последующих этапов обработки глутаральдегидом и этаноламином.
    1. Поместите одну автоклавную круглую стеклянную покровную крышку диаметром 12 мм в лунку стерильного 24-луночного планшета и добавьте 500 μл предварительно подогретого стерильного 0,2% (по объему) желатина (разбавленного в PBS, содержащем кальций и магний; PBS++) в каждую лунку, содержащую покровное стекло. Выдерживать в течение 1 ч при 37 °C.
    2. Отсадите желатиновый раствор, промойте покровные стекла один раз стерильным PBS++ и сшивайте покрытый желатин, добавив 500 мкл 1% (v/v) глутаральдегида в течение 30 минут при RT.
    3. Соберите и правильно утилизируйте (в соответствии с рекомендациями учреждения) раствор глутарового альдегида перед промыванием покровных стекол PBS++ в течение 5 минут на орбитальном шейкере при 100 об/мин в режиме RT. Повторите этот этап промывки 5 раз. Во время первых трех полосканий поднимите покровные стекла с помощью стерильного пинцета, чтобы обеспечить тщательное смывание глутаральдегида. Любое остаточное количество может снизить жизнеспособность клеток.
    4. Добавьте 800 мкл 1 М этаноламина, в желатиновый сшитый покровный лист на 30 мин при RT, чтобы погасить любые оставшиеся следы глутаральдегида в лунке.
    5. Соберите и правильно утилизируйте (в соответствии с рекомендациями учреждения) раствор этаноламина, а затем промойте покровные стекла 5 раз PBS++ в течение 5 минут на орбитальном шейкере при 100 об/мин в режиме RT. Во время первых трех полосканий поднимите покровные стекла с помощью стерильного пинцета, чтобы обеспечить тщательное промывание этаноламина. Любое остаточное количество может снизить жизнеспособность клеток.
    6. Теперь сшитые покровные стекла готовы к нанесению покрытия ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что мы обычно помещаем пластинчатые клетки сразу после подготовки покровного стекла, возможно, имеет смысл сравнить покрытие ячеек на сшитых желатиновых покровных стеклах, хранящихся в PBS++ при 4 °C в течение 1-2 дней.
    7. В стерильных условиях в тканевом культуральном колпаке пластинчатые микрососудистые эндотелиальные клетки (REC) сетчатки в среде/лунке объемом 500 мкл с плотностью, обеспечивающей 100% слияние в течение 24 ч, что подтверждено фазово-контрастной микроскопией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение слияния в течение 24 часов важно, так как результирующее покое REC увеличивает способность клеток секретировать матрикс (см. следующий шаг). По нашему опыту работы с человеческими REC, плотность покрытия 4 x 104 клеток /см2 достаточна для достижения слияния в течение 24 часов. Однако, поскольку размер REC варьируется в зависимости от вида (например, мышиные REC значительно меньше), может потребоваться оптимизация исходной плотности покрытия.
  2. Продукция субэндотелиального матрикса с помощью культуры REC (день 2-16)
    1. После того, как клетки достигнут слияния (~24 ч), замените питательную среду свежей средой с добавлением стерильно отфильтрованной аскорбиновой кислоты (конечная концентрация 200 мкг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое лечение REC с факторами риска заболевания (например, высоким уровнем глюкозы, конечными продуктами гликирования и т.д.) или фармакологическими препаратами можно начинать сейчас, наряду с лечением аскорбиновой кислотой.
    2. Меняйте питательную среду с добавлением аскорбиновой кислоты через день в течение 15 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аскорбиновая кислота нестабильна в растворе. Готовьте свежий 100Х стоковый раствор через день для средней добавки.
  3. Децеллюляризация культур REC с получением субэндотелиального матрикса (16-й день)
    1. После 15 дней обработки аскорбиновой кислотой удалите среду и промойте клетки PBS, не содержащим кальция и магния.
    2. Децеллюляризируйте культуры REC путем добавления 250 мкл/лунка теплого буфера для децеллюляризации (20 мМ гидроксида аммония и 0,5% Triton X-100 в PBS) в течение ~2-3 мин. Подтвердите удаление клеток под фазово-контрастным микроскопом (10-кратное увеличение).
    3. Аккуратно удалите буфер для децеллюляризации, не нарушая секретируемый REC субэндотелиальный матрикс, и добавьте по 0,5 мл PBS в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что субэндотелиальный матрикс не отсоединится во время этого и последующих этапов промывания, выполняйте осторожное промывание только с помощью пипетки P1000. Не проводите вакуумную аспирацию.
    4. Храните пластины при температуре 4 °C в течение ночи для стабилизации матрицы, секретируемой REC.
  4. ДНКазная обработка субэндотелиального матрикса для удаления клеточного мусора (17-й день)
    1. Промойте субэндотелиальный матрикс с шага 2.3.4 800 мкл PBS/лунку.
    2. Аккуратно извлеките PBS и инкубируйте матрицу с 200 мкл свободной от РНКазы DNазы I (30 тыс. единиц) при 37 °C в течение 30 минут, чтобы удалить все следы клеточного мусора. Проверьте эффективность ДНКазного лечения, тщательно изучив клеточный мусор под фазово-контрастным микроскопом.
    3. Аккуратно удалите раствор ДНКазы I и дважды промойте субэндотелиальный матрикс 800 мкл PBS/лунка.
    4. Убедитесь, что макромасштабный фиброзный субэндотелиальный матрикс виден под фазово-контрастным микроскопом (10-кратное увеличение). Для визуализации более тонких наноразмерных матричных волокон требуется топографическое сканирование с помощью АСМ или конфокальная визуализация с высоким разрешением иммунометированных матричных белков при 100-кратном увеличении.
    5. Немедленно используйте свежий (нефиксированный) субэндотелиальный матрикс для измерения жесткости АСМ.
    6. После измерения АСМ зафиксировать образцы матрицы 1% (v/v) параформальдегида (15 мин при комнатной температуре) и хранить при температуре 4 °C для иммуномечения антителами против белков субэндотелиального матрикса и/или сшивающих ферментов.

3. Измерение жесткости АСМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол, адаптированный из стандартного руководства пользователя АСМ и представленный в недавних исследованиях 4,5, подробно описывает сбор и анализ данных о жесткости из капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса с использованием АСМ и программного обеспечения для анализа данных. Несмотря на то, что описанные ниже шаги основаны на конкретной модели АСМ (см. Таблицу материалов), основные принципы в целом применимы ко всем моделям АСМ.

  1. Выбор консольного преобразователя
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для мягких биологических образцов требуются мягкие консоли, которые могут изгибаться при вдавливании образца, в то время как размеры зонда подбираются в соответствии с размерами образца.
    1. Для измерения жесткости сосудов сетчатки мыши диаметром 5-8 мкм используют консольный зонд радиусом 1 мкм с пружинной постоянной (k) 0,2-0,3 Н/м. Для измерения жесткости субэндотелиального матрикса, состоящего из наноразмерных волокон, используют консольный зонд радиусом 70 нм с пружинной постоянной (k) 0,06-0,1 Н/м.
  2. Консольный монтаж
    1. На компьютере АСМ откройте программное обеспечение, управляющее блоком АСМ и камерой, прикрепленной к фазово-контрастному микроскопу, который используется для визуализации кантилевера и образца.
    2. Закрепите держатель кантилевера на подставке для смены кантилевера и установите выбранный кантилевер на держатель с помощью щипцов часовщика под стереоскопом, не повреждая консоль. Затяните винт на держателе, чтобы зафиксировать консоль.
    3. Установите и зафиксируйте держатель консольного крепления на головке АСМ, которая лежит на подставке.
    4. Используя функцию шагового двигателя в программном обеспечении АСМ, отведите головку АСМ в самую высокую точку и установите это положение в качестве нулевой точки в программном обеспечении. Этот шаг предотвращает случайное попадание кантилевера АСМ в предметный столик во время монтажа головки АСМ (следующий шаг).
    5. Осторожно поднимите головку АСМ со стойки и установите ее на предметный столик АСМ, поместив ножки в соответствующие пазы.
  3. Лазерная юстировка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная юстировка лазера выполняется без какого-либо образца (т.е. в воздушном режиме), так как она обеспечивает более точное выравнивание лазерного луча на кончике кантилевера (предотвращая лазерное преломление в жидкости). Однако, поскольку биологические образцы погружаются в среду, которая имеет другой показатель преломления, чем воздух, важно перенастроить лазер в среде перед измерением жесткости.
    1. Для юстировки лазера в воздухе поместите головку АСМ на предметный столик и используйте объектив с 10-кратным увеличением и прикрепленную камеру для визуализации кантилевера на мониторе в режиме реального времени. Инфракрасный лазер скрыт от глаз пользователя, но виден с помощью ПЗС-камеры.
    2. Выберите функцию силовой спектроскопии контактного режима в программном обеспечении и откройте окно под названием Лазерная юстировка.
    3. С помощью двух винтов, отмеченных лазерной боковой направленностью на головке АСМ, сфокусируйте лазерный луч на консоль таким образом, чтобы значение SUM в окне лазерной юстировки было максимальным. Для этого сфокусируйте лазер в центре кантилевера или вокруг него.
    4. С помощью регулировочных винтов Детектор настройте фотоприемник так, чтобы лазерное пятно находилось в центре окна лазерной юстировки.
    5. С помощью винта регулировки зеркала отрегулируйте зеркало так, чтобы значение SUM было максимально возможным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое значение SUM обеспечивает чувствительную и точную оценку жесткости образца. Таким образом, для получения наибольшего значения СУММ необходимо выполнить как лазерную юстировку, так и юстировку зеркала.
    6. Затем для лазерного выравнивания в жидкости добавьте нужную питательную среду в чашку и надежно закрепите ее на столике, чтобы предотвратить вибрацию или дрейф, которые создают артефакты измерения во время вдавливания образца.
    7. Глядя на прямую трансляцию с камеры, сфокусированной на консоли, опустите ее в жидкость с помощью функции шагового двигателя.
    8. Повторите шаги 3.3.4 и 3.3.5, чтобы убедиться, что значение SUM остается максимальным, а лазерное пятно находится в центре окна лазерной юстировки.
  4. Калибровка постоянной консольной пружины
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что консольные щупы поставляются с откалиброванной производителем пружинной постоянной (k), рекомендуется самостоятельно проверить ее значение (в жидкости) перед началом измерения. Используйте чистую стеклянную поверхность, которая сводит к минимуму взаимодействие между консольным щупом и стеклянной поверхностью.
    1. Заданное усилие, прилагаемое консолью, устанавливает максимальное отклонение лазера от консоли, которое допускается для силового отступа. Установите его изначально на 1,5 В. Если консоль не может приблизиться с заданным заданным значением силы, увеличивайте ее постепенно, пока образец не углубится и не создаст кривую вдавливания.
    2. Длина Z означает максимальное расстояние, на которое Z-пьезо отступает после того, как консоль достигнет заданного значения во время вдавливания образца. Длина Z должна быть по крайней мере достаточной для обеспечения четкого отделения консольного зонда от образца. Для калибровки постоянной пружины на стеклянной поверхности установите длину Z на 1 мкм.
    3. Скорость Z относится к скорости, с которой z-пьезо перемещает консоль вертикально вниз к образцу во время силового вдавливания. Она должна быть оптимизирована, потому что очень низкая скорость в первую очередь отражает вязкие свойства образца, в то время как очень высокая скорость в первую очередь отражает упругие свойства. Ожидается, что оптимальная скорость позволит зафиксировать истинную вязкоупругую природу биологических образцов. Установите скорость Z равной 2 мкм/с для вязкоупругих биологических образцов.
    4. Высота цели в диапазоне Z указывает приблизительное расстояние от образца, на котором находится z-пьезо после измерения кривой силы и перед перемещением в другое место на образце. Целевая высота диапазона Z должна быть больше, чем высота образцовых объектов. Установите высоту цели в диапазоне Z на уровне 7,5 мкм.
    5. Используя функцию Step Motor , поднесите кантилевер достаточно близко к поверхности образца (судя по фокусу на фазово-контрастном изображении при 10-кратном увеличении) перед выбором функции Approach в окне силовой спектроскопии контактного режима, чтобы опустить кантилевер с меньшим шагом 15 мкм.
    6. Нажмите кнопку Захватить, чтобы захватить силовую кривую.
    7. Выберите кривую силы, откройте ее в окне диспетчера калибровки и выберите Контактный режим в разделе метода.
    8. С помощью функции "Выбрать диапазон втягивания " выберите кривую втягивания кантилевера для подгонки линейной кривой. Затем установите флажок Sensitivity Check , чтобы преобразовать единицу силы из V в N.
    9. Поднимите консоль на 100-200 мкм в жидкости и выберите функцию Thermal Noise (Тепловой шум ). Опять же, используя Select Fit Range, подгоньте колоколообразную кривую теплового шума под кривую Лоренца. После подгонки кривой выберите поле Постоянная пружины (k). Убедитесь, что постоянная пружины (k) близка к значению производителя, и запишите его для использования в будущем. После калибровки единица измерения для заданного значения изменится с мВ на нН.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой шум — это собственная частота кантилевера при определенной температуре. Для точного измерения постоянной пружины требуется поправка на тепловой шум.
  5. Получение кривых сила-расстояние
    1. Поместите образец на предметном стекле (сосуды сетчатки или субэндотелиальный матрикс) на столик АСМ и выберите «Контактный режим: силовая спектроскопия » в разделе экспериментов программного обеспечения.
    2. Установите уставку силы на 0,5 нН и нажмите кнопку Approach, которая значительно выше, чем тепловое отклонение кантилеверов SAA-SPH 1 мкм и PFQNM-LC-A 70 нм, что обеспечивает плавный подход кантилевера к образцу.
    3. После того как консоль обнаружит поверхность и вернется на заданную высоту в состоянии покоя, установите заданное значение на 0,2 нН для более жесткого консольного зонда SAA-SPH 1 мкм или 0,1 нН для более мягкого консольного зонда PFQNM-LC-A 70 нм. Такая регулировка заданного значения гарантирует, что как жесткие, так и мягкие консоли легко изгибаются во время вдавливания образца (см. раздел 3.1).
    4. Установите длину Z на ~2,5 мкм, чтобы обеспечить чистое отделение кантилевера от биологических образцов во время втягивания (см. шаг 3.4.2) и скорость Z на уровне 2 мкм/с (см. шаг 3.4.3).
    5. С помощью винтов на столике АСМ осторожно расположите консольный зонд в нужном месте образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку капилляры не всегда распространяются горизонтально на предметном стекле, перед перемещением предметного столика можно безопасно отвести консоль еще на 10-20 мкм от целевой высоты в состоянии покоя.
    6. Нажмите кнопку Подход, чтобы сначала приблизить консоль к образцу, а затем нажмите кнопку Захватить, чтобы захватить силовые кривые для нужных местоположений. Сохраните все силовые кривые для анализа.
  6. Анализ данных
    1. Откройте кривую силы в программном обеспечении для обработки данных.
    2. Выберите кривую силы втягивания для анализа данных (аналогично шагу 3.4.8).
    3. С помощью функции сглаживания данных сгладьте силовую кривую с помощью фильтра Гаусса, чтобы удалить нежелательный шум в полученных данных.
    4. Используя функцию вычитания Базовая линия, установите значение наклона и величину (бесконтактной) базовой части силовой кривой на ноль.
    5. Нажмите на функцию « Точка контакта », чтобы автоматически привести точку контакта силовой кривой к координатам (0,0) по осям X и Y.
    6. С помощью функции Vertical Tip Position (Положение вертикального наконечника ) рассчитайте фактическое вертикальное положение кантилевера по оси Y с поправкой на отступ образца.
    7. На обработанной силовой кривой примените функцию Упругость при подгонке , сначала выбрав форму и радиус наконечника (на основе выбранного консольного преобразователя), а затем подогнав силовую кривую с помощью модели Герца/Снеддона.
      1. Если отступ матрицы на пробнике радиусом 70 нм превышает 70 нм, что обычно имеет место, выберите форму наконечника Paraboloid . Для измерения капиллярной жесткости вдавливание образца с помощью зонда радиусом 1 μм никогда не превышает 1 μм, поэтому выберите форму зонда Sphere . Кроме того, если точка контакта подогнанной кривой не совпадает с точкой контакта фактической кривой втягивания, установите флажок Кривая сдвига .
    8. Запишите и сохраните значение модуля Юнга (жесткости).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Капилляры сетчатки мыши
Измерение жесткости АСМ изолированных капилляров сетчатки включает в себя этапы обработки образцов, которые потенциально могут повредить их механоструктурную целостность. Чтобы предотвратить это и тем самым обеспечить осуществимость, надежность и...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

ОВМ широко используется для измерения связанных с заболеванием изменений жесткости крупных сосудов, таких как аорта и артерии16. Эти результаты помогли установить роль эндотелиальной механобиологии в развитии сердечно-сосудистых осложнений, таких как атеросклероз

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального института глаза/NIH R01EY028242 (К.Г.), Премией Катализатора Международного фонда исследований сетчатки за инновационные подходы к исследованию ВМД (К.Г.), Специальным грантом Инициативы Стивена Райана по исследованиям желтого пятна (RIMR) от Фонда В.М. Кека (для Института глаза Дохени), а также стипендией Урсулы Мандель и стипендией Совета выпускников Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (для I.S.T.). Эта работа также была поддержана неограниченным грантом от Research to Prevent Blindness, Inc. для отделения офтальмологии в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. Содержание этой статьи является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filterMerck MilliporeSLGVM33RSLow Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesiumCorning20-031-CVFinal concentration 1X, pH 7.4
12-well plateFalcon Corning353043
15 mL centrifuge tubeCorning430791Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringeBD302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipetteFisherBrand13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture DishFalcon Corning353002
6-well plateFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL PenScientific Device Laboratory9804-02
Blade holderX-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10Bard-Parker371110
Dental WaxElectron Microscopy Sciences50-949-027
Dissecting microscopeAm-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%Millipore SigmaHT501128-4LFinal concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissueKimtech Science34133
Micro spatulaFine Science Tools10089-11
Orbital ShakerLab GeniusSK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  TweezerTed Pella, Inc.5667
Phase contrast microscopeNikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetLabconco302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mLEppendorf22363352
StereoscopeAmScopeSM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mmFisherBrand1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology GradeVWRE553-500MLpH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture GradeVWRVWRV0458-25G10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology GradeCorning46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBSCorning20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesiumThermo Fisher Scientific14040-117pH 7.4
Ammonium hydroxideSigma-Aldrich338818
Ascorbic AcidSigma-AldrichA4034
Collagen IV antibodyNovus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
EthanolamineSigma-Aldrich398136
Fibronectin antibodySigma-AldrichF6140
FluoromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
GelatinSigma-AldrichG1890
Glass coverslips (12mm)Fisher12-541-000
GlutaraldehydeElectron microscopy Sciences16220
Human retinal endothelial cells (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 mediumCorning15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)Cell BiologicsC57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Scientific BP151-100
TrypsinGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM Measurement
1 µm ProbeBrukerSAA-SPH-1UMA 19 micron tall hemispherical probe with 1
micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probeBrukerPFQNM-LC-V2A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,
 Spring constant 0.1N/m
 cameraXCAM familyToupcam1080P HDMI
Desktop to run the cameraAsusAsus desktopIntel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslipCellvisD29-14-1.5-N29mm glass bottom dish with
 14 mm micro-well
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscopeZeissAxiovert 200Inverted microscope with 10X objective

Ссылки

  1. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).
  2. Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy. Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).
  3. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  4. Chandrakumar, S., et al. Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes. Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).
  5. Chandrakumar, S., et al. Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes. Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).
  6. Yang, X., et al. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes. FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).
  7. Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology. Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).
  8. Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic. Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).
  9. Ghosh, K., Ingber, D. E. Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).
  10. Yang, X., et al. Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).
  11. Cabrera, A. P., et al. Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).
  12. Cabrera, A. P., et al. Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration. J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).
  13. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).
  14. Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. (76), e50489(2013).
  15. Beacham, D. A., et al. Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts. Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).
  16. Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy. J Vis Exp. (116), e54630(2016).
  17. Huynh, J., et al. Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration. Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).
  18. Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature. Microvasc Res. 154, 104682(2024).
  19. Chaqour, B., et al. Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1. Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).
  20. Ashraf, M., et al. Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).
  21. Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy. FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены