Выделение капилляров сетчатки мыши и субэндотелиального матрикса для измерения жесткости с помощью атомно-силовой микроскопии

Резюме

Недавно мы определили ригидность капилляров сетчатки как новую парадигму дисфункции сетчатки, связанной с диабетом. В этом протоколе подробно описаны этапы выделения капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши из эндотелиальных культур сетчатки с последующим описанием методики измерения жесткости с помощью атомно-силовой микроскопии.

Аннотация

Капиллярная дегенерация сетчатки является клиническим признаком ранних стадий диабетической ретинопатии (ДР). Наши недавние исследования показали, что индуцированное диабетом ригидность капилляров сетчатки играет решающую и ранее непризнанную причинно-следственную роль в воспалительной дегенерации капилляров сетчатки. Увеличение жесткости капилляров сетчатки происходит в результате гиперэкспрессии лизилоксидазы, фермента, который сшивает и укрепляет субэндотелиальный матрикс. Поскольку ожидается, что борьба с ДР на ранней стадии предотвратит или замедлит прогрессирование ДР и связанную с ней потерю зрения, субэндотелиальный матрикс и жесткость капилляров представляют собой актуальные и новые терапевтические мишени для раннего лечения ДР. Кроме того, прямое измерение жесткости капилляров сетчатки может послужить важным этапом доклинической валидации для разработки новых методов визуализации для неинвазивной оценки жесткости капилляров сетчатки у животных и людей. Учитывая эту точку зрения, мы представляем подробный протокол для изоляции и измерения жесткости капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши с помощью атомно-силовой микроскопии.

Введение

Капилляры сетчатки необходимы для поддержания гомеостаза сетчатки и зрительной функции. Действительно, их дегенерация на ранних стадиях диабета тесно связана с развитием угрожающих зрению осложнений диабетической ретинопатии (ДР), микрососудистого заболевания, которое поражает почти 40% всех людей с диабетом¹. Воспаление сосудов вносит значительный вклад в капиллярную дегенерацию сетчатки при ДР. Прошлые исследования продемонстрировали важную роль аберрантных молекулярных и биохимических сигналов в воспалении сосудов сетчатки, вызванном диабетом ^2,3. Тем не менее, ....

протокол

Все процедуры на животных были выполнены в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и одобрены Институциональными комитетами по использованию животных и ухода за ними (IACUC; номер протокола ARC-2020-030) в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (номер A3196-01 учреждения OLAW по обеспечению благополучия животных). Следующий протокол был выполнен с использованием капилляров сетчатки, выделенных от взрослых (20-недельных) самцов мышей C57BL/6J весом ~25 г (мыши с диабетом) и ~32 г (мыши без диабета; Лаборатория Джексона).

Результаты

Капилляры сетчатки мыши
Измерение жесткости АСМ изолированных капилляров сетчатки включает в себя этапы обработки образцов, которые потенциально могут повредить их механоструктурную целостность. Чтобы предотвратить это и тем самым обеспечить осуществимость, надежность и.......

Обсуждение

ОВМ широко используется для измерения связанных с заболеванием изменений жесткости крупных сосудов, таких как аорта и артерии¹⁶. Эти результаты помогли установить роль эндотелиальной механобиологии в развитии сердечно-сосудистых осложнений, таких как атеросклероз

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective