Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie

Zusammenfassung

Vor kurzem haben wir die retinale Kapillarversteifung als neues Paradigma für retinale Dysfunktion im Zusammenhang mit Diabetes identifiziert. In diesem Protokoll werden die Schritte zur Isolierung von retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix aus retinalen Endothelkulturen erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der Steifigkeitsmesstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie.

Zusammenfassung

Die retinale Kapillardegeneration ist ein klinisches Kennzeichen der frühen Stadien der diabetischen Retinopathie (DR). Unsere jüngsten Studien haben gezeigt, dass die diabetesinduzierte retinale Kapillarversteifung eine entscheidende und bisher unerkannte kausale Rolle bei der entzündungsvermittelten Degeneration der retinalen Kapillaren spielt. Die Zunahme der Steifigkeit der retinalen Kapillaren resultiert aus der Überexpression von Lysyloxidase, einem Enzym, das die subendotheliale Matrix vernetzt und versteift. Da davon ausgegangen wird, dass die Behandlung von DR im Frühstadium das Fortschreiten der DR und den damit verbundenen Sehverlust verhindert oder verlangsamt, stellen die subendotheliale Matrix und die Kapillarsteifigkeit relevante und neuartige therapeutische Ziele für die frühe DR-Behandlung dar. Darüber hinaus kann die direkte Messung der retinalen Kapillarsteifigkeit als entscheidender präklinischer Validierungsschritt für die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren zur nicht-invasiven Beurteilung der retinalen Kapillarsteifigkeit bei Tieren und Menschen dienen. Vor diesem Hintergrund stellen wir hier ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus mittels Rasterkraftmikroskopie zur Verfügung.

Einleitung

Netzhautkapillaren sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Sehfunktion der Netzhaut unerlässlich. Tatsächlich ist ihre Degeneration bei Diabetes im Frühstadium stark an der Entwicklung von sehkraftbedrohenden Komplikationen der diabetischen Retinopathie (DR) beteiligt, einer mikrovaskulären Erkrankung, von der fast 40 % aller Menschen mit Diabetes betroffen^{sind 1}. Vaskuläre Entzündungen tragen signifikant zur retinalen Kapillardegeneration bei DR bei. Frühere Studien haben gezeigt, dass aberrante molekulare und biochemische Signale bei Diabetes-induzierten retinalen Gefäßentzündungen eine wichtige Rolle spielen ^2,3. Neuere Arbeiten haben jedoch ein neues Paradigma für die DR-Pathogenese eingeführt, das die Versteifung der retinalen Kapillaren als eine entscheidende, aber bisher unerkannte Determinante der retinalen Gefäßentzündung und -degeneration identifiziert ^4,5,6.

Insbesondere wird die diabetesinduzierte Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit durch die Hochregulierung des Kollagenvernetzungsenzyms Lysyloxidase (LOX) in retinalen Endothelzellen (ECs) verursacht, das die subendotheliale Matrix (Basalmembran) versteift4,5,6. Die Matrixversteifung wiederum versteift die darüber liegenden retinalen ECs (aufgrund mechanischer Reziprozität), was zu einer allgemeinen Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit führt⁴. Entscheidend ist, dass diese diabetesinduzierte Kapillarversteifung der Netzhaut allein die Aktivierung der Netzhaut-EC und den entzündungsvermittelten EC-Tod fördern kann. Diese mechanische Regulation von retinalen EC-Defekten kann auf eine veränderte endotheliale Mechanotransduktion zurückgeführt werden, den Prozess, bei dem mechanische Signale in biochemische Signale umgewandelt werden, um eine biologische Reaktion hervorzurufen ^7,8,9. Wichtig ist, dass veränderte mechanische EC-Signale und die subendotheliale Matrixstruktur auch mit der choroidalen Gefäßdegeneration in Verbindung mit der frühen altersbedingten Makuladegeneration (AMD) in Verbindung gebracht wurden10,11,12, was die breiteren Auswirkungen der vaskulären Mechanobiologie auf degenerative Netzhauterkrankungen belegt.

Bemerkenswert ist, dass eine Versteifung der retinalen Kapillaren früh bei Diabetes auftritt, was mit dem Auftreten einer Netzhautentzündung zusammenfällt. Daher kann die Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit sowohl als therapeutisches Ziel als auch als früher diagnostischer Marker für DR dienen. Zu diesem Zweck ist es wichtig, zuverlässige und direkte Steifigkeitsmessungen der retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix zu erhalten. Dies kann durch die Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (Rasterkraftmikroskops) erreicht werden, das eine einzigartige, empfindliche, genaue und zuverlässige Technik zur direkten Messung der Steifigkeit von Zellen, extrazellulärer Matrix und Geweben bietet¹³. Ein AFM übt eine winzige Eindringkraft (Nanonewton) auf die Probe aus, deren Steifigkeit das Ausmaß bestimmt, in dem sich der eindrückende AFM auslegert – je steifer die Probe, desto mehr biegt sich der Cantilever, und umgekehrt. Wir haben AFM ausgiebig eingesetzt, um die Steifigkeit von kultivierten Endothelzellen, subendothelialen Matrizen und isolierten retinalen Kapillaren der Maus zu messen 4,5,6,11,12. Diese Messungen der AFM-Steifigkeit haben dazu beigetragen, die endotheliale Mechanobiologie als Schlüsseldeterminante der DR- und AMD-Pathogenese zu identifizieren. Um den Anwendungsbereich der Mechanobiologie in der Sehforschung zu erweitern, stellen wir hier eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von AFM für Steifigkeitsmessungen von isolierten retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus zur Verfügung.

Protokoll

Alle Eingriffe an Tieren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung durchgeführt und von den Institutional Animal and Care Use Committees (IACUC; Protokollnummer ARC-2020-030) an der University of California, Los Angeles (OLAW Institution Animal Welfare Assurance Number A3196-01) genehmigt. Das folgende Protokoll wurde mit Netzhautkapillaren durchgeführt, die von adulten (20 Wochen alten) männlichen C57BL/6J-Mäusen mit einem Gewicht von ~25 g (diabetische Mäuse) und ~32 g (nichtdiabetische Mäuse; Jackson Laboratory).

1. Isolierung von retinalen Kapillaren der Maus für die Messung der AFM-Steifigkeit (Tage 1-4)

HINWEIS: Dieses Protokoll, über das in einer kürzlich durchgeführten Studie^{berichtet wurde 4}, beschreibt die Enukleation und milde Fixierung des Mausauges, die Netzhautisolierung und den Trypsinverdau sowie die anschließende Montage des resultierenden retinalen Gefäßsystems auf Mikroskopieobjektträgern zur Messung der AFM-Steifigkeit.

1. Enukleation und milde Fixierung (Tag 1)
   1. Nachdem Sie die Maus mit Kohlendioxid-Exposition und anschließender Zervixluxation eingeschläfert haben, führen Sie eine Mikrozange hinter dem Augapfel ein, halten Sie den Muskelansatz fest und ziehen Sie das Auge vorsichtig heraus, ohne die Mikrozange zu fest einzuklemmen, was den Sehnerv durchtrennen könnte.
   2. Legen Sie das enukleierte Auge für 24 Stunden bei 4 °C in 5% (v/v) Formalin in PBS für eine milde Fixierung.
      HINWEIS: Basierend auf Erfahrung⁴ führen unfixierte oder leichter fixierte Augen zu fragilen Kapillaren, die während der AFM-Probenvorbereitung und der Steifigkeitsmessung fragmentiert werden.
2. Retinale Isolation (Tag 2)
   1. Platzieren Sie das fixierte Auge auf einem Blatt Wachspapier unter einem Präpariermikroskop. Halten Sie anschließend mit einer Mikrozange die Reste des Muskels und des Sehnervs an der Außenseite des hinteren Auges fest und richten Sie das Auge so aus, dass die Hornhaut zu einer Seite zeigt (Abbildung 1).
   2. Mit einer chirurgischen Klinge einen Schnitt 1-2 mm hinter und parallel zum Limbus (Hornhaut-Sklera-Übergang) vornehmen. Während Sie das Auge mit der Mikrozange an Ort und Stelle halten, üben Sie mit der Klinge eine Kraft nach unten aus und drücken Sie weiter, bis das vordere Segment des Auges vollständig vom hinteren Ende getrennt ist (Abbildung 1). Entsorgen Sie den vorderen Augenabschnitt und die Linse. Sägen Sie nicht hin und her, da dies zu Netzhautschäden führen kann.
   3. Übertragen Sie den hinteren Augenabschnitt (Sklera, Aderhaut und Netzhaut) in eine 6 cm große Schale, die mit PBS (pH 7,4) gefüllt ist.
   4. Mit einem Mikrospatel und gleichzeitigem sanften Halten des Sehnervs mit einer Mikrozange die Netzhaut aushöhlen. Lagern Sie die Netzhaut in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das PBS enthält, bei 4 °C bis zur Kapillarisolierung.
       
3. Netzhaut-Spülungen
   1. Um eine Netzhaut zu spülen, füllen Sie sechs Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit 1 ml doppelt destilliertem H₂O (ddH₂O). Übertragen Sie anschließend mit einer umgekehrten Pasteurpipette die Netzhaut aus dem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in die erste Vertiefung.
   2. Spülen Sie die Netzhaut auf dem Orbitalschüttler 30 Minuten lang bei 120 U/min bei Raumtemperatur (RT) ab.
   3. Pipettieren Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig Wasser in der Nähe der Netzhaut auf und ab und blasen Sie Wasser auf die Netzhaut, um eine sanfte Bewegung zu verursachen.
   4. Übertragen Sie die Netzhaut mit der umgekehrten Glaspipette in die zweite Vertiefung und wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 und 1.3.3 4 Mal, wobei jede Spülung in einer frischen (ddH₂O-haltigen) Vertiefung durchgeführt wird.
   5. Übertragen Sie schließlich die Netzhaut in die sechste Vertiefung und spülen Sie sie über Nacht (O/N) bei RT auf dem auf 100 U/min eingestellten Orbitalschüttler, um die Trennung der retinalen Neuroglia von den Blutgefäßen während der Trypsinverdauung zu erleichtern.
4. Retinale Trypsin-Verdauung (Tag 3)
   1. Bereiten Sie eine 10%ige (w/v) Trypsinlösung vor, indem Sie Trypsin 1:250 Pulver in Tris-Puffer (pH 8; 0,1 M) auflösen. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das konische Röhrchen mehrmals umdrehen, um die Blasenbildung zu minimieren, die es schwieriger macht, die Trypsinlöslichkeit zu bestätigen.
   2. Die 10%ige Trypsinlösung in einem 37 °C warmen Wasserbad für 10-15 min äquilibrieren. Sobald sich das Trypsinpulver vollständig aufgelöst hat, filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,2 μm Spritzenfilter.
   3. Geben Sie in eine 12-Well-Platte 2 ml/Well/Netzhaut der gefilterten 10%igen Trypsinlösung. Geben Sie etwas zusätzliche Trypsinlösung in die benachbarte Vertiefung (um die Glaspipettenwände für die nachfolgenden Schritte auszugleichen).
   4. Geben Sie 3 mL ddH₂O in drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte (widmen Sie diese drei Vertiefungen einer Netzhaut).
   5. Führen Sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen eine P200-Spitze ein, bevor Sie 4 ml der filtrierten 10%igen Trypsinlösung hinzufügen. Übertragen Sie diesen konischen Schlauch in das 37 °C warme Bad, damit die Spitze 2-3 Minuten lang in Trypsin eingeweicht werden kann, da dies verhindert, dass die Netzhaut in den letzten Schritten an den Spitzenwänden kleben bleibt.
   6. Nach der O/N-Spülung der Netzhaut (aus Schritt 1.3.5) pipettieren Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig Wasser neben der Netzhaut auf und ab, wobei Sie Wasser auf die Netzhaut spritzen, um eine sanfte Bewegung zu verursachen.
   7. Übertragen Sie die gespülte Netzhaut mit einer umgekehrten Glaspipette in die trypsinhaltige Vertiefung der 12-Well-Platte (aus Schritt 1.4.3). Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut mit einer minimalen Menge an restlichem ddH₂O übertragen wird, um die Trypsinlösung nicht signifikant zu verdünnen. 3 h bei 37 °C inkubieren.
   8. Zentrieren Sie die mit Trypsin getränkte P200-Spitze (aus Schritt 1.4.5) auf dem Bereich des Sehnervs und pipettieren Sie vorsichtig das gesamte Gefäßnetz auf und ab, um das nichtvaskuläre Gewebe¹⁴ zu dissoziieren.
   9. Mit einer in Trypsin vorgespülten Invertglaspipette (durch 5-maliges Auf- und Abpipettieren von Trypsin) das retinale Gefäßsystem in die erste ddH₂O-haltige Vertiefung der 6-Well-Platte (aus Schritt 1.4.4) übertragen.
   10. Schwenken Sie die Platte und pipettieren Sie das Gefäßsystem mit einer mit Trypsin gespülten Glaspipette auf und ab, um restliches nicht-vaskuläres Gewebe zu entfernen.
   11. Übertragen Sie das retinale Gefäßsystem mit der Glaspipette in die zweite ddH2O-haltige Vertiefung der 6-Well-Platte und lagern Sie es bei 4 °C, bis es für die AFM-Steifigkeitsmessung auf dem Objektträger montiert wird.
       HINWEIS: Das hydratisierte retinale Gefäßsystem (bei PBS) ist bei 4 °C bis zu 2 Wochen lang strukturell intakt. Routinemäßige Steifigkeitsmessungen sollten jedoch an frisch isolierten Kapillaren durchgeführt werden.
5. Befestigung des retinalen Gefäßsystems für die Messung der AFM-Steifigkeit (Tag 4)
   1. Übertragen Sie das retinale Gefäßsystem mit einer invertierten Trypsin-gespülten Glaspipette in die dritte ddH₂O-haltige Vertiefung der 6-Well-Platte, um alle verbleibenden Trypsinlösungen zu entfernen.
   2. Reinigen Sie gründlich (mit ddH₂O und Wischergewebe) einen geladenen Oberflächenmikroskopie-Objektträger, der für die Montage des Gefäßnetzwerks für die Messung der AFM-Steifigkeit verwendet wird.
      HINWEIS: Die geladene Oberfläche des Objektträgers sorgt für eine starke Bindung des Gefäßnetzes während der AFM-Messung.
   3. Beschriften Sie die Folie und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen 4-5 cm breiten kreisförmigen Bereich um die Mitte, um ein Verschütten von Wasser in den folgenden Schritten zu vermeiden.
   4. Übertragen Sie das retinale Gefäßsystem vorsichtig mit einer mit Trypsin gespülten Glaspipette in die Mitte des markierten Bereichs.
   5. Entfernen Sie mit einer P200-Pipette vorsichtig so viel überschüssiges Wasser wie möglich von einer Kante, ohne versehentlich das Gefäßsystem in die Spitze zu saugen.
   6. Legen Sie die Rutsche in eine Biosicherheitswerkbank (BSL-2 Haube) nahe der Vorderseite (gefiltertes Gewebe) und lassen Sie das Restwasser verdunsten.
   7. Sobald das Gefäßsystem fast trocken ist, rehydrieren Sie es vorsichtig unter einem Phasenkontrastmikroskop (4-fache Vergrößerung), indem Sie ddH₂O mit einer P200-Pipette langsam auf eine Seite des markierten Bereichs geben. Die direkte Zugabe von ddH₂O auf das Gefäßsystem führt dazu, dass es sich ablöst.
   8. Nehmen Sie Phasenkontrastbilder des rehydrierten Gefäßsystems bei 4- und 20-facher Vergrößerung auf, um sicherzustellen, dass es eine gute strukturelle Integrität aufweist und richtig ausgebreitet (nicht auf sich selbst gefaltet) und am Objektträger befestigt ist, was ein wesentliches Kriterium für eine zuverlässige Messung der AFM-Steifigkeit ist.

2. Gewinnung einer subendothelialen Matrix aus retinalen mikrovaskulären Endothelzellkulturen (REC) (Tage 1-17)

HINWEIS: Dieses Protokoll, adaptiert von Beacham et al.¹⁵ und in neueren Studien^{berichtet 4,5,6}, beschreibt die REC-Kultur auf modifizierten Glasdeckgläsern, gefolgt von einer Dezellularisierung, um eine subendotheliale Matrix für die anschließende Messung der AFM-Steifigkeit zu erhalten.

1. Vorbereitung von gelatinebeschichteten Glasdeckgläsern und Zellbeschichtung (Tag 1)
   HINWEIS: Führen Sie die Gelatinebeschichtung und die nachfolgenden PBS⁺⁺-Spülschritte in einer Gewebekulturhaube durch, bevor Sie für die nachfolgenden Schritte der Glutaraldehyd- und Ethanolaminbehandlung zu einer chemischen Abzugshaube wechseln.
   1. Legen Sie ein autoklaviertes rundes Glasdeckglas mit einem Durchmesser von 12 mm auf eine Mulde einer sterilen 24-Well-Platte und fügen Sie 500 μl vorgewärmte sterile 0,2 % (w/v) Gelatine hinzu (verdünnt in PBS mit Kalzium und Magnesium; PBS⁺⁺) zu jeder Vertiefung mit Deckglas. 1 h bei 37 °C inkubieren.
   2. Aspirieren Sie die Gelatinelösung, spülen Sie die Deckgläser einmal mit sterilem PBS⁺⁺ ab und vernetzen Sie die beschichtete Gelatine durch Zugabe von 500 μl 1% (v/v) Glutaraldehyd für 30 min bei RT.
   3. Sammeln und entsorgen Sie die Glutaraldehydlösung ordnungsgemäß (gemäß den institutionellen Richtlinien), bevor Sie die Deckgläser 5 Minuten lang mit PBS⁺⁺ auf einem Orbitalschüttler bei 100 U/min in RT spülen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt 5 Mal. Heben Sie während der ersten drei Spülgänge die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette an, um das Glutaraldehyd gründlich abzuspülen. Jede Restmenge kann die Lebensfähigkeit der Zellen verringern.
   4. Geben Sie 800 μl 1 M Ethanolamin für 30 min bei RT in das gelatinevernetzte Deckglas, um alle verbleibenden Spuren von Glutaraldehyd in der Vertiefung zu löschen.
   5. Sammeln und entsorgen Sie die Ethanolaminlösung ordnungsgemäß (gemäß den institutionellen Richtlinien) und spülen Sie die Deckgläser 5 Mal mit PBS⁺⁺ für 5 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei 100 U/min in RT. Heben Sie während der ersten drei Spülgänge die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette an, um das Ethanolamin gründlich spülen zu können. Jede Restmenge kann die Lebensfähigkeit der Zellen verringern.
   6. Die vernetzten Deckgläser sind nun bereit für die Zellbeschichtung.
      HINWEIS: Obwohl wir Zellen routinemäßig unmittelbar nach der Deckglasvorbereitung plattieren, kann es sich lohnen, die Zellbeschichtung auf vernetzten Gelatine-Deckgläsern zu vergleichen, die 1-2 Tage lang in PBS⁺⁺ bei 4 °C gelagert wurden.
   7. Unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube werden retinale mikrovaskuläre Endothelzellen (RECs) in 500 μl Medium/Well mit einer Dichte plattiert, die innerhalb von 24 h eine Konfluenz von 100 % erreicht, wie durch Phasenkontrastmikroskopie bestätigt wurde.
      HINWEIS: Das Erreichen der Konfluenz innerhalb von 24 Stunden ist wichtig, da die resultierende REC-Ruhe die Fähigkeit der Zellen erhöht, Matrix zu sezernieren (siehe den folgenden Schritt). Nach unserer Erfahrung mit humanen RECs ist eine Plattierungsdichte von 4 x 10⁴ Zellen/^cm2 ausreichend, um innerhalb von 24 h eine Konfluenz zu erreichen. Da die REC-Größe jedoch je nach Spezies variiert (z. B. sind Maus-RECs deutlich kleiner), muss die anfängliche Plattierungsdichte möglicherweise optimiert werden.
2. Produktion subendothelialer Matrix durch REC-Kultur (Tag 2-16)
   1. Nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht haben (~24 h), ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, das mit sterilfiltrierter Ascorbinsäure (Endkonzentration von 200 μg/ml) ergänzt wird.
      HINWEIS: Jede REC-Behandlung mit Krankheitsrisikofaktoren (z. B. hoher Glukosespiegel, fortgeschrittene Glykationsendprodukte usw.) oder pharmakologischen Wirkstoffen kann jetzt zusammen mit der Ascorbinsäurebehandlung beginnen.
   2. Wechseln Sie das mit Ascorbinsäure ergänzte Nährmedium 15 Tage lang jeden zweiten Tag.
      HINWEIS: Ascorbinsäure ist in Lösung instabil. Bereiten Sie jeden zweiten Tag frische 100X-Stammlösung für eine mittlere Supplementierung zu.
3. Dezellularisierung von REC-Kulturen zur Gewinnung der subendothelialen Matrix (Tag 16)
   1. Entfernen Sie nach 15 Tagen Ascorbinsäure-Behandlung das Medium und spülen Sie die Zellen mit kalzium-/magnesiumfreiem PBS.
   2. Dezellularisieren Sie die REC-Kulturen durch Zugabe von 250 μl/pro Vertiefung warmem Dezellularisierungspuffer (20 mM Ammoniumhydroxid und 0,5 % Triton X-100 in PBS) für ~2-3 Minuten. Bestätigen Sie die Entnahme der Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop (10-fache Vergrößerung).
   3. Entfernen Sie vorsichtig den Dezellularisierungspuffer, ohne die REC-sezernierte subendotheliale Matrix zu stören, und geben Sie 0,5 ml PBS in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass sich die subendotheliale Matrix während dieses und der nachfolgenden Spülschritte nicht ablöst, führen Sie eine sanfte Spülung nur mit einer P1000-Pipette durch. Führen Sie keine Vakuumabsaugung durch.
   4. Lagern Sie die Platten über Nacht bei 4 °C, um die REC-sezernierte Matrix zu stabilisieren.
4. DNase-Behandlung der subendothelialen Matrix zur Entfernung von Zelltrümmern (Tag 17)
   1. Spülen Sie die subendotheliale Matrix aus Schritt 2.3.4 mit 800 μl PBS/Well.
   2. Entfernen Sie das PBS vorsichtig und inkubieren Sie die Matrix mit 200 μl RNase-freier DNase I (30 K Einheiten) bei 37 °C für 30 Minuten, um alle Spuren von Zelltrümmern zu entfernen. Überprüfen Sie die Wirksamkeit der DNase-Behandlung, indem Sie unter einem Phasenkontrastmikroskop sorgfältig nach Zelltrümmern suchen.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die DNase I-Lösung und spülen Sie die subendotheliale Matrix zweimal mit 800 μl PBS/Well.
   4. Prüfen Sie, ob die makroskalige fibröse subendotheliale Matrix unter einem Phasenkontrastmikroskop (10-fache Vergrößerung) sichtbar ist. Die Visualisierung der feineren nanoskaligen Matrixfasern erfordert topographisches AFM-Scanning oder hochauflösende konfokale Bildgebung von immunmarkierten Matrixproteinen bei 100-facher Vergrößerung.
   5. Verwenden Sie sofort die frische (unfixierte) subendotheliale Matrix für die Messung der AFM-Steifigkeit.
   6. Nach der AFM-Messung werden die Matrixproben mit 1 % (v/v) Paraformaldehyd fixiert (15 min bei Raumtemperatur) und bei 4 °C gelagert, um die Immunmarkierung mit Antikörpern gegen subendotheliale Matrixproteine und/oder vernetzende Enzyme zu ermöglichen.

3. Messung der AFM-Steifigkeit

HINWEIS: Dieses Protokoll, das an ein Standard-AFM-Benutzerhandbuch angepasst und in neueren Studien^{berichtet wurde 4,5}, beschreibt die Erfassung und Analyse von Steifigkeitsdaten aus retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen unter Verwendung einer AFM- und Datenanalysesoftware. Obwohl die unten beschriebenen Schritte auf einem bestimmten AFM-Modell basieren (siehe Materialtabelle), sind die zugrunde liegenden Prinzipien im Allgemeinen auf alle AFM-Modelle anwendbar.

1. Auswahl der Cantilever-Sonde
   HINWEIS: Weiche biologische Proben erfordern weiche Ausleger, die sich beim Eindrücken der Probe biegen können, während die Sondenabmessungen so gewählt werden, dass sie den Abmessungen der Probe entsprechen.
   1. Für die Steifigkeitsmessung von Netzhautgefäßen der Maus mit einem Durchmesser von 5 bis 8 μm ist eine Cantilever-Sonde mit einem Radius von 1 μm und einer Federkonstante (k) von 0,2 bis 0,3 N/m zu verwenden. Für die Steifigkeitsmessung einer subendothelialen Matrix, die aus nanoskaligen Fasern besteht, verwenden Sie eine Cantilever-Sonde mit einem Radius von 70 nm und einer Federkonstante (k) von 0,06-0,1 N/m.
2. Kragarm-Montage
   1. Öffnen Sie auf dem AFM-Computer die Software, die das AFM-Gerät und die Kamera steuert, die an ein Phasenkontrastmikroskop angeschlossen ist, das zur Visualisierung des Auslegers und der Probe verwendet wird.
   2. Befestigen Sie den Auslegerhalter auf dem Ausleger und montieren Sie den ausgewählten Ausleger mit einer Uhrmacherzange unter einem Stereoskop auf den Halter, ohne den Ausleger physisch zu beschädigen. Ziehen Sie die Schraube an der Halterung fest, um den Ausleger zu sichern.
   3. Setzen Sie den Auslegerhalter auf den AFM-Kopf, der auf dem Ständer ruht, und verriegeln Sie ihn.
   4. Ziehen Sie den AFM-Kopf mit der Schrittmotorfunktion in der AFM-Software auf den höchsten Punkt zurück und stellen Sie diese Position in der Software auf Nullpunkt ein. Dieser Schritt verhindert, dass der AFM-Ausleger versehentlich auf den Probentisch trifft, während der AFM-Kopf montiert wird (nächster Schritt).
   5. Heben Sie den AFM-Kopf vorsichtig von seinem Ständer und montieren Sie ihn auf dem AFM-Probentisch, indem Sie die Beine in die entsprechenden Schlitze stecken.
3. Laserausrichtung
   HINWEIS: Die anfängliche Laserausrichtung wird ohne Probe (d. h. im Luftmodus) durchgeführt, da sie eine genauere Ausrichtung des Laserstrahls auf der Cantilever-Spitze gewährleistet (durch Verhinderung der Laserbrechung in Flüssigkeit). Da biologische Proben jedoch in ein Medium getaucht werden, das einen anderen Brechungsindex als Luft hat, ist es wichtig, den Laser vor der Steifigkeitsmessung im Medium neu auszurichten.
   1. Für die Laserausrichtung in der Luft platzieren Sie den AFM-Kopf auf dem Probentisch und verwenden Sie das 10-fach-Objektiv und die daran angebrachte Kamera, um den Cantilever-Effekt auf dem Monitor im Live-Modus zu visualisieren. Der Infrarotlaser ist für den Benutzer unsichtbar, aber mit einer CCD-Kamera sichtbar.
   2. Wählen Sie in der Software die Funktion Kontaktmodus-Kraftspektroskopie aus und öffnen Sie das Fenster mit dem Titel Laserausrichtung.
   3. Fokussieren Sie den Laserstrahl mit den beiden Schrauben, die am AFM-Kopf mit dem Laser lateral markiert sind, so auf den Cantilever, dass der SUM-Wert im Laserausrichtungsfenster am höchsten ist. Um dies zu erreichen, fokussieren Sie den Laser auf oder um die Mitte des Auslegers.
   4. Stellen Sie den Fotodetektor mit den Einstellschrauben des Detektors so ein, dass sich der Laserpunkt in der Mitte des Laserausrichtungsfensters befindet.
   5. Stellen Sie den Spiegel mit der Spiegeleinstellschraube so ein, dass der SUMME-Wert auf dem höchstmöglichen Wert liegt.
      HINWEIS: Ein hoher SUM-Wert gewährleistet eine empfindliche und genaue Beurteilung der Probensteifigkeit. Daher sollten sowohl die Laserausrichtung als auch die Spiegeljustierschritte durchgeführt werden, um den höchsten SUMMEN-Wert zu erhalten.
   6. Geben Sie als Nächstes für die Laserausrichtung in Flüssigkeit das gewünschte Nährmedium in eine Schale und montieren Sie es fest auf dem Tisch, um Vibrationen oder Drift zu vermeiden, die während des Probeneindrucks Messartefakte erzeugen.
   7. Während Sie die Live-Kamera betrachten, die auf den Ausleger fokussiert ist, senken Sie ihn mit der Schrittmotorfunktion in die Flüssigkeit ab.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.4 und 3.3.5, um sicherzustellen, dass der SUMME-Wert am höchsten bleibt und sich der Laserpunkt in der Mitte des Laserausrichtungsfensters befindet.
4. Kalibrierung der Cantilever-Federkonstante
   HINWEIS: Obwohl Cantilever-Sonden mit einer vom Hersteller kalibrierten Federkonstante (k) geliefert werden, empfiehlt es sich, ihren Wert (in Flüssigkeit) vor Beginn einer Messung unabhängig zu überprüfen. Verwenden Sie eine saubere Glasoberfläche, die Wechselwirkungen zwischen der Cantilever-Sonde und der Glasoberfläche minimiert.
   1. Die vom Ausleger aufgebrachte Sollkraft legt die maximale Laserablenkung vom Ausleger fest, die für einen Krafteindruck zulässig ist. Stellen Sie ihn zunächst auf 1,5 V ein. Wenn sich der Ausleger bei dieser gegebenen Sollkraft nicht nähert, erhöhen Sie ihn schrittweise, bis er die Probe einkerbt und eine Krafteindruckkurve erzeugt.
   2. Die Z-Länge gibt den maximalen Abstand an, um den sich der Z-Piezo zurückzieht, nachdem der Cantilever beim Probeneindruck den Sollwert erreicht hat. Die Z-Länge sollte mindestens ausreichend sein, um sicherzustellen, dass sich die Cantilever-Sonde sauber von der Probe trennt. Für die Kalibrierung der Federkonstante auf einer Glasoberfläche ist die Z-Länge auf 1 μm einzustellen.
   3. Die Z-Geschwindigkeit bezieht sich auf die Geschwindigkeit, mit der der Z-Piezo den Cantilever-Kondensator während des Krafteindrucks senkrecht nach unten in Richtung Probe bewegt. Es sollte optimiert werden, da eine sehr niedrige Geschwindigkeit in erster Linie das viskose Verhalten der Probe erfasst, während eine sehr hohe Geschwindigkeit hauptsächlich das elastische Verhalten erfasst. Es wird erwartet, dass die optimale Geschwindigkeit die wahre viskoelastische Natur biologischer Proben erfasst. Stellen Sie die Z-Geschwindigkeit für die viskoelastischen biologischen Proben auf 2 μm/s ein.
   4. Die Zielhöhe im Z-Bereich gibt den ungefähren Abstand von der Probe an, in dem sich der Z-Piezo nach der Messung eines Kraftverlaufs und vor dem Bewegen an eine andere Position auf der Probe befindet. Die Zielhöhe des Z-Bereichs sollte größer sein als die Höhe der Beispiel-Features. Stellen Sie die Zielhöhe im Z-Bereich auf 7,5 μm ein.
   5. Bringen Sie den Cantilever-Motor mit der Schrittmotor-Funktion ziemlich nah an die Probenoberfläche heran (gemessen am Fokus im Phasenkontrastbild bei 10-facher Vergrößerung), bevor Sie die Annäherungsfunktion im Fenster der Kontaktmodus-Kraftspektroskopie auswählen, um den Cantilever in kleineren Schritten von 15 μm nach unten zu bringen.
   6. Klicken Sie auf Erfassen , um eine Kraftkurve zu erfassen.
   7. Wählen Sie die Kraftkurve aus, öffnen Sie sie im Fenster des Kalibrierungs-Managers und wählen Sie im Methodenbereich Kontaktbasierter Modus .
   8. Wählen Sie mit der Funktion "Bereich auswählen " die Ausleger-Rückzugskurve für eine lineare Kurvenanpassung aus. Aktivieren Sie anschließend das Kontrollkästchen Empfindlichkeit , um die Krafteinheit von V in N umzuwandeln.
   9. Heben Sie den Ausleger um 100-200 μm in der Flüssigkeit an und wählen Sie die Funktion Thermal Noise . Passen Sie auch hier mit Select Fit Range die Glockenkurve des thermischen Rauschens an eine Lorentzkurve an. Wählen Sie nach der Kurvenanpassung das Feld Federkonstante (k) aus. Vergewissern Sie sich, dass die Federkonstante (k) nahe am Herstellerwert liegt, und notieren Sie sie zum späteren Nachschlagen. Nach der Kalibrierung ändert sich die Einheit für den Sollwert von mV auf nN.
      HINWEIS: Thermisches Rauschen ist die Eigenfrequenz des Auslegers bei einer bestimmten Temperatur. Für eine genaue Messung der Federkonstante ist eine Korrektur des thermischen Rauschens erforderlich.
5. Erfassung von Kraft-Weg-Kurven
   1. Platzieren Sie die auf dem Objektträger montierte Probe (Netzhautgefäße oder subendotheliale Matrix) auf dem AFM-Tisch und wählen Sie im Experimentbereich der Software die Option Kontaktmodus-Kraftspektroskopie .
   2. Stellen Sie die Sollkraft auf 0,5 nN ein und klicken Sie auf den Anflug, der deutlich höher ist als die thermische Ablenkung der Cantilever-Sonden SAA-SPH 1 μm und PFQNM-LC-A 70 nm, was eine gleichmäßige Cantilever-Annäherung an die Probe gewährleistet.
   3. Nachdem der Cantilever die Oberfläche erkannt hat und auf seine Ruhezielhöhe zurückgekehrt ist, wird der Sollwert auf 0,2 nN für die steifere SAA-SPH 1 μm Cantilever-Sonde oder 0,1 nN für die weichere PFQNM-LC-A 70 nm Cantilever-Sonde festgelegt. Diese Sollwerteinstellung stellt sicher, dass sich sowohl steife als auch weiche Ausleger während des Probeneindrucks leicht biegen (siehe Abschnitt 3.1).
   4. Stellen Sie die Z-Länge auf ~2,5 μm ein, um eine saubere Trennung der Cantilever-Sonde von biologischen Proben während des Rückzugs zu gewährleisten (siehe Schritt 3.4.2) und die Z-Geschwindigkeit auf 2 μm/s (siehe Schritt 3.4.3).
   5. Positionieren Sie die Cantilever-Sonde mit den Tischschrauben am AFM-Tisch vorsichtig an einer gewünschten Stelle auf der Probe.
      HINWEIS: Da sich die Kapillaren nicht immer flach auf dem Objektträger ausbreiten, ist es sicher, den Cantilever weitere 10-20 μm von seiner Ruhezielhöhe zurückzuziehen, bevor der Tisch bewegt wird.
   6. Klicken Sie auf Annäherung , um den Cantilever-Ausleger zuerst näher an die Probe zu bringen, und klicken Sie dann auf Erfassen , um die Kraftkurven für die gewünschten Positionen zu erfassen. Speichern Sie alle Kraftverläufe für die Analyse.
6. Datenanalyse
   1. Öffnen Sie die Kraftkurve in der Datenverarbeitungssoftware.
   2. Wählen Sie die Rückzugskraftkurve für die Datenanalyse aus (ähnlich wie in Schritt 3.4.8).
   3. Mit der Datenglättungsfunktion glätten Sie die Kraftkurve mit einem Gaußschen Filter, um das unerwünschte Rauschen in den erfassten Daten zu entfernen.
   4. Passen Sie mit der Subtraktionsfunktion Basislinie den Wert der Steigung und den Betrag des (berührungslosen) Basislinienanteils der Kraftkurve auf Null an.
   5. Klicken Sie auf die Funktion Kontaktpunkt , um den Kontaktpunkt der Kraftkurve automatisch auf die Koordinaten (0,0) auf der X- und Y-Achse zu bringen.
   6. Berechnen Sie mit der Funktion "Position der vertikalen Spitze " die tatsächliche vertikale Position des Auslegers auf der Y-Achse, indem Sie alle Probeneindrücke korrigieren.
   7. Wenden Sie auf die verarbeitete Kraftkurve die Funktion "Elastizitätsanpassung " an, indem Sie zuerst die Spitzenform und den Radius auswählen (basierend auf dem ausgewählten Cantilever-Tastkopf), gefolgt von der Kraftkurvenanpassung mit dem Hertz/Sneddon-Modell.
      1. Wenn die Matrixeindrücke durch die Sonde mit einem Radius von 70 nm 70 nm überschreitet, was normalerweise der Fall ist, wählen Sie die Form der Paraboloidspitze . Bei der Messung der Kapillarsteifigkeit überschreitet der Probeneindruck mit der Sonde mit einem Radius von 1 μm nie 1 μm, wählen Sie daher die Form der Kugelspitze . Wenn der Kontaktpunkt der angepassten Kurve nicht mit dem Kontaktpunkt der tatsächlichen Rückzugskurve übereinstimmt, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kurve verschieben .
   8. Notieren und speichern Sie den Wert des Elastizitätsmoduls (Steifigkeit).

Ergebnisse

Netzhautkapillaren der Maus
Die Messung der AFM-Steifigkeit isolierter Netzhautkapillaren umfasst Schritte bei der Probenhandhabung, die möglicherweise ihre mechanostrukturelle Integrität beeinträchtigen könnten. Um dies zu verhindern und damit die Durchführbarkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von AFM-Messungen zu gewährleisten, werden die enukleierten Augen vor der Gefäßisolierung über Nacht bei 4 °C in 5 % Formalin fixiert. Dieses milde Fixierungsprotokoll mit reduzierter Forma...

Diskussion

AFM wird häufig zur Messung krankheitsassoziierter Veränderungen der Steifigkeit größerer Gefäße wie der Aorta und der Arterien eingesetzt¹⁶. Diese Erkenntnisse haben dazu beigetragen, die Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei kardiovaskulären Komplikationen wie Atherosklerose zu etablieren¹⁷. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir begonnen, die bisher unerkannte Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei der Entwicklung retinaler mikrovaskulärer Läsio...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective