Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie

Zusammenfassung

Vor kurzem haben wir die retinale Kapillarversteifung als neues Paradigma für retinale Dysfunktion im Zusammenhang mit Diabetes identifiziert. In diesem Protokoll werden die Schritte zur Isolierung von retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix aus retinalen Endothelkulturen erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der Steifigkeitsmesstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie.

Zusammenfassung

Die retinale Kapillardegeneration ist ein klinisches Kennzeichen der frühen Stadien der diabetischen Retinopathie (DR). Unsere jüngsten Studien haben gezeigt, dass die diabetesinduzierte retinale Kapillarversteifung eine entscheidende und bisher unerkannte kausale Rolle bei der entzündungsvermittelten Degeneration der retinalen Kapillaren spielt. Die Zunahme der Steifigkeit der retinalen Kapillaren resultiert aus der Überexpression von Lysyloxidase, einem Enzym, das die subendotheliale Matrix vernetzt und versteift. Da davon ausgegangen wird, dass die Behandlung von DR im Frühstadium das Fortschreiten der DR und den damit verbundenen Sehverlust verhindert oder verlangsamt, stellen die subendotheliale Matrix und die Kapillarsteifigkeit relevante und neuartige therapeutische Ziele für die frühe DR-Behandlung dar. Darüber hinaus kann die direkte Messung der retinalen Kapillarsteifigkeit als entscheidender präklinischer Validierungsschritt für die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren zur nicht-invasiven Beurteilung der retinalen Kapillarsteifigkeit bei Tieren und Menschen dienen. Vor diesem Hintergrund stellen wir hier ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus mittels Rasterkraftmikroskopie zur Verfügung.

Einleitung

Netzhautkapillaren sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Sehfunktion der Netzhaut unerlässlich. Tatsächlich ist ihre Degeneration bei Diabetes im Frühstadium stark an der Entwicklung von sehkraftbedrohenden Komplikationen der diabetischen Retinopathie (DR) beteiligt, einer mikrovaskulären Erkrankung, von der fast 40 % aller Menschen mit Diabetes betroffen^{sind 1}. Vaskuläre Entzündungen tragen signifikant zur retinalen Kapillardegeneration bei DR bei. Frühere Studien haben gezeigt, dass aberrante molekulare und biochemische Signale bei Diabetes-induzierten retinalen Gefäßentzündungen eine wichtige Rolle spiel....

Protokoll

Alle Eingriffe an Tieren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung durchgeführt und von den Institutional Animal and Care Use Committees (IACUC; Protokollnummer ARC-2020-030) an der University of California, Los Angeles (OLAW Institution Animal Welfare Assurance Number A3196-01) genehmigt. Das folgende Protokoll wurde mit Netzhautkapillaren durchgeführt, die von adulten (20 Wochen alten) männlichen C57BL/6J-Mäusen mit einem Gewicht von ~25 g (diabetische Mäuse) und ~32 g (nichtdiabetische Mäuse; Jackson Laboratory).

Diskussion

AFM wird häufig zur Messung krankheitsassoziierter Veränderungen der Steifigkeit größerer Gefäße wie der Aorta und der Arterien eingesetzt¹⁶. Diese Erkenntnisse haben dazu beigetragen, die Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei kardiovaskulären Komplikationen wie Atherosklerose zu etablieren¹⁷. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir begonnen, die bisher unerkannte Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei der Entwicklung retinaler mikrovaskulärer Läsio.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective