Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Riepilogo

Recentemente abbiamo identificato l'irrigidimento capillare retinico come un nuovo paradigma per la disfunzione retinica associata al diabete. Questo protocollo elabora le fasi per l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale da colture endoteliali retiniche, seguite da una descrizione della tecnica di misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica.

Abstract

La degenerazione capillare retinica è un segno clinico distintivo delle prime fasi della retinopatia diabetica (DR). I nostri studi recenti hanno rivelato che l'irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete svolge un ruolo causale cruciale e precedentemente non riconosciuto nella degenerazione dei capillari retinici mediata dall'infiammazione. L'aumento della rigidità capillare retinica deriva dalla sovraespressione della lisil ossidasi, un enzima che lega e irrigidisce la matrice subendoteliale. Poiché si prevede che affrontare la DR nella fase iniziale prevenga o rallenti la progressione della DR e la perdita della vista associata, la matrice subendoteliale e la rigidità capillare rappresentano bersagli terapeutici rilevanti e nuovi per la gestione precoce della DR. Inoltre, la misurazione diretta della rigidità capillare retinica può fungere da fase cruciale per la convalida preclinica per lo sviluppo di nuove tecniche di imaging per la valutazione non invasiva della rigidità capillare retinica in soggetti animali e umani. Con questa visione in mente, forniamo qui un protocollo dettagliato per l'isolamento e la misurazione della rigidità dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale utilizzando la microscopia a forza atomica.

Introduzione

I capillari retinici sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi retinica e della funzione visiva. Infatti, la loro degenerazione nel diabete precoce è fortemente implicata nello sviluppo di complicanze potenzialmente visibili della retinopatia diabetica (DR), una condizione microvascolare che colpisce quasi il 40% di tutti gli individui con diabete¹. L'infiammazione vascolare contribuisce in modo significativo alla degenerazione capillare retinica nella DR. Studi precedenti hanno dimostrato un ruolo importante per segnali molecolari e biochimici aberranti nell'infiammazione vascolare retinica indotta dal diabete ^2,3. Tuttavia, lavori recenti hanno introdotto un nuovo paradigma per la patogenesi della DR che identifica l'irrigidimento capillare retinico come un determinante cruciale, ma precedentemente non riconosciuto, dell'infiammazione e della degenerazione vascolare retinica ^4,5,6.

In particolare, l'aumento della rigidità capillare retinica indotto dal diabete è causato dalla sovraregolazione dell'enzima reticolante del collagene lisil ossidasi (LOX) nelle cellule endoteliali retiniche (EC), che irrigidisce la matrice subendoteliale (membrana basale)^4,5,6. L'irrigidimento della matrice, a sua volta, irrigidisce le EC retiniche sovrastanti (a causa della reciprocità meccanica), portando così all'aumento complessivo della rigidità capillare retinica⁴. Fondamentalmente, questo irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete da solo può promuovere l'attivazione della EC retinica e la morte EC mediata dall'infiammazione. Questa regolazione meccanica dei difetti dell'EC retinica può essere attribuita all'alterata meccanotrasduzione endoteliale, il processo mediante il quale i segnali meccanici vengono convertiti in segnali biochimici per produrre una risposta biologica ^7,8,9. È importante sottolineare che i segnali meccanici EC alterati e la struttura della matrice subendoteliale sono stati anche implicati nella degenerazione vascolare coroideale associata alla degenerazione maculare precoce legata all'età (AMD)10,11,12, il che attesta le implicazioni più ampie della meccanobiologia vascolare nelle malattie degenerative della retina.

In particolare, l'irrigidimento dei capillari retinici si verifica all'inizio del diabete, che coincide con l'insorgenza dell'infiammazione retinica. Pertanto, l'aumento della rigidità capillare retinica può fungere sia da bersaglio terapeutico che da marcatore diagnostico precoce per la DR. A tal fine, è importante ottenere misurazioni affidabili e dirette della rigidità dei capillari retinici e della matrice subendoteliale. Ciò può essere ottenuto utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM), che offre una tecnica unica, sensibile, accurata e affidabile per misurare direttamente la rigidità delle cellule, della matrice extracellulare e dei tessuti¹³. Un AFM applica una forza di indentazione minuta (livello di nanoNewton) sul campione la cui rigidità determina la misura in cui il cantilever AFM di indentazione si piega: più rigido è il campione, più il cantilever si piega e viceversa. Abbiamo utilizzato ampiamente l'AFM per misurare la rigidità delle cellule endoteliali in coltura, delle matrici subendoteliali e dei capillari retinici isolati di topo 4,5,6,11,12. Queste misurazioni della rigidità dell'AFM hanno contribuito a identificare la meccanobiologia endoteliale come un determinante chiave della patogenesi di DR e AMD. Per aiutare ad ampliare l'ambito della meccanobiologia nella ricerca sulla vista, qui forniamo una guida passo passo sull'uso dell'AFM per le misurazioni della rigidità dei capillari retinici isolati di topo e della matrice subendoteliale.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con la dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e approvate dai comitati istituzionali per l'uso degli animali e della cura (IACUC; numero di protocollo ARC-2020-030) presso l'Università della California, Los Angeles (numero di garanzia per il benessere degli animali dell'istituto OLAW A3196-01). Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando capillari retinici isolati da topi maschi adulti (20 settimane) C57BL/6J del peso di ~25 g (topi diabetici) e ~32 g (topi non diabetici; Jackson Laboratory).

1. Isolamento dei capillari retinici di topo per la misura della rigidità AFM (Giorni 1-4)

NOTA: Questo protocollo, riportato in un recente studio⁴, descrive in dettaglio l'enucleazione e la fissazione lieve dell'occhio del topo, l'isolamento della retina e la digestione della tripsina e il successivo montaggio della vascolarizzazione retinica risultante su vetrini per microscopia per la misurazione della rigidità AFM.

1. Enucleazione e fissazione lieve (Giorno 1)
   1. Dopo l'eutanasia del topo con esposizione all'anidride carbonica seguita da lussazione cervicale, inserire una micro pinza dietro il bulbo oculare, tenere l'attacco muscolare ed estrarre con cautela l'occhio senza pizzicare troppo strettamente le micro pinze, che potrebbero recidere il nervo ottico.
   2. Posizionare l'occhio enucleato in formalina al 5% (v/v) in PBS per 24 ore a 4 °C per una fissazione lieve.
      NOTA: Sulla base dell'esperienza⁴, gli occhi non fissati o più lievemente fissati producono capillari fragili che si frammentano durante la preparazione del campione AFM e la misurazione della rigidità.
2. Isolamento retinico (Giorno 2)
   1. Posizionare l'occhio fisso su un pezzo di carta oleata sotto un microscopio da dissezione. Successivamente, utilizzando una micro pinza, tenere i resti del muscolo e del nervo ottico attaccati all'esterno dell'occhio posteriore e orientare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta su un lato (Figura 1).
   2. Utilizzando una lama chirurgica, praticare un'incisione 1-2 mm dietro e parallela al limbus (giunzione cornea-sclera). Quindi, tenendo l'occhio in posizione con la micro pinza, applicare una forza verso il basso con la lama e continuare a premere fino a quando il segmento anteriore dell'occhio non è completamente separato dall'estremità posteriore (Figura 1). Scartare il segmento anteriore e la lente. Non segare avanti e indietro in quanto ciò potrebbe causare danni alla retina.
   3. Trasferire il segmento posteriore (sclera, coroide e retina) in un piatto di 6 cm riempito con PBS (pH 7,4).
   4. Usando una micro spatola e contemporaneamente tenendo delicatamente il nervo ottico con una micro pinza, estrai la retina. Conservare la retina in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente PBS a 4 °C fino all'isolamento capillare.
       
3. Risciacqui retinici
   1. Per risciacquare una retina, riempire sei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con 1 mL di H₂O (ddH₂O) a doppia distillazione. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur rovesciata, trasferire la retina dalla provetta da microcentrifuga da 2 ml nel primo pozzetto.
   2. Sciacquare la retina sull'agitatore orbitale a 120 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   3. Utilizzando una pipetta P1000, pipettare con cura l'acqua su e giù adiacente alla retina, soffiando acqua sulla retina per provocare una leggera agitazione.
   4. Utilizzando la pipetta di vetro rovesciata, trasferire la retina nel secondo pozzetto e ripetere i passaggi 1.3.2 e 1.3.3 4 volte, con ogni risciacquo effettuato in un pozzetto fresco (contenente ddH₂O).
   5. Infine, trasferire la retina al sesto pozzetto e sciacquarla durante la notte (O/N) a RT sull'agitatore orbitale impostato a 100 giri/min per facilitare la separazione della neuroglia retinica dai vasi sanguigni durante la digestione della tripsina.
4. Digestione retinica della tripsina (Giorno 3)
   1. Preparare una soluzione di tripsina al 10% (p/v) sciogliendo la polvere di tripsina 1:250 in tampone Tris (pH 8; 0,1 M). Mescolare delicatamente capovolgendo più volte il tubo conico per ridurre al minimo la formazione di bolle, il che rende più difficile confermare la solubilità della tripsina.
   2. Equilibrare la soluzione di tripsina al 10% in un bagnomaria a 37 °C per 10-15 minuti. Una volta che la polvere di tripsina si è completamente sciolta, filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm.
   3. In una piastra a 12 pozzetti, aggiungere 2 mL/pozzetto/retina della soluzione filtrata di tripsina al 10%. Aggiungere un po' di soluzione di tripsina in più nel pozzetto vicino (per equilibrare le pareti della pipetta di vetro per i passaggi successivi).
   4. Aggiungere 3 mL di ddH₂O in tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti (dedicare questi tre pozzetti per una retina).
   5. In una provetta conica da 15 mL, inserire un puntale P200 prima di aggiungere 4 mL della soluzione filtrata di tripsina al 10%. Trasferire questo tubo conico nel bagno a 37 °C per consentire alla punta di essere immersa nella tripsina per 2-3 minuti, in quanto ciò aiuta a prevenire che la retina si attacchi alle pareti della punta nelle ultime fasi.
   6. Dopo il risciacquo O/N della retina (dal punto 1.3.5), utilizzare una pipetta P1000 per pipettare accuratamente l'acqua su e giù adiacente alla retina, spruzzando acqua sulla retina per provocare una leggera agitazione.
   7. Utilizzando una pipetta di vetro rovesciata, trasferire la retina risciacquata nel pozzetto contenente tripsina della piastra a 12 pozzetti (dal punto 1.4.3). Assicurarsi che la retina venga trasferita con una quantità minima di ddH₂O residuo in modo da non diluire significativamente la soluzione di tripsina. Incubare per 3 ore a 37 °C.
   8. Centrando la punta P200 imbevuta di tripsina (dal passaggio 1.4.5) sull'area del nervo ottico, pipettare delicatamente l'intera rete vascolare su e giù per dissociare il tessuto non vascolare¹⁴.
   9. Utilizzando una pipetta di vetro rovesciata pre-risciacquata con tripsina (pipettando la tripsina su e giù 5 volte), trasferire il sistema vascolare retinico nel primo pozzetto contenente ddH₂O della piastra a 6 pozzetti (dal passaggio 1.4.4).
   10. Agitare la piastra e pipettare il sistema vascolare su e giù utilizzando una pipetta di vetro con tripsina invertita per rimuovere qualsiasi residuo di tessuto non vascolare.
   11. Utilizzando la pipetta di vetro, trasferire il sistema vascolare retinico nel secondo pozzetto contenente ddH2O della piastra a 6 pozzetti e conservare a 4 °C fino al montaggio sul vetrino per la misurazione della rigidità AFM.
       NOTA: Il sistema vascolare retinico idratato (in PBS) è strutturalmente intatto a 4 °C per un massimo di 2 settimane. Tuttavia, le misurazioni di routine della rigidità devono essere effettuate da capillari appena isolati.
5. Montaggio della vascolarizzazione retinica per la misurazione della rigidità AFM (Giorno 4)
   1. Utilizzando una pipetta di vetro con tripsina invertita, trasferire il sistema vascolare retinico nel terzo pozzetto contenente ddH₂O della piastra a 6 pozzetti per rimuovere eventuali residui di soluzione di tripsina.
   2. Pulire accuratamente (utilizzando ddH₂O e tessuto raschiante) un vetrino per microscopia a superficie carica che verrà utilizzato per il montaggio della rete vascolare per la misurazione della rigidità AFM.
      NOTA: La superficie caricata del vetrino fornisce un forte legame per la rete vascolare durante la misurazione AFM.
   3. Etichettare il vetrino e disegnare una regione circolare di 4-5 cm attorno al centro con una penna idrofobica per evitare fuoriuscite d'acqua durante i passaggi successivi.
   4. Utilizzando una pipetta di vetro scissa con tripsina invertita, trasferire con cura il sistema vascolare retinico al centro della regione contrassegnata.
   5. Utilizzando una pipetta P200, rimuovere con cura quanta più acqua in eccesso possibile da un bordo senza aspirare accidentalmente il sistema vascolare nel puntale.
   6. Posizionare il vetrino in una cabina di biosicurezza (cappa BSL-2) vicino al lato anteriore (rete filtrata) e lasciare evaporare l'acqua residua.
   7. Una volta che il sistema vascolare è quasi asciutto, al microscopio a contrasto di fase (ingrandimento 4x), reidratare accuratamente il sistema vascolare aggiungendo lentamente ddH₂O con una pipetta P200 su un lato della regione contrassegnata. L'aggiunta di ddH₂O direttamente sul sistema vascolare ne provoca il distacco.
   8. Acquisisci immagini a contrasto di fase del sistema vascolare reidratato con ingrandimenti 4x e 20x per assicurarti che abbia una buona integrità strutturale e sia correttamente distribuito (non piegato su se stesso) e attaccato al vetrino, che sono criteri essenziali per una misurazione affidabile della rigidità AFM.

2. Ottenimento di matrice subendoteliale da colture di cellule endoteliali microvascolari retiniche (REC) (giorni 1-17)

NOTA: Questo protocollo, adattato da Beacham et al.¹⁵ e riportato in recenti studi ^4,5,6, descrive la coltura di REC su vetrini di vetro modificati, seguita da decellularizzazione per ottenere una matrice subendoteliale per la successiva misurazione della rigidità AFM.

1. Preparazione dei vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina e della placcatura delle celle (Giorno 1)
   NOTA: Eseguire il rivestimento in gelatina e le successive fasi di risciacquo PBS⁺⁺ in una cappa di coltura tissutale prima di passare a una cappa chimica per le successive fasi di trattamento con glutaraldeide ed etanolammina.
   1. Posizionare un vetrino coprioggetti circolare autoclavato da 12 mm di diametro per pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti e aggiungere 500 μL di gelatina sterile preriscaldata allo 0,2% (p/v) (diluita in PBS contenente calcio e magnesio; PBS⁺⁺) a ciascun pozzetto contenente vetrino coprioggetti. Incubare per 1 ora a 37 °C.
   2. Aspirare la soluzione di gelatina, sciacquare una volta i vetrini coprioggetti con PBS⁺⁺ sterile e reticolare la gelatina rivestita aggiungendo 500 μL di glutaraldeide all'1% (v/v) per 30 minuti a RT.
   3. Raccogliere e smaltire correttamente (secondo le linee guida istituzionali) la soluzione di glutaraldeide prima di risciacquare i vetrini coprioggetti con PBS⁺⁺ per 5 minuti su un agitatore orbitale a 100 RPM in RT. Ripetere questa fase di risciacquo 5 volte. Durante i primi tre risciacqui, sollevare i vetrini coprioggetti utilizzando una pinzetta sterile per consentire un risciacquo accurato della glutaraldeide. Qualsiasi quantità residua può ridurre la vitalità cellulare.
   4. Aggiungere 800 μl di etanolammina 1 M al vetrino coprioggetto reticolato con gelatina per 30 minuti a RT per spegnere eventuali tracce residue di glutaraldeide nel pozzetto.
   5. Raccogliere e smaltire correttamente (come da linee guida istituzionali) la soluzione di etanolammina e sciacquare i vetrini coprioggetti 5 volte con PBS⁺⁺ per 5 minuti su un agitatore orbitale a 100 giri/min in RT. Durante i primi tre risciacqui, sollevare i vetrini coprioggetti utilizzando una pinzetta sterile per consentire un risciacquo accurato dell'etanolammina. Qualsiasi quantità residua può ridurre la vitalità cellulare.
   6. I vetrini coprioggetti reticolati sono ora pronti per la placcatura cellulare.
      NOTA: Sebbene le cellule vengano regolarmente piastrate subito dopo la preparazione del vetrino coprioggetti, può essere utile confrontare la placcatura delle cellule su vetrini coprioggetti in gelatina reticolata conservati in PBS⁺⁺ a 4 °C per 1-2 giorni.
   7. In condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale, le cellule endoteliali microvascolari retiniche (REC) vengono piatte in un terreno/pozzetto da 500 μL a una densità che raggiunge il 100% di confluenza entro 24 ore, come confermato dalla microscopia a contrasto di fase.
      NOTA: Raggiungere la confluenza entro 24 ore è importante in quanto la quiescenza REC risultante aumenterà la capacità delle cellule di secernere matrice (fare riferimento al passaggio seguente). Nella nostra esperienza con i REC umani, una densità di placcatura di 4 x 10⁴ cellule/cm² è sufficiente per raggiungere la confluenza entro 24 ore. Tuttavia, poiché la dimensione dei REC varia a seconda delle specie (ad esempio, i REC dei topi sono significativamente più piccoli), potrebbe essere necessario ottimizzare la densità iniziale della placcatura.
2. Produzione di matrice subendoteliale mediante coltura REC (Giorno 2-16)
   1. Dopo che le cellule hanno raggiunto la confluenza (~24 h), sostituire il terreno di coltura con un terreno fresco integrato con acido ascorbico filtrato sterile (concentrazione finale di 200 μg/mL).
      NOTA: Qualsiasi trattamento REC con fattori di rischio di malattia (ad esempio, glicemia alta, prodotti finali della glicazione avanzata, ecc.) o agenti farmacologici può iniziare ora, insieme al trattamento con acido ascorbico.
   2. Cambiare il terreno di coltura integrato con acido ascorbico a giorni alterni per 15 giorni.
      NOTA: L'acido ascorbico è instabile in soluzione. Preparare una soluzione madre fresca 100X a giorni alterni per un'integrazione media.
3. Decellularizzazione delle colture REC per ottenere la matrice subendoteliale (Giorno 16)
   1. Dopo 15 giorni di trattamento con acido ascorbico, rimuovere il terreno e sciacquare le cellule con PBS privo di calcio/magnesio.
   2. Decellularizzare le colture REC aggiungendo 250 μL/per pozzetto di tampone di decellularizzazione caldo (20 mM di idrossido di ammonio e 0,5% di Triton X-100 in PBS) per ~2-3 minuti. Confermare la rimozione delle cellule al microscopio a contrasto di fase (ingrandimento 10x).
   3. Rimuovere delicatamente il tampone di decellularizzazione senza disturbare la matrice subendoteliale secreta da REC e aggiungere 0,5 mL di PBS a ciascun pozzetto.
      NOTA: Per garantire che la matrice sottoendoteliale non si stacchi durante questa e le successive fasi di risciacquo, eseguire un risciacquo delicato solo con una pipetta P1000. Non eseguire l'aspirazione a vuoto.
   4. Conservare le piastre a 4 °C per una notte per stabilizzare la matrice secreta da REC.
4. Trattamento con DNasi della matrice subendoteliale per rimuovere i detriti cellulari (Giorno 17)
   1. Sciacquare la matrice subendoteliale del passaggio 2.3.4 con 800 μL di PBS/pozzetto.
   2. Rimuovere delicatamente il PBS e incubare la matrice con 200 μL di DNasi I priva di RNasi (30 K unità) a 37 °C per 30 minuti per rimuovere tutte le tracce di detriti cellulari. Verificare l'efficienza del trattamento con DNasi cercando attentamente i detriti cellulari al microscopio a contrasto di fase.
   3. Rimuovere delicatamente la soluzione di DNasi I e sciacquare due volte la matrice subendoteliale con 800 μL di PBS/pozzetto.
   4. Verificare che la matrice sottoendoteliale fibrosa su macroscala sia visibile al microscopio a contrasto di fase (ingrandimento 10x). La visualizzazione delle fibre di matrice nanometrica più fini richiede la scansione topografica AFM o l'imaging confocale ad alta risoluzione di proteine della matrice immunomarcate con ingrandimento 100x.
   5. Utilizzare immediatamente la matrice subendoteliale fresca (non fissata) per la misurazione della rigidità AFM.
   6. Dopo la misurazione dell'AFM, fissare i campioni della matrice con paraformaldeide all'1% (v/v) (15 minuti a temperatura ambiente) e conservati a 4 °C per l'immunomarcatura con anticorpi contro le proteine della matrice subendoteliale e/o gli enzimi reticolanti.

3. Misurazione della rigidità AFM

NOTA: Questo protocollo, adattato da un manuale utente AFM standard e riportato in recenti studi ^4,5, descrive in dettaglio l'acquisizione e l'analisi dei dati di rigidità dai capillari retinici e dalla matrice subendoteliale utilizzando un software AFM e di analisi dei dati. Sebbene i passaggi descritti di seguito siano basati su un modello specifico di AFM (vedi Tabella dei materiali), i principi di base sono generalmente applicabili a tutti i modelli AFM.

1. Selezione della sonda a sbalzo
   NOTA: I campioni biologici morbidi richiedono cantilever morbidi che possono piegarsi all'indentazione del campione mentre le dimensioni della sonda sono selezionate per corrispondere alle dimensioni del campione.
   1. Per la misurazione della rigidità di vasi retinici di topo di 5-8 μm di diametro, utilizzare una sonda a sbalzo con raggio di 1 μm con una costante elastica (k) di 0,2-0,3 N/m. Per la misurazione della rigidità di una matrice subendoteliale composta da fibre su scala nanometrica, utilizzare una sonda a sbalzo con raggio di 70 nm con una costante elastica (k) di 0,06-0,1 N/m.
2. Montaggio a sbalzo
   1. Sul computer AFM, aprire il software che controlla l'unità AFM e la fotocamera collegata a un microscopio a contrasto di fase che viene utilizzato per visualizzare il cantilever e il campione.
   2. Fissare il supporto a sbalzo sul supporto di cambio a sbalzo e montare il cantilever selezionato sul supporto utilizzando una pinza da orologiaio sotto uno stereoscopio senza danneggiare fisicamente il cantilever. Serrare la vite sul supporto per fissare il cantilever.
   3. Posizionare e bloccare il supporto a sbalzo sulla testa AFM che poggia sul supporto.
   4. Utilizzando la funzione del motore passo-passo nel software AFM, ritirare la testa AFM nel punto più alto e impostare quella posizione come punto zero nel software. Questo passaggio impedisce al cantilever AFM di colpire accidentalmente lo stadio del campione durante il montaggio della testa AFM (passaggio successivo).
   5. Sollevare con cautela la testa AFM dal suo supporto e montarla sul palco campione AFM posizionando le gambe nelle rispettive fessure.
3. Allineamento laser
   NOTA: L'allineamento iniziale del laser viene eseguito senza alcun campione (cioè in modalità Aria) in quanto garantisce un allineamento più preciso del raggio laser sulla punta a sbalzo (impedendo la rifrazione del laser nel liquido). Tuttavia, poiché i campioni biologici sono immersi in un mezzo che ha un indice di rifrazione diverso da quello dell'aria, è importante riallineare il laser nel mezzo prima della misurazione della rigidità.
   1. Per l'allineamento laser in aria, posizionare la testa AFM sul tavolino del campione e utilizzare l'obiettivo 10x e la fotocamera collegata per visualizzare il cantilever sul monitor in modalità live. Il laser a infrarossi è nascosto alla vista dell'utente ma è visibile con una telecamera CCD.
   2. Selezionare la funzione Modalità di contatto Spettroscopia di forza sul software e aprire la finestra intitolata Allineamento laser.
   3. Utilizzando le due viti contrassegnate lateralmente con il laser sulla testa AFM, focalizzare il raggio laser sul cantilever in modo tale che il valore SUM nella finestra di allineamento laser sia il più alto. Per ottenere ciò, focalizzare il laser verso o intorno al centro del cantilever.
   4. Utilizzando le viti di regolazione del rivelatore, regolare il fotorilevatore in modo che il punto laser si trovi al centro della finestra di allineamento laser.
   5. Utilizzando la vite di regolazione dello specchio, regolare lo specchio per assicurarsi che il valore SUM sia al valore più alto possibile.
      NOTA: Un valore SUM elevato garantisce una valutazione sensibile e accurata della rigidità del campione. Pertanto, è necessario eseguire sia l'allineamento laser che la regolazione dello specchio per ottenere il valore SUM più alto.
   6. Successivamente, per l'allineamento laser nel liquido, aggiungere il terreno di coltura desiderato in un piatto e montarlo saldamente sul tavolino per evitare vibrazioni o derive, che creano artefatti di misurazione durante l'indentazione del campione.
   7. Mentre guardi il feed della telecamera in tempo reale focalizzato sul cantilever, abbassalo nel liquido utilizzando la funzione del motore passo-passo.
   8. Ripetere i passaggi 3.3.4 e 3.3.5 per assicurarsi che il valore SUM rimanga il più alto e che il punto laser si trovi al centro della finestra di allineamento laser.
4. Taratura della costante della molla a sbalzo
   NOTA: Sebbene le sonde a sbalzo siano dotate di una costante elastica calibrata dal produttore (k), è buona norma verificarne in modo indipendente il valore (in liquido) prima dell'inizio di una misurazione. Utilizzare una superficie di vetro pulita che riduca al minimo le interazioni tra la sonda a sbalzo e la superficie di vetro.
   1. La forza di setpoint applicata dal cantilever imposta la deflessione massima del laser dal cantilever consentita per una rientranza della forza. Impostarlo inizialmente a 1,5 V. Se il cantilever non riesce ad avvicinarsi a questa data forza di setpoint, aumentarla in modo incrementale fino a far rientrare il campione e generare una curva di indentazione della forza.
   2. La lunghezza Z indica la distanza massima di cui il piezo z si ritira dopo che il cantilever ha raggiunto il setpoint durante l'indentazione del campione. La lunghezza Z dovrebbe essere almeno sufficiente per garantire che la sonda a sbalzo si separi in modo pulito dal campione. Per la calibrazione della costante elastica su una superficie di vetro, impostare la lunghezza Z a 1 μm.
   3. La velocità Z si riferisce alla velocità con cui il piezo z sposta il cantilever verticalmente verso il basso verso il campione durante l'indentazione della forza. Dovrebbe essere ottimizzato perché una velocità molto bassa catturerà principalmente il comportamento viscoso del campione, mentre una velocità molto alta catturerà principalmente il comportamento elastico. Ci si aspetta che la velocità ottimale catturi la vera natura viscoelastica dei campioni biologici. Impostare la velocità Z su 2 μm/s per i campioni biologici viscoelastici.
   4. L'altezza target nell'intervallo Z indica la distanza approssimativa dal campione alla quale si trova lo z-piezo dopo aver misurato una curva di forza e prima di spostarsi in una posizione diversa sul campione. L'altezza del target dell'intervallo Z deve essere maggiore dell'altezza delle feature di esempio. Impostare l'altezza del bersaglio sulla gamma Z a 7,5 μm.
   5. Utilizzando la funzione Step Motor , avvicinare il cantilever alla superficie del campione (a giudicare dalla messa a fuoco nell'immagine a contrasto di fase con ingrandimento 10x) prima di selezionare la funzione di avvicinamento nella finestra di spettroscopia di forza in modalità di contatto per abbassare il cantilever con incrementi più piccoli di 15 μm.
   6. Fare clic su Acquisisci per acquisire una curva di forza.
   7. Seleziona la curva di forza, aprila nella finestra del gestore della calibrazione e seleziona Modalità basata su contatto nella sezione del metodo.
   8. Utilizzando la funzione Select-fit Range , selezionare la curva di retrazione a sbalzo per un adattamento lineare della curva. Quindi, selezionare la casella di controllo Sensibilità per convertire l'unità di forza da V a N.
   9. Sollevare il cantilever di 100-200 μm nel liquido e selezionare la funzione Rumore termico . Ancora una volta, utilizzando Select Fit Range, adattare la curva della campana del rumore termico con una curva di Lorentz. Dopo l'adattamento della curva, selezionate la casella Costante molla (k). Verificare che la costante della molla (k) sia vicina al valore del produttore e annotarla per riferimento futuro. Dopo la calibrazione, l'unità di setpoint cambierà da mV a nN.
      NOTA: Il rumore termico è la frequenza naturale del cantilever a una particolare temperatura. La correzione del rumore termico è necessaria per una misurazione accurata della costante della molla.
5. Acquisizione di curve forza-distanza
   1. Posizionare il campione montato su vetrino (vasi retinici o matrice subendoteliale) sullo stadio AFM e selezionare Spettroscopia di forza in modalità di contatto nella sezione dell'esperimento del software.
   2. Impostare la forza di setpoint a 0,5 nN e fare clic su Avvicinamento, che è significativamente superiore alla deflessione termica delle sonde a sbalzo SAA-SPH 1 μm e PFQNM-LC-A 70 nm, garantendo un approccio a sbalzo regolare verso il campione.
   3. Dopo che il cantilever ha rilevato la superficie ed è tornato all'altezza target di riposo, impostare il setpoint a 0,2 nN per la sonda a sbalzo SAA-SPH da 1 μm più rigida o a 0,1 nN per la sonda a sbalzo PFQNM-LC-A da 70 nm più morbida. Questa regolazione del setpoint assicura che sia i cantilever rigidi che quelli morbidi si pieghino facilmente durante l'indentazione del campione (fare riferimento alla sezione 3.1).
   4. Impostare la lunghezza Z a ~2,5 μm per garantire una separazione netta della sonda a sbalzo dai campioni biologici durante la retrazione (fare riferimento al passaggio 3.4.2) e la velocità Z a 2 μm/s (fare riferimento al passaggio 3.4.3).
   5. Utilizzando le viti del tavolino sul tavolino AFM, posizionare con cura la sonda a sbalzo nella posizione desiderata sul campione.
      NOTA: Poiché i capillari non sempre si allargano in piano sul vetrino, è sicuro ritirare il cantilever di altri 10-20 μm dall'altezza target di riposo prima di spostare il tavolino.
   6. Fare clic su Avvicinamento per avvicinare prima il cantilever al campione, quindi fare clic su Acquisisci per acquisire le curve di forza per le posizioni desiderate. Salvate tutte le curve di forza per l'analisi.
6. Analisi dei dati
   1. Aprire la curva di forza nel software di elaborazione dati.
   2. Selezionare la curva della forza di retrazione per l'analisi dei dati (simile al passaggio 3.4.8).
   3. Utilizzando la funzione di livellamento dei dati, smussare la curva di forza con un filtro gaussiano per rimuovere il rumore indesiderato nei dati acquisiti.
   4. Utilizzando la funzione di sottrazione della linea di base, regolare il valore della pendenza e l'ampiezza della parte della linea di base (senza contatto) della curva di forza su zero.
   5. Fare clic sulla funzione Punto di contatto per portare automaticamente il punto di contatto della curva di forza alle coordinate (0,0) sugli assi X e Y.
   6. Utilizzando la funzione Posizione verticale della punta , calcolare la posizione verticale effettiva del cantilever sull'asse Y correggendo l'eventuale indentazione del campione.
   7. Sulla curva di forza elaborata, applicare la funzione Elastic Fit selezionando prima la forma e il raggio della punta (in base alla sonda a sbalzo selezionata), quindi l'adattamento della curva di forza utilizzando il modello Hertz/Sneddon.
      1. Se l'indentazione della matrice da parte della sonda con raggio di 70 nm supera i 70 nm, come in genere accade, selezionare la forma della punta del paraboloide . Per la misurazione della rigidità capillare, l'indentazione del campione da parte della sonda con raggio di 1 μm non supera mai 1 μm, quindi selezionare la forma della punta della sfera . Inoltre, se il punto di contatto della curva adattata non coincide con il punto di contatto della curva di retrazione effettiva, selezionare la casella di controllo Sposta curva (Shift Curve ).
   8. Annotare e conservare il valore del modulo di Young (rigidità).

Risultati

Capillari retinici di topo
La misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici isolati comporta fasi di manipolazione del campione che potrebbero potenzialmente danneggiarne l'integrità meccanostrutturale. Per evitare che ciò accada e quindi garantire la fattibilità, l'affidabilità e la riproducibilità delle misure AFM, gli occhi enucleati vengono fissati in formalina al 5% durante la notte a 4 °C prima dell'isolamento del vaso. Questo protocollo di fissazione lieve con concentrazione di f...

Discussione

L'AFM è stato ampiamente utilizzato per misurare i cambiamenti associati alla malattia nella rigidità dei vasi più grandi, come l'aorta e le arterie¹⁶. Questi risultati hanno contribuito a stabilire il ruolo della meccanobiologia endoteliale nelle complicanze cardiovascolari come l'aterosclerosi¹⁷. Sulla base di questi risultati, abbiamo iniziato a studiare il ruolo precedentemente non riconosciuto della meccanobiologia endoteliale nello sviluppo di lesioni microvascolar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective