Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Riepilogo

Recentemente abbiamo identificato l'irrigidimento capillare retinico come un nuovo paradigma per la disfunzione retinica associata al diabete. Questo protocollo elabora le fasi per l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale da colture endoteliali retiniche, seguite da una descrizione della tecnica di misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica.

Abstract

La degenerazione capillare retinica è un segno clinico distintivo delle prime fasi della retinopatia diabetica (DR). I nostri studi recenti hanno rivelato che l'irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete svolge un ruolo causale cruciale e precedentemente non riconosciuto nella degenerazione dei capillari retinici mediata dall'infiammazione. L'aumento della rigidità capillare retinica deriva dalla sovraespressione della lisil ossidasi, un enzima che lega e irrigidisce la matrice subendoteliale. Poiché si prevede che affrontare la DR nella fase iniziale prevenga o rallenti la progressione della DR e la perdita della vista associata, la matrice subendoteliale e la rigidità capillare rappresentano bersagli terapeutici rilevanti e nuovi per la gestione precoce della DR. Inoltre, la misurazione diretta della rigidità capillare retinica può fungere da fase cruciale per la convalida preclinica per lo sviluppo di nuove tecniche di imaging per la valutazione non invasiva della rigidità capillare retinica in soggetti animali e umani. Con questa visione in mente, forniamo qui un protocollo dettagliato per l'isolamento e la misurazione della rigidità dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale utilizzando la microscopia a forza atomica.

Introduzione

I capillari retinici sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi retinica e della funzione visiva. Infatti, la loro degenerazione nel diabete precoce è fortemente implicata nello sviluppo di complicanze potenzialmente visibili della retinopatia diabetica (DR), una condizione microvascolare che colpisce quasi il 40% di tutti gli individui con diabete¹. L'infiammazione vascolare contribuisce in modo significativo alla degenerazione capillare retinica nella DR. Studi precedenti hanno dimostrato un ruolo importante per segnali molecolari e biochimici aberranti nell'infiammazione vascolare retinica indotta dal diabete

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con la dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e approvate dai comitati istituzionali per l'uso degli animali e della cura (IACUC; numero di protocollo ARC-2020-030) presso l'Università della California, Los Angeles (numero di garanzia per il benessere degli animali dell'istituto OLAW A3196-01). Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando capillari retinici isolati da topi maschi adulti (20 settimane) C57BL/6J del peso di ~25 g (topi diabetici) e ~32 g (topi non diabetici; Jackson Laboratory).

Discussione

L'AFM è stato ampiamente utilizzato per misurare i cambiamenti associati alla malattia nella rigidità dei vasi più grandi, come l'aorta e le arterie¹⁶. Questi risultati hanno contribuito a stabilire il ruolo della meccanobiologia endoteliale nelle complicanze cardiovascolari come l'aterosclerosi¹⁷. Sulla base di questi risultati, abbiamo iniziato a studiare il ruolo precedentemente non riconosciuto della meccanobiologia endoteliale nello sviluppo di lesioni microvascolar.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective