Isolement de capillaires rétiniens de souris et de matrice sous-endothéliale pour la mesure de la rigidité à l’aide de la microscopie à force atomique

Résumé

Nous avons récemment identifié le raidissement capillaire rétinien comme un nouveau paradigme pour le dysfonctionnement rétinien associé au diabète. Ce protocole détaille les étapes d’isolement des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à partir de cultures endothéliales rétiniennes, suivi d’une description de la technique de mesure de la rigidité par microscopie à force atomique.

Résumé

La dégénérescence capillaire rétinienne est une caractéristique clinique des premiers stades de la rétinopathie diabétique (RD). Nos études récentes ont révélé que le raidissement capillaire rétinien induit par le diabète joue un rôle causal crucial et jusqu’alors méconnu dans la dégénérescence des capillaires rétiniens induite par l’inflammation. L’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne résulte de la surexpression de la lysyl oxydase, une enzyme qui réticule et rigidifie la matrice sous-endothéliale. Étant donné que le fait de s’attaquer à la RD à un stade précoce devrait prévenir ou ralentir la progression de la RD et la perte de vision associée, la matrice sous-endothéliale et la rigidité capillaire représentent des cibles thérapeutiques pertinentes et nouvelles pour la prise en charge précoce de la RD. De plus, la mesure directe de la rigidité capillaire rétinienne peut servir d’étape de validation préclinique cruciale pour le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour l’évaluation non invasive de la rigidité capillaire rétinienne chez les sujets animaux et humains. Dans cette optique, nous proposons ici un protocole détaillé pour la mesure de l’isolement et de la rigidité des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à l’aide de la microscopie à force atomique.

Introduction

Les capillaires rétiniens sont essentiels au maintien de l’homéostasie rétinienne et de la fonction visuelle. En effet, leur dégénérescence au stade précoce du diabète est fortement impliquée dans le développement de complications menaçant la vision de la rétinopathie diabétique (RD), une affection microvasculaire qui touche près de 40 % de toutes les personnes atteintes de diabète¹. L’inflammation vasculaire contribue de manière significative à la dégénérescence capillaire rétinienne dans la RD. Des études antérieures ont démontré un rôle important pour les signaux moléculaires et biochimiques aberrants dans l’inflammatio....

Protocole

Toutes les procédures sur des animaux ont été effectuées conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et approuvées par les comités institutionnels d’utilisation des animaux et de soins (IACUC ; numéro de protocole ARC-2020-030) à l’Université de Californie à Los Angeles (numéro d’assurance du bien-être animal de l’institution OLAW A3196-01). Le protocole suivant a été réalisé à l’aide de capillaires rétiniens isolés de souris C57BL/6J mâles adultes (âgées de 20 semaines) pesant ~25 g (souris diabétiques) et ~32 g (souris non diabétiques ; Jackson L....

Discussion

L’AFM a été largement utilisée pour mesurer les changements associés à la maladie dans la rigidité des gros vaisseaux, tels que l’aorte et les artères¹⁶. Ces résultats ont permis d’établir le rôle de la mécanobiologie endothéliale dans les complications cardiovasculaires telles que l’athérosclérose¹⁷. Sur la base de ces résultats, nous avons commencé à étudier le rôle jusqu’alors non reconnu de la mécanobiologie endothéliale dans le développe.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective