Isolement de capillaires rétiniens de souris et de matrice sous-endothéliale pour la mesure de la rigidité à l’aide de la microscopie à force atomique

Résumé

Nous avons récemment identifié le raidissement capillaire rétinien comme un nouveau paradigme pour le dysfonctionnement rétinien associé au diabète. Ce protocole détaille les étapes d’isolement des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à partir de cultures endothéliales rétiniennes, suivi d’une description de la technique de mesure de la rigidité par microscopie à force atomique.

Résumé

La dégénérescence capillaire rétinienne est une caractéristique clinique des premiers stades de la rétinopathie diabétique (RD). Nos études récentes ont révélé que le raidissement capillaire rétinien induit par le diabète joue un rôle causal crucial et jusqu’alors méconnu dans la dégénérescence des capillaires rétiniens induite par l’inflammation. L’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne résulte de la surexpression de la lysyl oxydase, une enzyme qui réticule et rigidifie la matrice sous-endothéliale. Étant donné que le fait de s’attaquer à la RD à un stade précoce devrait prévenir ou ralentir la progression de la RD et la perte de vision associée, la matrice sous-endothéliale et la rigidité capillaire représentent des cibles thérapeutiques pertinentes et nouvelles pour la prise en charge précoce de la RD. De plus, la mesure directe de la rigidité capillaire rétinienne peut servir d’étape de validation préclinique cruciale pour le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour l’évaluation non invasive de la rigidité capillaire rétinienne chez les sujets animaux et humains. Dans cette optique, nous proposons ici un protocole détaillé pour la mesure de l’isolement et de la rigidité des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à l’aide de la microscopie à force atomique.

Introduction

Les capillaires rétiniens sont essentiels au maintien de l’homéostasie rétinienne et de la fonction visuelle. En effet, leur dégénérescence au stade précoce du diabète est fortement impliquée dans le développement de complications menaçant la vision de la rétinopathie diabétique (RD), une affection microvasculaire qui touche près de 40 % de toutes les personnes atteintes de diabète¹. L’inflammation vasculaire contribue de manière significative à la dégénérescence capillaire rétinienne dans la RD. Des études antérieures ont démontré un rôle important pour les signaux moléculaires et biochimiques aberrants dans l’inflammation vasculaire rétinienne induite par le diabète ^2,3. Cependant, des travaux récents ont introduit un nouveau paradigme pour la pathogenèse de la RD qui identifie le raidissement capillaire rétinien comme un déterminant crucial mais jusqu’alors non reconnu de l’inflammation et de la dégénérescence vasculaires rétiniennes ^4,5,6.

Plus précisément, l’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne induite par le diabète est causée par la régulation à la hausse de l’enzyme lysyl oxydase (LOX) de réticulation du collagène dans les cellules endothéliales rétiniennes (CE), ce qui rigidifie la matrice sous-endothéliale (membrane basale)^4,5,6. Le raidissement matriciel, à son tour, rigidifie les CE rétiniens sus-jacents (en raison de la réciprocité mécanique), conduisant ainsi à l’augmentation globale de la rigidité capillaire rétinienne⁴. De manière cruciale, ce raidissement capillaire rétinien induit par le diabète peut à lui seul favoriser l’activation de la CE rétinienne et la mort de la CE médiée par l’inflammation. Cette régulation mécanique des défauts EC rétiniens peut être attribuée à une altération de la mécanotransduction endothéliale, le processus par lequel les signaux mécaniques sont convertis en signaux biochimiques pour produire une réponse biologique ^7,8,9. Il est important de noter que l’altération des signaux mécaniques de la CE et de la structure de la matrice sous-endothéliale a également été impliquée dans la dégénérescence vasculaire choroïdienne associée à la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) précoce10,11,12, ce qui atteste des implications plus larges de la mécanobiologie vasculaire dans les maladies dégénératives de la rétine.

Notamment, le raidissement capillaire de la rétine se produit au début du diabète, ce qui coïncide avec le début de l’inflammation rétinienne. Ainsi, l’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne peut servir à la fois de cible thérapeutique et de marqueur diagnostique précoce de la RD. À cette fin, il est important d’obtenir des mesures fiables et directes de la rigidité des capillaires rétiniens et de la matrice sous-endothéliale. Cela peut être réalisé à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM), qui offre une technique unique, sensible, précise et fiable pour mesurer directement la rigidité des cellules, de la matrice extracellulaire et des tissus¹³. Un AFM applique une force d’indentation minuscule (de l’ordre du nanoNewton) sur l’échantillon dont la rigidité détermine la mesure dans laquelle le porte-à-faux AFM en retrait se plie - plus l’échantillon est rigide, plus le cantilever se plie, et vice versa. Nous avons largement utilisé l’AFM pour mesurer la rigidité des cellules endothéliales en culture, des matrices sous-endothéliales et des capillaires rétiniens isolés de souris 4,5,6,11,12. Ces mesures de rigidité AFM ont permis d’identifier la mécanobiologie endothéliale comme un déterminant clé de la pathogenèse de la RD et de la DMLA. Pour aider à élargir le champ de la mécanobiologie dans la recherche sur la vision, nous fournissons ici un guide étape par étape sur l’utilisation de l’AFM pour les mesures de rigidité des capillaires rétiniens isolés de souris et de la matrice sous-endothéliale.

Protocole

Toutes les procédures sur des animaux ont été effectuées conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et approuvées par les comités institutionnels d’utilisation des animaux et de soins (IACUC ; numéro de protocole ARC-2020-030) à l’Université de Californie à Los Angeles (numéro d’assurance du bien-être animal de l’institution OLAW A3196-01). Le protocole suivant a été réalisé à l’aide de capillaires rétiniens isolés de souris C57BL/6J mâles adultes (âgées de 20 semaines) pesant ~25 g (souris diabétiques) et ~32 g (souris non diabétiques ; Jackson Laboratory).

1. Isolement des capillaires rétiniens de souris pour la mesure de la rigidité de l’AFM (jours 1 à 4)

REMARQUE : Ce protocole, rapporté dans une étude récente⁴, détaille l’énucléation et la fixation légère de l’œil de souris, l’isolement rétinien et la digestion de la trypsine, ainsi que le montage ultérieur du système vasculaire rétinien résultant sur des lames de microscopie pour la mesure de la rigidité de l’AFM.

1. Énucléation et fixation légère (Jour 1)
   1. Après avoir euthanasié la souris avec une exposition au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale, insérez des micro-pinces derrière le globe oculaire, tenez l’attache musculaire et retirez soigneusement l’œil sans pincer trop fort la micro-pince, ce qui pourrait sectionner le nerf optique.
   2. Placez l’œil énucléé dans du formol à 5 % (v/v) dans du PBS pendant 24 h à 4 °C pour une fixation légère.
      REMARQUE : D’après l’expérience⁴, les yeux non fixes ou plus légèrement fixes produisent des capillaires fragiles qui se fragmentent lors de la préparation des échantillons AFM et de la mesure de la rigidité.
2. Isolement rétinien (jour 2)
   1. Placez l’œil fixe sur un morceau de papier ciré sous un microscope à dissection. Ensuite, à l’aide d’une micro-pince, tenez les restes du muscle et du nerf optique attachés à l’extérieur de l’œil postérieur et orientez l’œil de manière à ce que la cornée soit tournée vers un côté (Figure 1).
   2. À l’aide d’une lame chirurgicale, faites une incision de 1 à 2 mm en arrière et parallèlement au limbe (jonction cornée-sclérotique). Ensuite, tout en maintenant l’œil en place avec la micro-pince, appliquez une force vers le bas avec la lame et continuez à appuyer jusqu’à ce que le segment antérieur de l’œil soit totalement séparé de l’extrémité postérieure (Figure 1). Jetez le segment antérieur et le cristallin. Ne sciez pas d’avant en arrière car cela pourrait causer des dommages à la rétine.
   3. Transférez le segment postérieur (sclère, choroïde et rétine) dans une boîte de 6 cm remplie de PBS (pH 7,4).
   4. À l’aide d’une micro-spatule et en tenant doucement le nerf optique avec une micro-pince, retirez la rétine. Conservez la rétine dans un tube de microcentrifugation de 2 mL contenant du PBS à 4 °C jusqu’à l’isolement capillaire.
       
3. Rinçage de la rétine
   1. Pour rincer une rétine, remplissez six puits d’une plaque à 12 puits avec 1 mL de H₂O (jjH₂O) doublement distillé. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur inversée, transférez la rétine du tube de microcentrifugation de 2 mL dans le premier puits.
   2. Rincez la rétine sur l’agitateur orbital à 120 tr/min pendant 30 min à température ambiante (RT).
   3. À l’aide d’une pipette P1000, pipetez soigneusement l’eau de haut en bas à côté de la rétine, en soufflant de l’eau sur la rétine pour provoquer une légère agitation.
   4. À l’aide de la pipette en verre inversé, transférez la rétine dans le deuxième puits et répétez les étapes 1.3.2 et 1.3.3 4 fois, chaque rinçage étant effectué dans un puits frais (contenant du ddH₂O).
   5. Enfin, transférez la rétine dans le sixième puits et rincez-la pendant la nuit (O/N) à RT sur l’agitateur orbital réglé à 100 RPM pour faciliter la séparation de la neuroglie rétinienne des vaisseaux sanguins lors de la digestion de la trypsine.
4. Digestion de la trypsine rétinienne (Jour 3)
   1. Préparez une solution de trypsine à 10 % (p/v) en dissolvant la poudre de trypsine 1:250 dans un tampon Tris (pH 8 ; 0,1 M). Mélangez doucement en inversant le tube conique plusieurs fois pour minimiser la formation de bulles, ce qui rend plus difficile la confirmation de la solubilité de la trypsine.
   2. Équilibrer la solution de trypsine à 10 % dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 min. Une fois que la poudre de trypsine est complètement dissoute, filtrez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm.
   3. Dans une plaque à 12 puits, ajouter 2 mL/puits/rétine de la solution de trypsine filtrée à 10 %. Ajoutez un peu de solution de trypsine supplémentaire dans le puits voisin (pour équilibrer les parois de la pipette en verre pour les étapes suivantes).
   4. Ajoutez 3 mL de ddH2 Odans trois puits d’une plaque à 6 puits (dédiez ces trois puits à une rétine).
   5. Dans un tube conique de 15 ml, insérer un embout P200 avant d’ajouter 4 ml de la solution de trypsine filtrée à 10 %. Transférez ce tube conique dans le bain à 37 °C pour permettre à l’embout d’être trempé dans de la trypsine pendant 2-3 min, car cela aide à empêcher la rétine de coller aux parois de l’embout dans les dernières étapes.
   6. Après le rinçage O/N de la rétine (à partir de l’étape 1.3.5), utilisez une pipette P1000 pour pipeter soigneusement l’eau de haut en bas à côté de la rétine, en projetant de l’eau sur la rétine pour provoquer une légère agitation.
   7. À l’aide d’une pipette en verre inversé, transférez la rétine rincée dans le puits contenant la trypsine de la plaque à 12 puits (à partir de l’étape 1.4.3). Assurez-vous que la rétine est transférée avec une quantité minimale de ddH₂O résiduelle afin de ne pas diluer considérablement la solution de trypsine. Incuber pendant 3 h à 37 °C.
   8. En centrant l’embout P200 imbibé de trypsine (à partir de l’étape 1.4.5) sur la zone du nerf optique, pipetez doucement l’ensemble du réseau vasculaire de haut en bas pour dissocier le tissu non vasculaire¹⁴.
   9. À l’aide d’une pipette en verre inversé pré-rincée à la trypsine (en pipetant la trypsine de haut en bas 5 fois), transférez le système vasculaire rétinien dans le premier puits contenant de la ddH₂O de la plaque à 6 puits (à partir de l’étape 1.4.4).
   10. Faites tourner la plaque et pipetez le système vasculaire de haut en bas à l’aide d’une pipette en verre inversé rincé à la trypsine pour éliminer tout tissu non vasculaire résiduel.
   11. À l’aide de la pipette en verre, transférez le système vasculaire rétinien dans le deuxième puits contenant du ddH2O de la plaque à 6 puits et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit monté sur la lame pour la mesure de la rigidité AFM.
       REMARQUE : Le système vasculaire rétinien hydraté (en PBS) est structurellement intact à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Cependant, les mesures de rigidité de routine doivent être effectuées à partir de capillaires fraîchement isolés.
5. Montage du système vasculaire rétinien pour la mesure de la rigidité de l’AFM (jour 4)
   1. À l’aide d’une pipette en verre inversée rincée à la trypsine, transférez le système vasculaire rétinien dans le troisième puits contenant de la ddH₂O de la plaque à 6 puits pour éliminer toute solution résiduelle de trypsine.
   2. Nettoyez soigneusement (à l’aide de ddH₂O et d’un chiffon essuie-glace) une lame de microscopie à surface chargée qui sera utilisée pour monter le réseau vasculaire pour la mesure de la rigidité de l’AFM.
      REMARQUE : La surface chargée de la lame assure une liaison solide pour le réseau vasculaire lors de la mesure AFM.
   3. Étiquetez la diapositive et dessinez une zone circulaire de 4 à 5 cm autour du centre avec un stylo hydrophobe pour éviter les déversements d’eau lors des étapes suivantes.
   4. À l’aide d’une pipette en verre inversée rincée à la trypsine, transférez soigneusement le système vasculaire rétinien au centre de la région marquée.
   5. À l’aide d’une pipette P200, retirez soigneusement autant d’eau que possible d’un bord sans aspirer accidentellement le système vasculaire dans la pointe.
   6. Placez la lame dans une enceinte de biosécurité (hotte BSL-2) près de la face avant (maille filtrée) et laissez l’eau résiduelle s’évaporer.
   7. Une fois que le système vasculaire est presque sec, sous un microscope à contraste de phase (grossissement 4x), réhydratez soigneusement le système vasculaire en ajoutant lentement du ddH₂O à l’aide d’une pipette P200 sur un côté de la région marquée. L’ajout de ddH₂O directement sur le système vasculaire le fait se détacher.
   8. Prenez des images en contraste de phase du système vasculaire réhydraté à des grossissements de 4x et 20x pour vous assurer qu’il a une bonne intégrité structurelle et qu’il est correctement étalé (sans se replier sur lui-même) et fixé à une lame de verre, qui sont des critères essentiels pour une mesure fiable de la rigidité AFM.

2. Obtention de matrice sous-endothéliale à partir de cultures de cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes (jours 1 à 17)

REMARQUE : Ce protocole, adapté de Beacham et al.¹⁵ et rapportée dans des études récentes ^4,5,6, décrit la culture REC sur des lamelles en verre modifiées, suivie d’une décellularisation pour obtenir une matrice sous-endothéliale pour la mesure ultérieure de la rigidité de l’AFM.

1. Préparation des lamelles en verre revêtues de gélatine et placage cellulaire (Jour 1)
   REMARQUE : Effectuez l’enrobage de gélatine et les étapes de rinçage PBS⁺⁺ ultérieures dans une hotte de culture tissulaire avant de passer à une hotte chimique pour les étapes ultérieures de traitement au glutaraldéhyde et à l’éthanolamine.
   1. Placer une lamelle en verre circulaire de 12 mm de diamètre autoclavée par puits d’une plaque stérile à 24 puits et ajouter 500 μL de gélatine stérile à 0,2 % (p/v) préchauffée (diluée dans du PBS contenant du calcium et du magnésium ; PBS⁺⁺) à chaque puits contenant une lamelle. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
   2. Aspirer la solution de gélatine, rincer une fois les lamelles avec du PBS⁺⁺ stérile et réticuler la gélatine enrobée en ajoutant 500 μL de glutaraldéhyde à 1 % (v/v) pendant 30 min à RT.
   3. Récupérez et éliminez correctement (conformément aux directives de l’établissement) la solution de glutaraldéhyde avant de rincer les lamelles avec du PBS⁺⁺ pendant 5 minutes sur un agitateur orbital à 100 tr/min en RT. Répétez cette étape de rinçage 5 fois. Lors des trois premiers rinçages, soulevez les lamelles à l’aide d’une pince à épiler stérile pour permettre un rinçage complet du glutaraldéhyde. Toute quantité résiduelle peut réduire la viabilité cellulaire.
   4. Ajouter 800 μL d’éthanolamine 1 M dans la lamelle réticulée de gélatine pendant 30 min à RT pour éteindre toute trace restante de glutaraldéhyde dans le puits.
   5. Recueillir et éliminer correctement (conformément aux directives de l’établissement) la solution d’éthanolamine et rincer les lamelles 5 fois avec du PBS⁺⁺ pendant 5 minutes sur un agitateur orbital à 100 tr/min en RT. Lors des trois premiers rinçages, soulevez les lamelles à l’aide d’une pince à épiler stérile pour permettre un rinçage complet de l’éthanolamine. Toute quantité résiduelle peut réduire la viabilité cellulaire.
   6. Les lamelles réticulées sont maintenant prêtes pour le placage cellulaire.
      REMARQUE : Bien que nous plaquions régulièrement les cellules immédiatement après la préparation des lamelles, il peut être utile de comparer le placage des cellules sur des lamelles de gélatine réticulée stockées dans PBS⁺⁺ à 4 °C pendant 1 à 2 jours.
   7. Dans des conditions stériles dans un capot de culture tissulaire, mettez en plaques des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes (CER) dans un milieu/puits de 500 μL à une densité qui atteint 100 % de confluence en 24 heures, comme le confirme la microscopie à contraste de phase.
      REMARQUE : Il est important d’atteindre la confluence dans les 24 heures, car la quiescence REC qui en résulte augmentera la capacité des cellules à sécréter de la matrice (reportez-vous à l’étape suivante). D’après notre expérience avec les CER humaines, une densité de placage de 4 x 10⁴ cellules/cm² est suffisante pour atteindre la confluence en 24 heures. Cependant, comme la taille des CER varie selon les espèces (p. ex. les CER de souris sont beaucoup plus petites), il peut être nécessaire d’optimiser la densité initiale du placage.
2. Production de matrice sous-endothéliale par culture REC (Jour 2-16)
   1. Une fois que les cellules ont atteint la confluence (~24 h), remplacer le milieu de culture par un milieu frais complété par de l’acide ascorbique stérilement filtré (concentration finale de 200 μg/mL).
      REMARQUE : Tout traitement REC avec des facteurs de risque de maladie (par exemple, une glycémie élevée, des produits finaux de glycation avancée, etc.) ou des agents pharmacologiques peut commencer dès maintenant, avec le traitement à l’acide ascorbique.
   2. Changez le milieu de culture supplémenté en acide ascorbique tous les deux jours pendant 15 jours.
      REMARQUE : L’acide ascorbique est instable en solution. Préparez une solution mère fraîche 100X tous les deux jours pour une supplémentation moyenne.
3. Décellularisation des cultures REC pour obtenir la matrice sous-endothéliale (Jour 16)
   1. Après 15 jours de traitement à l’acide ascorbique, retirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS sans calcium/magnésium.
   2. Décellulariser les cultures REC en ajoutant 250 μL/par puits de tampon de décellularisation chaud (20 mM d’hydroxyde d’ammonium et 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS) pendant ~2-3 min. Confirmez l’élimination des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase (grossissement de 10x).
   3. Retirez délicatement le tampon de décellularisation sans perturber la matrice sous-endothéliale sécrétée par REC et ajoutez 0,5 mL de PBS dans chaque puits.
      REMARQUE : Pour s’assurer que la matrice sous-endothéliale ne se détache pas pendant cette étape de rinçage et les suivantes, effectuez un rinçage doux uniquement avec une pipette P1000. Ne pas effectuer d’aspiration intra-utérine.
   4. Conservez les plaques à 4 °C pendant la nuit pour stabiliser la matrice sécrétée par REC.
4. Traitement à la DNase de la matrice sous-endothéliale pour éliminer les débris cellulaires (Jour 17)
   1. Rincer la matrice sous-endothéliale de l’étape 2.3.4 avec 800 μL de PBS/puits.
   2. Retirez délicatement le PBS et incubez la matrice avec 200 μL de DNase I sans RNase (30 K unités) à 37 °C pendant 30 min pour éliminer toute trace de débris cellulaires. Vérifiez l’efficacité du traitement par DNase en recherchant soigneusement les débris cellulaires au microscope à contraste de phase.
   3. Retirez délicatement la solution de DNase I et rincez la matrice sous-endothéliale deux fois avec 800 μL de PBS/well.
   4. Vérifiez que la matrice sous-endothéliale fibreuse à l’échelle macroscopique est visible au microscope à contraste de phase (grossissement de 10x). La visualisation des fibres matricielles plus fines à l’échelle nanométrique nécessite un balayage topographique AFM ou une imagerie confocale haute résolution de protéines matricielles immunomarquées à un grossissement de 100x.
   5. Utilisez immédiatement la matrice sous-endothéliale fraîche (non fixée) pour la mesure de la rigidité AFM.
   6. Après la mesure de l’AFM, fixer les échantillons de matrice avec 1 % (v/v) de paraformaldéhyde (15 min à température ambiante) et stockés à 4 °C pour l’immunomarquage avec des anticorps contre les protéines de la matrice sous-endothéliale et/ou les enzymes de réticulation.

3. Mesure de la rigidité AFM

REMARQUE : Ce protocole, adapté d’un manuel d’utilisation standard de l’AFM et rapporté dans des études récentes ^4,5, détaille l’acquisition et l’analyse des données de rigidité des capillaires rétiniens et de la matrice sous-endothéliale à l’aide d’un logiciel d’AFM et d’analyse de données. Bien que les étapes décrites ci-dessous soient basées sur un modèle spécifique d’AFM (voir le tableau des matériaux), les principes sous-jacents sont généralement applicables à tous les modèles AFM.

1. Sélection de la sonde en porte-à-faux
   REMARQUE : Les échantillons biologiques mous nécessitent des porte-à-faux souples qui peuvent se plier lors de l’indentation de l’échantillon tandis que les dimensions de la sonde sont sélectionnées pour correspondre aux dimensions de l’échantillon.
   1. Pour mesurer la rigidité des vaisseaux rétiniens de souris de 5 à 8 m de diamètre, utilisez une sonde cantilever de 1 m de rayon avec une constante de ressort (k) de 0,2 à 0,3 N/m. Pour mesurer la rigidité d’une matrice sous-endothéliale composée de fibres à l’échelle nanométrique, utilisez une sonde en porte-à-faux de rayon de 70 nm avec une constante de ressort (k) de 0,06-0,1 N/m.
2. Montage en porte-à-faux
   1. Sur l’ordinateur AFM, ouvrez le logiciel qui contrôle l’unité AFM et la caméra reliée à un microscope à contraste de phase utilisé pour visualiser le cantilever et l’échantillon.
   2. Fixez le support de porte-à-faux sur le support de changement en porte-à-faux et montez le porte-à-faux sélectionné sur le support à l’aide d’une pince d’horloger sous un stéréoscope sans endommager physiquement le porte-à-faux. Serrez la vis du support pour fixer le cantilever.
   3. Placez et verrouillez le support en porte-à-faux sur la tête AFM qui repose sur le support.
   4. À l’aide de la fonction de moteur pas à pas du logiciel AFM, retirez la tête AFM au point le plus élevé et réglez cette position sur le point zéro dans le logiciel. Cette étape empêche le cantilever AFM de heurter accidentellement l’étage d’échantillonnage lors du montage de la tête AFM (étape suivante).
   5. Soulevez avec précaution la tête AFM de son support et montez-la sur l’étage d’échantillonnage AFM en plaçant les pieds dans leurs fentes respectives.
3. Alignement laser
   REMARQUE : L’alignement laser initial est effectué sans aucun échantillon (c’est-à-dire en mode Air) car il assure un alignement plus précis du faisceau laser sur la pointe en porte-à-faux (en empêchant la réfraction laser dans le liquide). Cependant, comme les échantillons biologiques sont immergés dans un milieu dont l’indice de réfraction est différent de celui de l’air, il est important de réaligner le laser dans le milieu avant de mesurer la rigidité.
   1. Pour l’alignement laser dans l’air, placez la tête AFM sur la platine d’échantillonnage et utilisez l’objectif 10x et la caméra attachée pour visualiser le porte-à-faux sur le moniteur en mode direct. Le laser infrarouge est caché à la vue de l’utilisateur mais est visible avec une caméra CCD.
   2. Sélectionnez la fonction Spectroscopie de force en mode contact sur le logiciel et ouvrez la fenêtre intitulée Alignement laser.
   3. À l’aide des deux vis marquées sur le côté laser sur la tête AFM, focalisez le faisceau laser sur le porte-à-faux de sorte que la valeur SUM dans la fenêtre d’alignement du laser soit la plus élevée. Pour ce faire, focalisez le laser au centre ou autour du centre du cantilever.
   4. À l’aide des vis de réglage du détecteur, réglez le photodétecteur de manière à ce que le point laser soit au centre de la fenêtre d’alignement laser.
   5. À l’aide de la vis de réglage du miroir, ajustez le miroir pour vous assurer que la valeur SUM est à la valeur la plus élevée possible.
      REMARQUE : Une valeur SUM élevée garantit une évaluation sensible et précise de la rigidité de l’échantillon. Ainsi, les étapes d’alignement du laser et de réglage du miroir doivent être effectuées pour obtenir la valeur SUM la plus élevée.
   6. Ensuite, pour l’alignement laser dans un liquide, ajoutez le milieu de culture souhaité dans une boîte et montez-le fermement sur la scène pour éviter toute vibration ou dérive, ce qui crée des artefacts de mesure lors de l’indentation de l’échantillon.
   7. Tout en regardant le flux de la caméra en direct concentré sur le cantilever, abaissez-le dans le liquide à l’aide de la fonction de moteur pas à pas.
   8. Répétez les étapes 3.3.4 et 3.3.5 pour vous assurer que la valeur SUM reste la plus élevée et que le spot laser se trouve au centre de la fenêtre d’alignement laser.
4. Étalonnage de la constante de ressort en porte-à-faux
   REMARQUE : Bien que les sondes en porte-à-faux soient équipées d’une constante de ressort calibrée par le fabricant (k), il est recommandé de vérifier indépendamment sa valeur (en liquide) avant de commencer une mesure. Utilisez une surface en verre propre qui minimise les interactions entre la sonde en porte-à-faux et la surface en verre.
   1. La force de consigne appliquée par le porte-à-faux définit la déviation laser maximale du porte-à-faux autorisée pour une indentation de force. Réglez-le initialement à 1,5 V. Si le cantilever ne parvient pas à s’approcher de cette force de consigne donnée, augmentez-la progressivement jusqu’à ce qu’elle intaille l’échantillon et génère une courbe d’indentation de force.
   2. La longueur Z signifie la distance maximale à laquelle le piézo z se retire une fois que le porte-à-faux a atteint le point de consigne lors de l’indentation de l’échantillon. La longueur Z doit être au moins suffisante pour garantir que la sonde en porte-à-faux se sépare proprement de l’échantillon. Pour l’étalonnage de la constante de ressort sur une surface en verre, réglez la longueur Z à 1 μm.
   3. La vitesse Z fait référence à la vitesse à laquelle le piézo Z déplace le porte-à-faux verticalement vers l’échantillon lors de l’indentation de force. Il doit être optimisé car une vitesse très faible capturera principalement le comportement visqueux de l’échantillon, tandis qu’une vitesse très élevée capturera principalement le comportement élastique. La vitesse optimale est censée capturer la véritable nature viscoélastique des échantillons biologiques. Réglez la vitesse Z à 2 μm/s pour les échantillons biologiques viscoélastiques.
   4. La hauteur cible sur la plage Z indique la distance approximative de l’échantillon à laquelle le piézo z repose après avoir mesuré une courbe de force et avant de se déplacer vers un autre emplacement de l’échantillon. La hauteur cible de la plage Z doit être supérieure à la hauteur des entités de l’échantillon. Réglez la hauteur cible sur la plage Z à 7,5 μm.
   5. À l’aide de la fonction Step Motor , rapprochez le cantilever assez près de la surface de l’échantillon (à en juger par la mise au point dans l’image en contraste de phase à un grossissement de 10x) avant de sélectionner la fonction d’approche dans la fenêtre de spectroscopie de force du mode contact pour abaisser le cantilever par petits incréments de 15 μm.
   6. Cliquez sur Acquérir pour capturer une courbe de force.
   7. Sélectionnez la courbe de force, ouvrez-la dans la fenêtre du gestionnaire d’étalonnage et sélectionnez Mode basé sur le contact dans la section méthode.
   8. À l’aide de la fonction Select-fit Range, sélectionnez la courbe de rétraction en porte-à-faux pour un ajustement de courbe linéaire. Ensuite, cochez la case Vérification de la sensibilité pour convertir l’unité de force de V à N.
   9. Soulevez le porte-à-faux de 100 à 200 μm dans le liquide et sélectionnez la fonction Bruit thermique . Encore une fois, à l’aide de la plage de sélection d’ajustement, ajustez la courbe en cloche du bruit thermique avec une courbe de Lorentz. Après l’ajustement de la courbe, sélectionnez la case Constante de ressort (k). Vérifiez que la constante de ressort (k) est proche de la valeur du fabricant et notez-la pour référence future. Après l’étalonnage, l’unité de consigne passera de mV à nN.
      REMARQUE : Le bruit thermique est la fréquence naturelle du porte-à-faux à une température particulière. Une correction du bruit thermique est nécessaire pour une mesure précise de la constante du ressort.
5. Acquisition des courbes force-distance
   1. Placez l’échantillon monté sur lame (vaisseaux rétiniens ou matrice sous-endothéliale) sur la platine AFM et sélectionnez Spectroscopie de force en mode contact dans la section expérience du logiciel.
   2. Réglez la force de consigne à 0,5 nN et cliquez sur Approche, qui est nettement supérieure à la déflexion thermique des sondes en porte-à-faux SAA-SPH 1 μm et PFQNM-LC-A 70 nm, assurant une approche en porte-à-faux douce vers l’échantillon.
   3. Une fois que le porte-à-faux a détecté la surface et est revenu à sa hauteur cible au repos, réglez le point de consigne à 0,2 nN pour la sonde en porte-à-faux SAA-SPH 1 μm plus rigide ou à 0,1 nN pour la sonde en porte-à-faux PFQNM-LC-A 70 nm plus souple. Ce réglage du point de consigne garantit que les porte-à-faux rigides et souples se plient facilement lors de l’indentation de l’échantillon (voir section 3.1).
   4. Réglez la longueur Z à ~2,5 μm pour assurer une séparation nette de la sonde en porte-à-faux des échantillons biologiques lors de la rétraction (voir l’étape 3.4.2) et la vitesse Z à 2 μm/s (voir l’étape 3.4.3).
   5. À l’aide des vis de platine sur la platine AFM, positionnez soigneusement la sonde en porte-à-faux à l’endroit souhaité sur l’échantillon.
      REMARQUE : Étant donné que les capillaires ne s’écartent pas toujours à plat sur la glissière, il est prudent de retirer le cantilever de 10 à 20 μm supplémentaires de sa hauteur cible de repos avant de déplacer la platine.
   6. Cliquez sur Approche pour rapprocher le porte-à-faux de l’échantillon, puis cliquez sur Acquérir pour capturer les courbes de force pour les emplacements souhaités. Enregistrez toutes les courbes de force pour analyse.
6. Analyse des données
   1. Ouvrez la courbe de force dans le logiciel de traitement des données.
   2. Sélectionnez la courbe de force de rétraction pour l’analyse des données (similaire à l’étape 3.4.8).
   3. À l’aide de la fonction de lissage des données, lissez la courbe de force à l’aide d’un filtre gaussien pour supprimer le bruit indésirable dans les données acquises.
   4. À l’aide de la fonction de soustraction de la ligne de base, ajustez la valeur de la pente et de l’amplitude de la partie de la ligne de base (sans contact) de la courbe de force à zéro.
   5. Cliquez sur la fonction Point de contact pour ramener automatiquement le point de contact de la courbe de force aux coordonnées (0,0) sur les axes X et Y.
   6. À l’aide de la fonction Position verticale de la pointe, calculez la position verticale réelle du porte-à-faux sur l’axe Y en corrigeant toute indentation de l’échantillon.
   7. Sur la courbe de force traitée, appliquez la fonction d’ajustement de l’élasticité en sélectionnant d’abord la forme et le rayon de la pointe (en fonction de la sonde en porte-à-faux sélectionnée), puis en ajustant la courbe de force à l’aide du modèle Hertz/Sneddon.
      1. Si l’indentation de la matrice par la sonde de rayon de 70 nm dépasse 70 nm, ce qui est généralement le cas, sélectionnez la forme de l’extrémité paraboloïde . Pour la mesure de la rigidité capillaire, l’indentation de l’échantillon par la sonde de rayon de 1 μm ne dépasse jamais 1 μm, sélectionnez donc la forme de l’embout Sphere . De plus, si le point de contact de la courbe ajustée ne coïncide pas avec le point de contact de la courbe de rétraction réelle, cochez la case Courbe de décalage .
   8. Notez et enregistrez la valeur du module de Young (rigidité).

Résultats

Capillaires rétiniens de souris
La mesure de la rigidité AFM de capillaires rétiniens isolés implique des étapes de manipulation d’échantillons susceptibles d’endommager leur intégrité mécanostructurale. Pour éviter cela et garantir ainsi la faisabilité, la fiabilité et la reproductibilité des mesures AFM, les yeux énucléés sont fixés dans du formol à 5 % pendant une nuit à 4 °C avant d’être isolés du vaisseau. Ce protocole de fixation douce avec une concentration réduite ...

Discussion

L’AFM a été largement utilisée pour mesurer les changements associés à la maladie dans la rigidité des gros vaisseaux, tels que l’aorte et les artères¹⁶. Ces résultats ont permis d’établir le rôle de la mécanobiologie endothéliale dans les complications cardiovasculaires telles que l’athérosclérose¹⁷. Sur la base de ces résultats, nous avons commencé à étudier le rôle jusqu’alors non reconnu de la mécanobiologie endothéliale dans le développe...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective