分离小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质，使用原子力显微镜进行刚度测量

摘要

我们最近确定视网膜毛细血管硬化是与糖尿病相关的视网膜功能障碍的新范式。该协议详细阐述了从视网膜内皮培养物中分离小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质的步骤，然后描述了使用原子力显微镜的刚度测量技术。

摘要

视网膜毛细血管变性是糖尿病视网膜病变 （DR） 早期阶段的临床标志。我们最近的研究表明，糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬化在炎症介导的视网膜毛细血管变性中起着至关重要且以前未被认识的因果关系。视网膜毛细血管硬度的增加是由于赖氨酰氧化酶的过表达，赖氨酰氧化酶是一种交联和硬化内皮下基质的酶。由于在早期解决 DR 有望预防或减缓 DR 进展和相关的视力丧失，因此内皮下基质和毛细血管僵硬是早期 DR 管理的相关和新型治疗靶点。此外，直接测量视网膜毛细血管硬度可以作为开发新成像技术的关键临床前验证步骤，用于对动物和人类受试者的视网膜毛细血管硬度进行无创评估。考虑到这一观点，我们在这里提供了使用原子力显微镜对小鼠视网膜毛细血管和内皮下基质进行隔离和刚度测量的详细方案。

引言

视网膜毛细血管对于维持视网膜稳态和视觉功能至关重要。事实上，他们在早期糖尿病中的退化与糖尿病视网膜病变 （DR） 威胁视力并发症的发展密切相关，DR 是一种影响近 40% 的糖尿病患者的微血管疾病¹。血管炎症对 DR 中的视网膜毛细血管变性有显著影响。过去的研究表明，异常的分子和生化线索在糖尿病诱导的视网膜血管炎症中起重要作用 ^2,3。然而，最近的工作引入了一种 DR 发病机制的新范式，该范式将视网膜毛细血管硬化确定为视网膜血管炎症和变性的关键但以前未被认识的决定因素 ^4,5,6。

具体来说，糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬度增加是由视网膜内皮细胞 （EC） 中胶原蛋白交联酶赖氨酰氧化酶 （LOX） 的上调引起的，这会使内皮下基质（基底膜）变硬^4,5,6。反过来，基质硬化使覆盖的视网膜 EC 变硬（由于机....

研究方案

所有动物手术均按照视觉与眼科学研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行，并经加州大学洛杉矶分校机构动物和护理使用委员会 （IACUC;协议编号 ARC-2020-030）（OLAW 机构动物福利保证编号 A3196-01）批准。使用从体重 ~25 g（糖尿病小鼠）和 ~32 g（非糖尿病小鼠）的成年（20 周龄）雄性 C57BL/6J 小鼠中分离的视网膜毛细血管执行了以下方案;Jackson Laboratory）。

1. 分离小鼠视网膜毛细血管以进行 AFM 刚度测量（第 1-4 天）

注意：该协议在最近的一项研究⁴ 中报告，详细介绍了小鼠眼的摘除和轻度固定、视网膜分离和胰蛋白酶消化，以及随后将所得视网膜脉管系统安装在显微镜载玻片上用于 AFM 刚度测量。

1. 眼球摘除术和轻度固定术（第 1 天）
   1. 在对小鼠实施二氧化碳暴露后颈椎脱位实施安乐死后，将微型镊子插入眼球后面，抓住肌肉附件，小心地将眼睛拉出，不要将微型镊子捏得太紧，这可能会切断视神经。
   2. 将去核的眼睛置于 PBS 中的 5% （v/v） 福尔马林中，在 4 °C 下 24 小时以进行轻度固定。
      注：根据经验⁴，未固定或较轻微固定的眼睛会产生脆弱的毛细血管....

讨论

AFM 已广泛用于测量较大血管（如主动脉和动脉）的疾病相关硬度变化¹⁶。这些发现有助于确定内皮力学生物学在心血管并发症（如动脉粥样硬化¹⁷）中的作用。基于这些发现，我们已经开始研究以前未被认识的内皮力学生物学在早期 DR 视网膜微血管病变发展中的作用。然而，这一追求的成功取决于对糖尿病诱导的视网膜毛细血管硬度变化的准确测量。最近的研?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filter	Merck Millipore	SLGVM33RS	Low Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesium	Corning	20-031-CV	Final concentration 1X, pH 7.4
12-well plate	Falcon Corning	353043
15 mL centrifuge tube	Corning	430791	Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringe	BD	302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipette	FisherBrand	13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002
6-well plate	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Blade holder	X-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10	Bard-Parker	371110
Dental Wax	Electron Microscopy Sciences	50-949-027
Dissecting microscope	Am-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	Final concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissue	Kimtech Science	34133
Micro spatula	Fine Science Tools	10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  Tweezer	Ted Pella, Inc.	5667
Phase contrast microscope	Nikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	22363352
Stereoscope	AmScope	SM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mm	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology Grade	VWR	E553-500ML	pH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture Grade	VWR	VWRV0458-25G	10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology Grade	Corning	46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7.4
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV antibody	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Fibronectin antibody	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Glass coverslips (12mm)	Fisher	12-541-000
Glutaraldehyde	Electron microscopy Sciences	16220
Human retinal endothelial cells (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 medium	Corning	15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Trypsin	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Measurement
1 µm Probe	Bruker	SAA-SPH-1UM	A 19 micron tall hemispherical probe with 1 micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probe	Bruker	PFQNM-LC-V2	A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,  Spring constant 0.1N/m
camera	XCAM family	Toupcam	1080P HDMI
Desktop to run the camera	Asus	Asus desktop	Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslip	Cellvis	D29-14-1.5-N	29mm glass bottom dish with  14 mm micro-well
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscope	Zeiss	Axiovert 200	Inverted microscope with 10X objective