قياسات مجهر القوة الذرية للغضروف في أطراف قنافذ البحر السليمة والمتجددة

Summary

في هذا البروتوكول ، نوضح كيفية تحضير أنسجة قنافذ البحر للفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) وإجراء قياسات المسافة البادئة في غضروف الأطراف السليم والمتجدد.

Abstract

توفر القوى الميكانيكية إشارات مهمة لوظيفة الخلية الطبيعية وتكوين الأنماط في الأنسجة النامية ، وقد تمت دراسة دورها على نطاق واسع أثناء التطور الجنيني والتسبب في المرض. نسبيا ، لا يعرف سوى القليل عن هذه الإشارات أثناء تجديد.

قنافذ البحر هي كائن حي نموذجي مهم لدراسة التجديد ، نظرا لقدرته على استعادة العديد من الأعضاء والأنسجة بالكامل بعد الإصابة ، بما في ذلك الغضاريف والعظام المفقودة. نظرا لدورها الحاسم كنسيج داعم رئيسي في جسم الفقاريات ، فإن استعادة وظيفة الهيكل العظمي أثناء التجديد تتطلب استعادة الهياكل المفقودة بالإضافة إلى خصائصها الميكانيكية. يصف هذا البروتوكول طريقة لمعالجة عينات أطراف قنافذ البحر للفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) ، وهو المعيار الذهبي لاستكشاف الخصائص الميكانيكية للخلايا والأنسجة بدقة مكانية عالية.

من خلال الاستفادة من القدرات التجديدية لقنفذ قنافذ البحر ، قامت هذه الدراسة بقياس تصلب غضروف الأطراف أثناء التوازن ومرحلتين من تجديد الأطراف: تحلل أنسجة الأنسجة وتكثيف الغضاريف. نوضح أن AFM هي أداة قيمة لاكتساب رؤى حول إعادة هيكلة الأنسجة الديناميكية والتغيرات الميكانيكية التي تحدث أثناء التجديد.

Introduction

يوفر الهيكل العظمي ، وخاصة الغضاريف والعظام ، الدعم الميكانيكي الرئيسي للأنسجة الرخوة في الجسم في الفقاريات. لذلك ، من المرجح أن يؤدي أي ضرر في نظام الهيكل العظمي إلى الإضرار بشكل كبير بالوظائف وحتى البقاء على قيد الحياة. في البشر ، تعد كسور العظام واحدة من أكثر الإصابات الرضحية شيوعا¹ ، والتي يتم إصلاح معظمها في غضون أسابيع ، ولكن 5٪ -10٪ منها ستعاني من تأخير في الشفاء أو لن تتعافى تماما^2،3. علاوة على ذلك ، لا يستطيع البشر التعافي من فقدان العظام أو الغضاريف على^{نطاق واسع 4،5}. ومع ذلك ، يمكن لبع....

Protocol

نمت قنافذ البحر (Ambystoma mexicanum) في منشأة Axolotl التابعة لمركز العلاجات التجديدية في دريسدن (CRTD) التابع لجامعة دريسدن للتكنولوجيا (TUD). يمكن العثور على وصف كامل لظروف التربية في²⁴. باختصار ، تم الاحتفاظ بالغرف عند 20-22 درجة مئوية مع دورة نهارية / ليلية 12/12 ساعة. تم إجراء جميع عمليات المناولة والجراحة وفقا لإرشادات لجنة الأخلاقيات المحلية وتمت الموافقة عليها من قبل Landesdirektion Sachsen ، ألمانيا.

استخدمت هذه الدراسة قنافذ البحر البيضاء (d / d) لجميع التجارب ، وهي سلالة متحولة تحدث بشكل طبيعي تفتقر إلى تصبغ الجسم (القليل من الميلانوفورات والزانثوفورات أ....

النتائج

باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، قمنا بقياس معامل يونغ الظاهر لأنسجة الأطراف القنفذية الغضروفية في ظروف الاستتباب ("السليم") ، أثناء الانحلال النسيجي المبكر للغضروف ، ومراحل تكثيف الغضروف اللاحقة (الشكل 1 أ). قمنا أيضا بالتحقيق في الخصائص الميكانيكية ل.......

Discussion

هنا ، نوضح تقنية لقياس تصلب الغضروف في أطراف قنافذ البحر باستخدام AFM. ومع ذلك ، يمكن توسيع هذه الطريقة لاستكشاف أنواع الأنسجة الأخرى أيضا. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية لقياسات AFM الناجحة في إعداد العينة ، والتي أثبتت أنها تمثل تحديا خاصا مع عينات قنافذ البحر. وجدنا أن فحص س.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning