Sağlam ve Yenileyici Aksolotl Ekstremitelerde Kıkırdak Atomik Kuvvet Mikroskobu Ölçümleri

Özet

Bu protokolde, aksolotl dokusunun atomik kuvvet mikroskobu (AFM) için nasıl hazırlanacağını ve sağlam ve yenileyici ekstremite kıkırdağında girinti ölçümlerinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz.

Özet

Mekanik kuvvetler, gelişmekte olan dokularda normal hücre fonksiyonu ve patern oluşumu için önemli sinyaller sağlar ve rolleri embriyogenez ve patogenez sırasında geniş çapta incelenmiştir. Nispeten, hayvan rejenerasyonu sırasında bu sinyaller hakkında çok az şey bilinmektedir.

Aksolotl, eksik kıkırdak ve kemik de dahil olmak üzere yaralanmadan sonra birçok organ ve dokuyu tamamen eski haline getirme yeteneği göz önüne alındığında, rejenerasyon çalışması için önemli bir model organizmadır. Omurgalı vücudundaki ana destek dokusu olarak çok önemli rolü nedeniyle, rejenerasyon sırasında iskelet fonksiyonunun yeniden kazanılması, hem eksik yapıların restorasyonunu hem de mekanik özelliklerini gerektirir. Bu protokol, hücre ve doku mekanik özelliklerini yüksek uzamsal çözünürlükte araştırmak için altın standart olan atomik kuvvet mikroskobu (AFM) için aksolotl uzuv örneklerinin işlenmesi için bir yöntemi açıklar.

Aksolotlun rejeneratif yeteneklerinden yararlanan bu çalışma, homeostaz sırasında ekstremite kıkırdağının sertliğini ve ekstremite rejenerasyonunun iki aşamasını ölçtü: doku histolizi ve kıkırdak yoğunlaşması. AFM'nin dinamik doku yeniden yapılandırması ve rejenerasyon sırasında meydana gelen mekanik değişiklikler hakkında bilgi edinmek için değerli bir araç olduğunu gösteriyoruz.

Giriş

İskelet, özellikle kıkırdak ve kemikler, omurgalılarda vücudun yumuşak dokuları için ana mekanik desteği sağlar. Bu nedenle, iskelet sistemindeki herhangi bir hasarın, işlevselliği ve hatta hayatta kalmayı büyük ölçüde tehlikeye atması muhtemeldir. İnsanlarda, kemik kırıkları en yaygın travmatik yaralanmalardan biridir¹, çoğu birkaç hafta içinde onarılır, ancak bunların %5-10'u iyileşmede gecikmeler yaşar veya hiçbir zaman tam olarak iyileşmez ^2,3. Ayrıca, insanlar geniş kemik veya kıkırdak kaybından kurtulamazlar ^4,5<....

Protokol

Aksolotllar (Ambystoma mexicanum), Dresden Teknoloji Üniversitesi'ne (TUD) bağlı Dresden Rejeneratif Tedaviler Merkezi'nin (CRTD) Axolotl tesisinde yetiştirildi. Hayvancılık koşullarının tam bir açıklaması^24'te bulunabilir. Kısaca, odalar 12/12 saat gündüz/gece döngüsü ile 20-22 °C'de tutuldu. Tüm taşıma ve cerrahi prosedürler yerel etik kurul yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Almanya'daki Landesdirektion Sachsen tarafından onaylandı.

Bu çalışmada, tüm deneyler için beyaz (d/d) aksolotllar, vücut pigmentasyonu olmayan (melanoforlar ve ksantoforlar çok a....

Tartışmalar

Burada, AFM ile aksolotl ekstremitelerde kıkırdak sertliğinin ölçümü için bir teknik gösteriyoruz. Bununla birlikte, bu yöntem diğer doku tiplerini de araştırmak için genişletilebilir. Başarılı AFM ölçümleri için önemli bir adım, aksolotl numunelerinde özellikle zor olduğu kanıtlanan numune hazırlamadır. Hala agaroz bloğuna gömülü olan doku yüzeyini incelemenin, doku bütünlüğünü korumanın en iyi yolu olduğunu bulduk. Bunun nedeni, aksolotl derisi.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning