Mediciones de microscopía de fuerza atómica de cartílago en extremidades de ajolote intactas y en regeneración

Resumen

En este protocolo, mostramos cómo preparar tejido de ajolote para microscopía de fuerza atómica (AFM) y realizar mediciones de indentación en cartílago de extremidades intacto y en regeneración.

Resumen

Las fuerzas mecánicas proporcionan señales importantes para la función celular normal y la formación de patrones en los tejidos en desarrollo, y su papel ha sido ampliamente estudiado durante la embriogénesis y la patogénesis. Comparativamente, se sabe poco de estas señales durante la regeneración animal.

El ajolote es un organismo modelo importante para el estudio de la regeneración, dada su capacidad para restaurar completamente muchos órganos y tejidos después de una lesión, incluidos los cartílagos y huesos faltantes. Debido a su papel crucial como principal tejido de soporte en el cuerpo de los vertebrados, la recuperación de la función esquelética durante la regeneración requiere tanto la restauración de las estructuras faltantes como sus propiedades mecánicas. Este protocolo describe un método para procesar muestras de extremidades de ajolote para microscopía de fuerza atómica (AFM), que es el estándar de oro para sondear las propiedades mecánicas de células y tejidos a alta resolución espacial.

Aprovechando las capacidades regenerativas del ajolote, este estudio midió la rigidez del cartílago de la extremidad durante la homeostasis y dos etapas de la regeneración de la extremidad: la histólisis tisular y la condensación del cartílago. Demostramos que la AFM es una herramienta valiosa para obtener información sobre la reestructuración dinámica de los tejidos y los cambios mecánicos que ocurren durante la regeneración.

Introducción

El esqueleto, especialmente el cartílago y los huesos, proporciona el principal soporte mecánico para los tejidos blandos del cuerpo en los vertebrados. Por lo tanto, es probable que cualquier daño en el sistema esquelético comprometa en gran medida la funcionalidad e incluso la supervivencia. En los seres humanos, las fracturas óseas son una de las lesiones traumáticas más comunes¹, la mayoría de las cuales se reparan en cuestión de semanas, pero entre el 5% y el 10% de ellas tendrán retrasos en la curación o nunca se recuperarán por completo ^2,3. Adem....

Protocolo

Los ajolotes (Ambystoma mexicanum) se cultivaron en las instalaciones de Axolotl del Centro de Terapias Regenerativas de Dresde (CRTD) de la Universidad Tecnológica de Dresde (TUD). Una descripción completa de las condiciones de cría se puede encontrar en²⁴. Brevemente, las habitaciones se mantuvieron a 20-22 °C con un ciclo día/noche de 12/12 h. Todos los procedimientos quirúrgicos y de manipulación se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del comité de ética local y fueron aprobados por la Landesdirektion Sachsen, Alemania.

Este estudio utilizó ajolotes blancos (<....

Discusión

Aquí, demostramos una técnica para la medición de la rigidez del cartílago en extremidades de ajolote con AFM. Sin embargo, este método también puede ampliarse para sondear otros tipos de tejidos. Un paso clave para el éxito de las mediciones de AFM es la preparación de la muestra, que resultó ser especialmente difícil con las muestras de ajolotes. Descubrimos que sondear la superficie del tejido que aún estaba incrustada en el bloque de agarosa era la mejor manera de preserva.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning