完整和再生蝾螈肢体软骨的原子力显微镜测量

摘要

在该协议中，我们展示了如何为原子力显微镜 （AFM） 准备蝾螈组织，并在完整和再生的肢体软骨中进行压痕测量。

摘要

机械力为发育组织中的正常细胞功能和模式形成提供了重要信号，它们在胚胎发生和发病过程中的作用已得到广泛研究。相比之下，对动物再生过程中的这些信号知之甚少。

蝾螈是研究再生的重要模式生物，因为它能够在受伤后完全恢复许多器官和组织，包括缺失的软骨和骨骼。由于其作为脊椎动物身体中主要支撑组织的关键作用，在再生过程中恢复骨骼功能需要恢复缺失的结构及其机械性能。该协议描述了一种用于原子力显微镜 （AFM） 处理蝾螈肢体样品的方法，这是在高空间分辨率下探测细胞和组织力学特性的金标准。

利用蝾螈的再生能力，本研究测量了体内平衡和肢体再生的两个阶段：组织组织溶解和软骨凝结期间肢体软骨的刚度。我们表明 AFM 是深入了解动态组织重组和再生过程中发生的机械变化的宝贵工具。

引言

骨骼，尤其是软骨和骨骼，为脊椎动物身体的软组织提供主要的机械支撑。因此，骨骼系统中的任何损伤都可能极大地损害功能甚至生存。在人类中，骨折是最常见的创伤性损伤之一¹，其中大多数会在几周内修复，但其中 5%-10% 会延迟愈合或从未完全恢复 ^2,3。此外，人类无法从广泛的骨骼或软骨流失中恢复^{过来 4,5}。然而，一些蝾螈可以再生各种身体结构，包括完整的肢体⁶ （full limbs），这使它们成为研究骨骼再生的理想模型。

蝾螈 （Ambystoma mexicanum） 是一种蝾螈，其肢体再生已被广泛研究。这个过程发生在四个主要的连续但重叠的阶段：1） 伤口愈合，2） 炎症/组织溶解，3） 胚层形成，以及 4） 胚层生长/分化（^{7,8 中已}论述）。截肢后，与损伤部位接壤的角质形成细胞迅速迁移，闭合伤口并形成伤口上皮 （WE）。在随后的炎症和组织溶解过程中，....

研究方案

蝾螈 （Ambystoma mexicanum） 是在德累斯顿理工大学 （TUD） 德累斯顿再生疗法中心 （CRTD） 的蝾螈设施中生长的。饲养条件的完整描述可以在²⁴ 中找到。简而言之，将房间保持在 20-22 °C，昼夜循环为 12/12 小时。所有处理和外科手术均按照当地伦理委员会的指导方针进行，并已获得德国萨克森州州长的批准。

这项研究在所有实验中使用白色 （d/d） 蝾螈，这是一种天然存在的突变菌株，缺乏体色素沉着（很少或没有黑素细胞和黄细胞），虹膜细胞仅在眼睛的虹膜中。本研究使用了从鼻子到尾巴（5-7 个月大）长 8-15 厘米的蝾螈，没有性别特异性偏倚。

1. 准备工作

1. 准备 10% （w/v） 苯佐卡因原液，用于蝾螈的麻醉和安乐死（见下文）。为此，将 50 g 苯佐卡因与 100% 乙醇混合在一个容量瓶中，直到达到 500 mL 的限制。
2. 制备 0.03% （w/v） 苯佐卡因储备液。
   1. 对于 1 L，将 50 mL 的 10x Tris 缓冲盐水 （TBS） 与 30 mL 的 10% （w/v） 苯佐卡因和 5 mL 的 4000% （w/v） Holtfreter ....

讨论

在这里，我们展示了一种用 AFM 测量蝾螈肢体软骨刚度的技术。然而，这种方法也可以扩展到探测其他组织类型。成功进行 AFM 测量的关键步骤是样品制备，事实证明，这对于蝾螈样品来说尤其具有挑战性。我们发现，探测仍嵌入琼脂糖块中的组织表面是保持组织完整性的最佳方法。这是因为蝾螈皮肤在表皮表面分泌高水平的粘液，从而阻止切片组织切片稳定地嵌入琼脂?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning