Mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération

Résumé

Dans ce protocole, nous montrons comment préparer le tissu axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM) et effectuer des mesures d’indentation dans le cartilage des membres intact et en régénération.

Résumé

Les forces mécaniques fournissent des signaux importants pour le fonctionnement normal des cellules et la formation de motifs dans les tissus en développement, et leur rôle a été largement étudié au cours de l’embryogenèse et de la pathogenèse. En comparaison, on sait peu de choses sur ces signaux pendant la régénération des animaux.

L’axolotl est un organisme modèle important pour l’étude de la régénération, compte tenu de sa capacité à restaurer complètement de nombreux organes et tissus après une blessure, y compris le cartilage et les os manquants. En raison de son rôle crucial en tant que principal tissu de soutien dans le corps des vertébrés, la récupération de la fonction squelettique pendant la régénération nécessite à la fois la restauration des structures manquantes ainsi que de leurs propriétés mécaniques. Ce protocole décrit une méthode de traitement des échantillons de membres d’axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM), qui est la référence pour sonder les propriétés mécaniques des cellules et des tissus à haute résolution spatiale.

Tirant parti des capacités de régénération de l’axolotl, cette étude a mesuré la rigidité du cartilage des membres pendant l’homéostasie et deux étapes de la régénération des membres : l’histolyse tissulaire et la condensation du cartilage. Nous montrons que l’AFM est un outil précieux pour mieux comprendre la restructuration dynamique des tissus et les changements mécaniques qui se produisent au cours de la régénération.

Introduction

Le squelette, en particulier le cartilage et les os, constitue le principal support mécanique des tissus mous du corps chez les vertébrés. Par conséquent, tout dommage dans le système squelettique est susceptible de compromettre considérablement la fonctionnalité et même la survie. Chez l’homme, les fractures osseuses sont l’une des blessures traumatiques les plus courantes¹, dont la plupart se réparent en quelques semaines, mais 5% à 10% d’entre elles auront des retards de guérison ou ne se rétabliront jamais complètement ^2,3. De plus, les humains ne s....

Protocole

Les axolotls (Ambystoma mexicanum) ont été cultivés dans l’installation Axolotl du Centre de thérapies régénératives de Dresde (CRTD) de l’Université de technologie de Dresde (TUD). Une description complète des conditions d’élevage se trouve dans la^{section 24}. Brièvement, les pièces ont été maintenues à 20-22 °C avec un cycle jour/nuit de 12/12 h. Toutes les manipulations et interventions chirurgicales ont été effectuées conformément aux directives du comité d’éthique local et ont été approuvées par la Landesdirektion Sachsen, en Allemagne.

Cette étude a utilisé des axolotls....

Discussion

Ici, nous démontrons une technique de mesure de la rigidité cartilagineuse dans les membres axolotls avec AFM. Cependant, cette méthode peut également être étendue pour sonder d’autres types de tissus. La préparation des échantillons, qui s’est avérée particulièrement difficile pour les échantillons d’axolotl, est une étape clé pour des mesures AFM réussies. Nous avons constaté que sonder la surface tissulaire qui était encore encastrée dans le bloc d’agarose é.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning