Misurazioni al microscopio a forza atomica della cartilagine in arti axolotl intatti e in rigenerazione

Riepilogo

In questo protocollo, mostriamo come preparare il tessuto axolotl per la microscopia a forza atomica (AFM) ed eseguire misurazioni dell'indentazione nella cartilagine degli arti intatta e in rigenerazione.

Abstract

Le forze meccaniche forniscono segnali importanti per la normale funzione cellulare e la formazione di pattern nei tessuti in via di sviluppo, e il loro ruolo è stato ampiamente studiato durante l'embriogenesi e la patogenesi. In confronto, si sa poco di questi segnali durante la rigenerazione animale.

L'axolotl è un importante organismo modello per lo studio della rigenerazione, data la sua capacità di ripristinare completamente molti organi e tessuti dopo una lesione, tra cui la cartilagine e l'osso mancanti. A causa del suo ruolo cruciale come principale tessuto di supporto nel corpo dei vertebrati, il recupero della funzione scheletrica durante la rigenerazione richiede sia il ripristino delle strutture mancanti che delle loro proprietà meccaniche. Questo protocollo descrive un metodo per l'elaborazione di campioni di arti axolotl per la microscopia a forza atomica (AFM), che è il gold standard per sondare le proprietà meccaniche di cellule e tessuti ad alta risoluzione spaziale.

Sfruttando le capacità rigenerative dell'axolotl, questo studio ha misurato la rigidità della cartilagine degli arti durante l'omeostasi e due fasi della rigenerazione degli arti: l'istolisi tissutale e la condensazione della cartilagine. Dimostriamo che l'AFM è uno strumento prezioso per ottenere informazioni sulla ristrutturazione dinamica dei tessuti e sui cambiamenti meccanici che si verificano durante la rigenerazione.

Introduzione

Lo scheletro, in particolare la cartilagine e le ossa, fornisce il principale supporto meccanico per i tessuti molli del corpo nei vertebrati. Pertanto, è probabile che qualsiasi danno al sistema scheletrico comprometta notevolmente la funzionalità e persino la sopravvivenza. Nell'uomo, le fratture ossee sono una delle lesioni traumatiche più comuni¹, la maggior parte delle quali si ripara nel giro di poche settimane, ma il 5%-10% di queste avrà ritardi nella guarigione o non si riprenderà mai completamente ^2,3. Inoltre, gli esseri umani non sono in gra....

Protocollo

Gli axolotl (Ambystoma mexicanum) sono stati coltivati nella struttura di Axolotl del Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD) della Dresden University of Technology (TUD). Una descrizione completa delle condizioni di allevamento può essere trovata in²⁴. In breve, gli ambienti sono stati mantenuti a 20-22 °C con un ciclo giorno/notte di 12/12 ore. Tutte le procedure di manipolazione e chirurgiche sono state eseguite in conformità con le linee guida del comitato etico locale e sono state approvate dalla Landesdirektion Sachsen, Germania.

Questo studio ha utilizzato ax....

Discussione

Qui, dimostriamo una tecnica per la misurazione della rigidità della cartilagine negli arti axolotl con AFM. Tuttavia, questo metodo può essere ampliato anche per sondare altri tipi di tessuto. Un passaggio chiave per il successo delle misure AFM è la preparazione del campione, che si è rivelata particolarmente impegnativa con i campioni di axolotl. Abbiamo scoperto che sondare la superficie del tessuto che era ancora incorporato nel blocco di agarosio era il modo migliore per preser.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning