Medições de Microscopia de Força Atômica de Cartilagem em Membros de Axolote Intactos e em Regeneração

Resumo

Neste protocolo, mostramos como preparar tecido de axolote para microscopia de força atômica (AFM) e realizar medições de indentação na cartilagem intacta e em regeneração.

Resumo

As forças mecânicas fornecem sinais importantes para a função celular normal e a formação de padrões nos tecidos em desenvolvimento, e seu papel tem sido amplamente estudado durante a embriogênese e patogênese. Comparativamente, pouco se sabe sobre esses sinais durante a regeneração animal.

O axolote é um importante organismo modelo para o estudo da regeneração, dada a sua capacidade de restaurar totalmente muitos órgãos e tecidos após a lesão, incluindo cartilagem e osso ausentes. Devido ao seu papel crucial como o principal tecido de suporte no corpo dos vertebrados, recuperar a função esquelética durante a regeneração requer tanto a restauração das estruturas ausentes quanto suas propriedades mecânicas. Este protocolo descreve um método para processar amostras de membros de axolotes para microscopia de força atômica (AFM), que é o padrão-ouro para sondar propriedades mecânicas de células e tecidos em alta resolução espacial.

Aproveitando as capacidades regenerativas do axolote, este estudo mediu a rigidez da cartilagem do membro durante a homeostase e dois estágios de regeneração do membro: histólise tecidual e condensação da cartilagem. Mostramos que o AFM é uma ferramenta valiosa para obter insights sobre a reestruturação dinâmica do tecido e as mudanças mecânicas que ocorrem durante a regeneração.

Introdução

O esqueleto, especialmente cartilagem e ossos, fornece o principal suporte mecânico para os tecidos moles do corpo em vertebrados. Portanto, qualquer dano no sistema esquelético provavelmente comprometerá muito a funcionalidade e até mesmo a sobrevivência. Em humanos, as fraturas ósseas são uma das lesões traumáticas mais comuns¹, a maioria das quais se repara em questão de semanas, mas 5% a 10% delas terão atrasos na cicatrização ou nunca se recuperarão totalmente ^2,3. Além disso, os seres humanos não são capazes de se recuperar de extensa perda óssea ....

Protocolo

Os axolotes (Ambystoma mexicanum) foram cultivados nas instalações de axolotes do Centro de Terapias Regenerativas de Dresden (CRTD) da Universidade de Tecnologia de Dresden (TUD). Uma descrição completa das condições de criação pode ser encontrada em²⁴. Resumidamente, os quartos foram mantidos a 20-22 °C com um ciclo dia/noite de 12/12 h. Todos os procedimentos cirúrgicos e de manipulação foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê de ética local e foram aprovados pela Landesdirektion Sachsen, Alemanha.

Este estudo usou axolotes brancos (d / d) para todo....

Discussão

Aqui, demonstramos uma técnica para a medição da rigidez da cartilagem em membros de axolotes com AFM. No entanto, esse método também pode ser expandido para sondar outros tipos de tecido. Uma etapa fundamental para medições bem-sucedidas de AFM é a preparação da amostra, que provou ser particularmente desafiadora com amostras de axolotes. Descobrimos que sondar a superfície do tecido que ainda estava embutida no bloco de agarose era a melhor maneira de preservar a integridade.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning