מיקרוסקופ כוח אטומי מדידות סחוס בגפיים אקסולוטליות שלמות ומתחדשות;

Summary

בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד להכין רקמת אקסולוטל למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ולבצע מדידות הזחה בסחוס גפיים שלם ומתחדש.

Abstract

כוחות מכניים מספקים אותות חשובים לתפקוד תקין של תאים וליצירת תבניות ברקמות מתפתחות, ותפקידם נחקר רבות במהלך אמבריוגנזה ופתוגנזה. באופן יחסי, מעט מאוד ידוע על אותות אלה במהלך התחדשות בעלי חיים.

האקסולוטל הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר התחדשות, בהתחשב ביכולתו לשחזר באופן מלא איברים ורקמות רבים לאחר פציעה, כולל סחוס ועצם חסרים. בשל תפקידה המכריע כרקמה התומכת העיקרית בגוף החולייתנים, החזרת תפקוד השלד במהלך ההתחדשות דורשת הן את שיקום המבנים החסרים והן את תכונותיהם המכניות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד דגימות גפיים אקסולוטליות עבור מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שהוא תקן הזהב לבדיקת תכונות מכניות של תאים ורקמות ברזולוציה מרחבית גבוהה.

תוך ניצול יכולות ההתחדשות של האקסולוטל, מחקר זה מדד את נוקשות סחוס הגפיים במהלך הומאוסטזיס ושני שלבים של התחדשות גפיים: היסטוליזה של רקמות ועיבוי סחוס. אנו מראים כי AFM הוא כלי רב ערך להשגת תובנות לגבי ארגון מחדש דינמי של רקמות והשינויים המכניים המתרחשים במהלך רגנרציה.

Introduction

השלד, בעיקר הסחוס והעצמות, מספק את התמיכה המכנית העיקרית לרקמות הרכות של הגוף אצל בעלי חוליות. לכן, כל נזק במערכת השלד עלול לפגוע מאוד בתפקוד ואף בהישרדות. אצל בני אדם, שברים בעצמות הם אחת הפציעות הטראומטיות הנפוצות ביותר¹, שרובן משתקמות תוך שבועות ספורים, אך 5%-10% מהן יסבלו מעיכובים בהחלמה או לעולם לא יתאוששו לחלוטין ^2,3. יתר על כן, בני אדם אינם מסוגלים להתאושש מאובדן עצם או סחוס נרחב ^4,5. עם זאת, חלק מהסלמנדרות יכולות לחדש מגוון מבני גוף, כולל גפיים מלאות⁶, מה שהופך אותן למודל אידיאלי לחקר התחדשות השלד.

אקסולוטל (שם מדעי: Ambystoma mexicanum) הוא סוג של סלמנדרה שבה התחדשות הגפיים נחקרה בהרחבה. תהליך זה מתרחש בארבעה שלבים עיקריים עוקבים אך חופפים: 1) ריפוי פצעים, 2) דלקת/היסטוליזה, 3) היווצרות בלסטמה, ו-4) צמיחת/התמיינות בלסטמה (נסקר^ב-7,8). לאחר הקטיעה, קרטינוציטים הגובלים באתר הפציעה נודדים במהירות, סוגרים את הפצע ויוצרים את אפיתל הפצע (WE). במהלך הדלקת וההיסטוליזה שלאחר מכן, פתוגנים מסולקים, פסולת ותאים פגומים מנוקים, והמטריצה החוץ תאית (ECM) מתחת לפני השטח לקטיעה משופצת⁹. היסטוליזה של רקמות חיונית להתחדשות הגפיים כדי להתרחש¹⁰, כאשר הפרשת אנזימים מפרקי חלבון חיונית לא רק לעיצוב מחדש של ECM כולל, אלא גם לשחרור התאים היוצרים את הבלסטמה ולמולקולות ביו-אקטיביות חופשיות הכלואות ב-ECM עצמו⁸. למעשה, מחקרים בהקשרים רגנרטיביים רבים ואורגניזמים מודל הראו כי התכונות החומריות הייחודיות של ECM במהלך היסטוליזה מסוגלות לגרום לתהליכי התמיינות או לכוון את נדידת התאים לעבר אתר הפציעה (נסקר ב^-11). יתר על כן, ספיגה מחדש של רקמה מסוידת בשלבים המאוחרים של היסטוליזה הוכחה כמפתח לאינטגרציה נכונה של אלמנטים חדשים של שלד הגפיים שנוצרו¹². לאחר שלב ההיסטוליזה, הבלסטמה נוצרת מתחת לאפיתל הפצע (WE) כהצטברות של אבות לא ממוינים, מרובי שושלות כתוצאה מתאי רקמה בוגרים שאינם ממוינים או תאי גזע תושבים. תאי בלסטמה מתרבים ומתמיינים לכל סוגי התאים החסרים. לבסוף, מורפוגנזה של הגפיים מתרחשת, שבה רקמת השלד מתחדשת באמצעות עיבוי של chondroprogenitors נגזר תאים periskeletal ו fibroblasts עורי transdifferentiated 13,14,15.

למרות שרבים מהרמזים הביוכימיים המווסתים שינויים בזהות התא ובהרכב ECM זוהו 10,13,14,16,17,18, התכונות המכניות של רקמות במהלך השלבים השונים של התחדשות הגפיים, כמו גם השפעתן על התחדשות, נותרו במידה רבה בלתי נחקרות. מחקרים רבים הראו כי תאים חשים ומשלבים רמזים מכניים המווסתים את גורלם והתנהגותם במספר הקשרים (נסקרו^ב-19,20). לכן, השלמת הידע התאי והמולקולרי שלנו על התחדשות גפיים עם מדידות מכניות של רקמות תשפר מאוד את הבנתנו את התהליכים הללו.

פותחו טכניקות שונות המאפשרות אפיון מכני ומניפולציה בכוח של דגימות ביולוגיות²¹. בין טכניקות אלה, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הפך לתקן הזהב במכנוביולוגיה, שבו התכונות הוויסקו-אלסטיות של דגימות ביולוגיות נבדקות ברזולוציה מרחבית גבוהה על ידי הזחה עם חיישן כוח רגיש במיוחד, AFM cantilever²². מאז טכניקה זו דורשת מגע ישיר עם הדגימה, בדרך כלל, פרוסות רקמה נוצרים, אשר יכול להיות מאתגר במקרים מסוימים. לכן, תנאי ההכנה צריכים להיות מותאמים ומותאמים לכל דגימה מסוימת, כך שהיא יכולה להישאר קרובה ככל האפשר לתנאים פיזיולוגיים וממצאים מינימליים נוצרים²³. פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד קשיחות רקמות בגפיים אקסולוטליות באמצעות AFM, תוך התמקדות ברקמות סחוס בתנאים שלמים, בזמן שהן עוברות היסטוליזה, ובשלבי עיבוי סחוס (איור 1 ואיור 2). שיטה זו עשויה להיות מורחבת גם למדידה של סוגי רקמות אחרים.

Protocol

אקסולוטלים (Ambystoma mexicanum) גודלו במתקן אקסולוטל של המרכז לטיפולים רגנרטיביים דרזדן (CRTD) של האוניברסיטה הטכנולוגית של דרזדן (TUD). תיאור מלא של תנאי הגידול ניתן למצוא ב²⁴. בקצרה, החדרים נשמרו ב 20 - 22 ° C עם מחזור יום / לילה 12/12 שעות. כל הטיפול והניתוחים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה המקומית ואושרו על ידי Landesdirektion Sachsen, גרמניה.

מחקר זה השתמש באקסולוטלים לבנים (d/d) לכל הניסויים, זן מוטנטי טבעי חסר פיגמנטציה של הגוף (מעט מאוד מלנופורים וקסנטופורים), עם אירידופורים רק בקשתית העיניים. במחקר זה נעשה שימוש באקסולוטלים בגודל 8-15 ס"מ מהחוטם ועד הזנב (בני 5-7 חודשים) ללא הטיה ספציפית למין.

1. הכנה

1. הכינו תמיסת מלאי בנזוקאין 10% (w/v) שתשמש להרדמה והמתת חסד של האקסולוטים (ראו להלן). לשם כך, מערבבים בבקבוק נפח 50 גרם של בנזוקאין עם 100% אתנול עד לגבול 500 מ"ל הושג.
2. הכינו תמיסת מלאי בנזוקאין 0.03% (w/v).
   1. עבור 1 ליטר, יש לערבב 50 מ"ל של 10x Tris-buffered salt (TBS) עם 30 מ"ל של 10% (w/v) בנזוקאין ו-5 מ"ל של 4000% (w/v) התמיסות של Holtfreter עם 915 מ"ל מים מזוקקים ולערבב במשך הלילה עם מוט ערבוב מגנטי.
   2. לקבלת ליטר אחד של תמיסת 10x TBS, ערבבו 24.2 גרם בסיס Trizma ו-90 גרם NaCl עם 990 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. מערבבים היטב עם מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, הוסף כ -10 מ"ל של HCl מרוכז (12 M או 37%) והתאם עבור pH 8.
   3. עבור 1 ליטר של 4000% (w/v) הפתרון של Holtfreter, לערבב 158.4 גרם של NaCl, 11.13 גרם של MgSO₄·7H₂O, 5.36 גרם של CaCl₂·2H₂O ו 2.88 גרם של KCl עם מים deionized עד 1 L.
3. הכינו דילול בנזוקאין עובד של 0.01% (w/v) בהחזקת מי מיכל להרדמה על ידי דילול תמיסת המלאי 1:3 של 0.03% (w/v).
   1. עבור 1 ליטר של תמיסה, השתמש 333 מ"ל של תמיסת מלאי בנזוקאין בתוספת 666 מ"ל של מי מיכל החזקה.
4. הכן 5 מ"ג / מ"ל butorphanol טרטרט פתרון מלאי עבור שיכוך כאבים. לשם כך, מערבבים 100 מ"ג של מלח butorphanol (+)-טרטרט עם 20 מ"ל של מים טהורים במיוחד. יש לאחסן aliquots ב 4 °C.
5. ביום הקטיעות, להכין טרי 0.5 מ"ג / ליטר butorphanol טרטרט פתרון עבודה כדי להפחית את כאבי בעלי חיים לאחר הליכים כירורגיים על ידי דילול תמיסת מלאי 1:10.000 במיכל החזקה.
   1. עבור בעלי חיים שאורכם קטן מ-8 ס"מ, יש לערבב 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי במיכל החזקה של 200 מ"ל.
   2. עבור בעלי חיים גדולים יותר, ערבבו 60 מיקרוליטר של תמיסת מלאי במיכל החזקה של 600 מ"ל.
6. הכינו תמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (APBS), תמיסת PBS של 80% (v/v), ושמרו אותה בטמפרטורת החדר (RT) על ידי ערבוב של 800 מ"ל של DPBS עם 200 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
7. הכינו תמיסת מלאי אינסולין 1 מ"ג/מ"ל. לשם כך, מערבבים 250 מ"ג אבקת אינסולין עם 25 מ"ל HCl 0.1 M ומתסיסים לאט עד להמסה. תוך כדי התססה, להוסיף 225 מ"ל של APBS עד הפתרון ברור. מסנן סטרילי, ולאחסן 4 מ"ל aliquots ב -20 ° C.
8. יש להכין מדיום תרבית סטרילית (כל % (v/v): 62.5% L15 בינוני, 10% FBS מומת חום, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% אינסולין, 1% L-גלוטמין) ולשמור על טמפרטורה של 4°C עד ליום השימוש. ביום הניסוי, יש לאזן ל-RT לפני השימוש.
   1. עבור 400 מ"ל של מדיום תרבית, השתמש 250 מ"ל של L15 בינוני, 40 מ"ל של FBS מומת חום, 4 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, 4 מ"ל של תמיסת אינסולין (משלב 1.7), 4 מ"ל של L-גלוטמין, ו 98 מ"ל של מים סטריליים deionized. מכינים בתנאים סטריליים ומסנן סטרילי לאחר ערבוב כל הרכיבים. הכינו 15 מ"ל aliquots.
9. הכינו נקודת התכה נמוכה (lmp) של 2.5% ו-3% (w/v) - אגרוז בתמיסת APBS וחממו בטמפרטורה של 70°C כדי להמיס את האגרוז לחלוטין. הכינו aliquots בצינורות 1.5 מ"ל ולאחסן ב 4 °C עד יום השימוש.
   1. עבור 20 מ"ל של 2.5% (w/v) lmp-agarose, לערבב 0.5 גרם של lmp-agarose עם 20 מ"ל של APBS בצינור 50 מ"ל לחמם באמבט מים ב 70 ° C עד agarose נמס לחלוטין. הפתרון צריך להיות ברור ושקוף. הכינו אליציטוטים בעודם חמים.
   2. עבור 20 מ"ל של 3% (w/v) lmp-agarose, לערבב 0.6 גרם של lmp-agarose עם 20 מ"ל של APBS ולהמשיך כאמור לעיל.
   3. (אופציונלי): עבור 20 מ"ל של 1% (w/v) lmp-agarose, לערבב 0.2 גרם של lmp-agarose עם 20 מ"ל של APBS ולהמשיך כמפורט לעיל.
      הערה: זמן ההתכה תלוי בריכוז הלמ"פ-אגרוז ועשוי לנוע בין 15-40 דקות בקירוב.
10. עבור קטיעה והרכבה של רקמות, השתמש בסטריאוסקופ brightfield.
11. הרכיבו צלחות פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ"מ, מלקחיים, אזמל ומספריים כירורגיים לקטיעה ואיסוף רקמות.
12. הכינו צלחות פטרי מפלסטיק בקוטר 35 מ"מ למדידות הזחה.
13. הכינו צילינדרים באורך ~1 ס"מ בקוטר ~1 ס"מ. לשם כך, מחממים חותך קרטון תחת להבת מבער Bunsen וחותכים צינור 15 מ"ל עם הלהב המחומם.
14. חותכים קטן 1 ס"מ² ריבועים של parafilm וחנות.
15. הכינו גוש מתכתי או קר בטמפרטורה של -20°C על ידי השארתו במקפיא למשך שעה אחת לפחות.
16. מכינים פיפטות פסטר מפלסטיק.
17. (אופציונלי): הכינו תמיסת MEMFa מקובעת (3-(N-מורפולינו)חומצה פרופאנסולפונית [MOPS] 0.1 M pH 7.4, אתילן גליקול-ביס (2-אמינואתילתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית [EGTA] 2 mM, MgSO₄·7H₂O 1 mM, 3.7% פורמלדהיד). לשם כך, להוסיף 10.465 גרם של MOPS, 0.123 גרם של MgSO₄·7H₂O, 2 מ"ל של 0.5 M EDTA pH 8.0, ולהוסיף מים עד 45 מ"ל. הוסף 5 מ"ל פורמלדהיד 37% (w/v) לנפח כולל של 50 מ"ל.

2. ריאגנטים

1. עיין בטבלת החומרים עבור הריאגנטים המשמשים לעבודה זו, אך ניתן להשתמש גם בספקים מסחריים אחרים.

3. קטיעת אקסולוטל והתחדשות גפיים

1. לפני כל הליכי הניסוי, יש להרדים את בעל החיים ב-0.01% (w/v) בנזוקאין מדולל במי מיכל החזקה (שלב 1.3) למשך 20 דקות, ולוודא שבעלי החיים מורדמים עמוקות ואינם מגיבים לגירויי מישוש.
2. הוציאו את האקסולוטל מההרדמה והניחו אותו על גבי צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה טישו מנייר טבול במים המכילים הרדמה. כיוון את האיבר בניצב לציר הגוף ומקם את הצלחת מתחת לסטריאוסקופ להדמיה טובה יותר.
   הערה: סטריאוסקופ עם מנורת צוואר אווז קומפקטית שימש כאן.
3. כרתו את הגפה בעזרת אזמל סטרילי חד שמיד דיסטלי לאזור המסויד של אזור הזאוגופודיאלי (רדיוס/אולנה) (איור 1A).
   הערה: בהתאם לעקרון רווחת בעלי החיים 3R, מומלץ להשתמש בגפיים שהוסרו בתחילה על ידי הקטיעה כבקרות שלמות.
4. השאירו את בעל החיים על הצלחת וכסו אותו בנייר טישו לח ספוג במים המכילים בנזוקאין למשך 15 דקות כדי לאפשר קרישת דם וסגירת פצעים להתרחש.
5. יש להחזיר בעלי חיים למיכל המכיל מים מתוקים עם משככי כאבים (טרטרט בוטורפנול, 0.5 מ"ג/ליטר, משלב 1.5).
6. העבירו את בעלי החיים למיכל המקורי שלהם המכיל מים טריים 24 שעות לאחר טיפול משככי כאבים לאחר הניתוח.
7. אפשרו לבעלי חיים להתחדש עד לשלב העניין הרצוי.
   הערה: הגפיים שנותחו נאספו ביום הקטיעה לשלב השלם ו-5 ימים לאחר הקטיעה (dpa) לשלב ההיסטוליזה בבעלי חיים בני 5 חודשים. שלב עיבוי הסחוס נמדד ב 21 dpa בבעלי חיים בני 7 חודשים.

4. הרכבה ועיבוד רקמות למדידות

1. חממו את צינורות ה-1.5 מ"ל המכילים 2.5% או 3% (w/v) lmp-agarose (משלב 1.9) על תרמובלוק בטמפרטורה של 70°C עד שהאגרוז נמס במלואו. החליפו את הצינורות לתרמובלוק אחר ב-37°C ואפשרו לטמפרטורה להתאזן לפני השימוש.
   הערה: כאן, 2.5% lmp-agarose שימש למדידת רקמות התחדשות ו -3% עבור רקמות שלמות.
2. כסו צד אחד של הגלילים באורך 1 ס"מ (משלב 1.13) באחד מחלקי הפרפילם (שלב 1.14) כך שיהיו אטומים לחלוטין בתחתיתם.
3. שיווי משקל של 15 מ"ל aliquots של מדיום תרבות ל- RT (משלב 1.8)
4. הרדימו את בעלי החיים על ידי טבילתם במים המכילים הרדמה (0.01% (w/v) בנזוקאין מדולל במי מיכל החזקה) למשך 20 דקות לפחות.
5. דמיינו את הגפיים תחת סטריאוסקופ עם תוכנה המאפשרת מדידות כמותיות. למדוד את אורך מבנה הריבית ולחשב כמה רקמה צריך להסיר מהקצה הדיסטלי של האיבר עד שמגיעים לחלק הריבית.
6. לחידוש הגפיים, אספו אותם על ידי חיתוך עם אזמל ו / או מספריים כירורגיים בגובה המרפק וניתוח רקמה עודפת מתוך הגפה. השאר את הרקמה בתמיסת APBS בעת הכנת השלב הבא. ודא שהחיתוך רוחבי (90°) לציר הזרוע התחתון כדי ליצור משטח אחיד. עבור הגפיים השלמות, להסיר את היד על ידי חיתוך דרך האזור הקרפלי.
7. הרדימו את בעלי החיים על ידי חשיפתם למנה קטלנית של הרדמה (0.1% בנזוקאין) למשך 20 דקות לפחות. לשם כך, הוסף את הנפח הנדרש של תמיסת בנזוקאין 10% (w/v) כדי להגיע לריכוז של 0.1% (w/v).
   1. אם בעלי חיים הורדמו ב-100 מ"ל של 0.01% (w/v) תמיסת בנזוקאין, יש להוסיף 900 μL של תמיסת הבנזוקאין 10% (w/v).
8. יש לשטוף גפיים על ידי טבילתן בתמיסת APBS.
9. ודא כי פיפטות פסטר ואת thermoblock (מיוצב ב 37 ° C עם aliquots agarose) קרובים לתחנת העבודה. הוציאו את הבלוק הקר מהמקפיא בטמפרטורה של -20°C והניחו עליו את הגליל כשהקצה מכוסה הפרפילם פונה כלפי מטה.
10. תפוס את האיבר המנותח והסר בעדינות את עודפי הנוזל עם נייר טישו. הניחו את האיבר על צלחת נקייה, הוסיפו את האגרוז המומס מלמעלה, והזיזו לזמן קצר את האיבר באגרוז כדי לעקור את כל הנגמ"שים שנותרו מפני העור.
11. עבודה מהירה, הניחו את האיבר בתוך הצילינדר, וודאו שהוא מכוון אנכית, כאשר אזור העניין פונה כלפי מעלה.
12. תוך כדי אחיזה עדינה של האיבר במלקחיים, מוסיפים למפג-אגרוז בתוך הגליל עד שהרקמה מכוסה במלואה. מסירים בעדינות את המלקחיים לפני שהאגרוז מתמצק.
13. מוציאים את הצילינדר מהבלוק הקר ונותנים לאגרוז להתמצק לחלוטין ב-RT למשך כ-30 שניות.
14. קח את בלוק האגרוז המכיל רקמות מיד לחדר הוויברטום, יחד עם אליציטוטים בינוניים של תרבית סטרילית ו- APBS, ב- RT.
15. מוציאים את הפרפילם מתחתית הגליל ומחברים את האגרוז המכיל את הרקמה לשלב הוויברטומה בעזרת דבק ציאנואקרילט. ודא כי הן agarose ומדגם מודבקים על הבמה.
16. השקיעו את הבמה ב-APBS לצורך חלוקת חלקים.
    הערה: רקמות שלמות כוללות את העצם/סחוס הנוקשים יותר, בעוד שרקמות מתחדשות רכות יותר. לכן, יש להתאים את פרמטרי הוויברטומה בהתאם. מחקר זה השתמש בפרמטרים הבאים: רקמות שלמות (משרעת 1.2 מ"מ ומהירות 0.1 מ"מ לשנייה) ורקמות מתחדשות (משרעת 0.9 מ"מ ומהירות 0.4 מ"מ לשנייה).
17. התחילו לחתוך את האגרוז בצעדים קצרים (למשל, בצעדים של 100 מיקרומטר) עד שמגיעים לקצה הרקמה. לאחר מכן, חתך את בלוק הרקמה עד להסרת החלק הדיסטלי של הרקמה (המחושב בשלב 4.5). בדרך זו, חתך רוחבי של תחום העניין יהיה נגיש.
    הערה: מקטע הרקמה שהוסר יכיל את המשטח הסמוך לזה שנבדק עם AFM ויכול לשמש כנקודת התייחסות למבנה הרקמה. לכן, הוא יכול לשמש לניתוח משלים ישיר או קבוע עבור צביעה לאחר מכן (ראה סעיף 6).
18. בזהירות להסיר את הבלוק המכיל רקמות משלב vibratome עם סכין גילוח ולהסיר את כל עקבות הדבק. הדביקו מיד את הבלוק על צלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ עם דבק דבק רקמות כירורגי והוסיפו כ -2 מ"ל של מדיום תרבית ב- RT כדי להבטיח שהרקמה מכוסה במלואה.
    הערה: משטח הרקמה החשוף בגוש האגרוז הוא המשטח שיש לחקור.

5. מדידות עם AFM

1. לפחות יום אחד לפני המדידות, הכינו את המזנון למדידות.
   הערה: עבור עבודה זו, מיכלי סיליקון ללא קצה היו פונקציונליים עם חרוזי פוליסטירן (קוטר 20 מיקרומטר), ואת הקשר חרוז חרוז נשאר לחזק לפחות 1 יום לפני ששימש למדידות הזחה.
   1. מצמידים חרוזים למכלים באמצעות דבק אפוקסי עם זמן עיבוד של 5 דקות.
   2. הורידו במהירות את המזנון במגע מינימלי על מגלשת זכוכית מצופה דבק כך שתיווצר טיפת דבק קטנה בקצהו, והביאו אותו מיד לאחר מכן למגע עם חרוז מתאים.
   3. החזיקו את מגע החרוז במשך ~10 דקות לפני שאתם מרימים את הקנטיליבר עם חרוז קשור מעל פני השטח.
2. כייל את המזנון לפני המדידות.
   הערה: המזנון שהשתנה כויל לפני כל סדרת ניסויים בשיטת הרעש התרמי תוך שימוש בפרוצדורות מובנות של תוכנת AFM.
3. הכניסו את צלחת הפטרי עם בלוק הרקמה (משלב 4.18) ומדיום התרבית למחזיק צלחת הפטרי של AFM וקבלו תמונת סקירה במיקרוסקופ שדה בהיר (איור 1B).
   הערה: לבדיקות הזחה, נעשה שימוש במערך המצויד בבמת מנוע על גבי מיקרוסקופ אור זקוף. הרכיבו את ראש ה-AFM ומקמו את הקנטיליבר מעל הרקמה והביאו את הקנטיליבר קרוב לפני השטח.
4. בחרו את אזור העניין הספציפי ותיעדו מערך של עקומות מרחק כוח (איור 2A).
   הערה: נקודות כוח יחסיות של 2-25 nN שימשו כדי להגיע לעומקי כניסה דומים של ~1-4 מיקרומטר עבור רקמות בעלות קשיחות שונה, עם מהירות גישה ונסיגה של 7.5 מיקרומטר לשנייה, אורך z של 50 מיקרומטר, גודל רשת 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר עם 3 x 3 נקודות.
5. עבור כל אזור שנבדק, רכשו תמונה במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לשייך את הערכים המתקבלים לכל אזור מסוים באזור הגפיים.
6. עבור כל הדגימות, בדוק לפחות 3 אזורים שונים לכל סוג רקמה.
   הערה: בכל המקרים, מחקר זה מדד 4 אזורים במרכז הסחוס ו -3 אזורים בשולי אזור הסחוס ושמר את הרקמה מתחת למיקרוסקופ למשך שעה לכל היותר.
7. לאחר סיום מדידות ההזחה, השליכו או תקנו את הרקמה לניתוח נוסף.
   הערה: הדגימות תוקנו לאחר סיום המדידות על ידי הצבתן בצינורות 2 מ"ל המכילים תמיסת MEMFa ותוקנו במשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. נעשה שימוש ב- MEMFa (שלב 1.17), אך ניתן להשתמש גם בתמיסת פורמלדהיד 4% (w/v) ב- PBS.

6. עיבוד (אופציונלי) של מקטעי רקמות סמוכים

1. אם חלקי הרקמה הסמוכים משמשים לצביעה הבאה, הניחו אותם מיד לאחר החתך בצינור קטן של 2 מ"ל המכיל קיבוע וקבעו לילה ב -4 מעלות צלזיוס.
   1. כדי לחשוף את ארכיטקטורת הרקמה באמצעות תיוג של אקטין ציטו-שלד וגרעינים, שטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת כדי להסיר את הקיבוע והכתם בתמיסה המכילה פלואידין מצומד Alexa Fluor 488 (1:250) ו-Hoechst 33258 (1:10000) ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT על משטח נדנדה.
   2. לאחר מכן, יש לשתק את הדגימות המוכתמות על גבי כלים בעלי תחתית זכוכית באמצעות 1% (w/v) lmp-agarose ב-APBS המיוצב ב-37°C (משלב 1.9). ודא כי פני השטח של עניין פונה אל הזכוכית. לאחר שהאגרוז מתמצק, כסו את הדגימות ב-PBS כדי למנוע התייבשות.
      הערה: הדגימות השלמות וההיסטוליזה מצולמות במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (הגדלה של פי 10 וחתכים אופטיים של 8 מיקרומטר). תמונות באיור 1C הן הקרנות מקסימליות של 8 מקטעים אופטיים.
2. אם מקטע הרקמה הסמוך משמש לניתוח מיידי במורד הזרם הדורש רקמה טרייה (כמו מיצוי RNA, דגירה עם צבעים חיים וכו '), הקפד לעבוד במהירות ולהשתמש בתווך תרבית תאים (משלב 1.8) כדי להבטיח את שלמות הרקמה הגבוהה ביותר האפשרית.

7. ניתוח והצגת נתונים

1. כדי לחשב את המודולוס של יאנג לכאורה, נתח את עקומות מרחק הכוח באמצעות מודל הרץ/סנדון (Eq.1) עבור אינדנטר כדורי באמצעות תוכנת עיבוד הנתונים JPK/Bruker, בהנחה שיחס פואסון הוא 0.5.
   (Eq.1)
   כאשר R: רדיוס indenter, E: מודולוס אלסטי, ν: יחס פואסון, a: רדיוס אזור המגע המעגלי בין הנכנס לדגימה, δ: עומק הזחה.
2. לניתוח ויסקו-אלסטי, נתח את חלקי הגישה של עקומות כניסת הכוח ב- PyJibe 0.15.0 עם הסיומת "מודל הרץ מתוקן עבור צמיגות באמצעות Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)" (נכתב על ידי פול מולר, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe)²⁵. פונקציית ההתאמה מבוססת על מודל שתואר על ידי Abuhattum et ^al.26, המשלב אלמנטים של מודל Kelvin-Voigt-Maxwell.
   1. עבד מראש את עקומות כניסת הכוח כדי להעריך את נקודת המגע באמצעות התאמה חתיכתית עם קו (קו בסיס) ופונקציית התאמה פולינומית עבור חלק הגישה.
   2. התאימו את עקומות כניסת הכוח ל"מודל הרץ מתוקן לצמיגות באמצעות מודל Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)". מההתאמה, השיגו את המודולוס של יאנג הלא רגוע, את המודולוס של יאנג לכאורה ואת הצמיגות הנראית לעין. המודל גם נותן למקסוול זמני הרפיה והזחה.
      הערה: במספר עקומות הזחת כוח שנותחו (במיוחד הרקמה השלמה), זמני ההרפיה של מקסוול היו גדולים או קטנים משמעותית מזמן ההזחה, מה שמצביע על התנהגות אלסטית למדי או התנהגות מכנית קלווין-ווייט, בהתאמה.
3. יצא את כל המדידות לגיליון אלקטרוני וחשב את המודולים החציוניים הנראים של יאנג לכל סוג רקמה ודגימה.
4. התווה ונתח סטטיסטית את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
   הערה: מנסרת GraphPad משמשת כאן, וכאשר מתארים את התוצאות, המחקר מתייחס לממוצע ± SD של המודולים החציוניים הנראים של יאנג לכל מדגם (מוצג באיור 2D-F).
5. הצג פרוסות אופטיות מתמונות קונפוקליות על-ידי הקרנתן עם פונקציית ההקרנה המרבית של פיג'י. התאם את הבהירות והניגודיות של כל ערוץ בנפרד להדמיה מיטבית של כתמים פלואורסצנטיים.
6. צור לוח איור עם התוכנה המתאימה.
   הערה: Affinity Designer משמש ליצירת החלוניות, והמודל באיור 1A משורטט באמצעות Affinity Designer.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, מדדנו את המודולוס לכאורה של יאנג של רקמות גפיים אקסולוטליות סחוניות בתנאים הומיאוסטטיים ("שלמים"), במהלך היסטוליזה מוקדמת של הסחוס, ובשלבי עיבוי סחוס מאוחרים יותר (איור 1A). חקרנו גם את התכונות המכניות של רכיבי השלד באזורים שו?...

Discussion

כאן, אנו מדגימים טכניקה למדידת קשיחות סחוס בגפיים אקסולוטליות עם AFM. עם זאת, שיטה זו עשויה להיות מורחבת עבור חיטוט סוגי רקמות אחרים גם כן. שלב מפתח למדידות AFM מוצלחות הוא הכנת דגימות, שהתגלתה כמאתגרת במיוחד עם דגימות אקסולוטל. מצאנו כי חיטוט פני הרקמה שעדיין היו מוטמעים בג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning