Atomic Force Microscopy: Intact and Regenerating Axolotl Limbs의 연골 측정

요약

이 프로토콜에서는 원자력 현미경(AFM)을 위해 아홀로틀 조직을 준비하고 온전하고 재생되는 사지 연골에서 압흔 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다.

초록

기계적 힘은 발달 중인 조직에서 정상적인 세포 기능과 패턴 형성에 중요한 신호를 제공하며, 그 역할은 배발생 및 발병 과정에서 널리 연구되었습니다. 이에 비해, 동물의 재생 과정에서 이러한 신호에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

아홀로틀은 부상 후 손실된 연골과 뼈를 포함하여 많은 장기와 조직을 완전히 복원할 수 있는 능력을 감안할 때 재생 연구를 위한 중요한 모델 유기체입니다. 척추동물의 신체에서 주요 지지 조직으로서의 중요한 역할로 인해 재생 중 골격 기능을 회복하려면 누락된 구조의 복원과 기계적 특성이 모두 필요합니다. 이 프로토콜은 높은 공간 분해능에서 세포 및 조직의 기계적 특성을 조사하기 위한 황금 표준인 원자력 현미경(AFM)을 위해 아홀로틀 사지 샘플을 처리하는 방법을 설명합니다.

이 연구는 아홀로틀의 재생 능력을 활용하여 항상성과 사지 재생의 두 단계인 조직 조직 분해 및 연골 응축 중 사지 연골의 강성을 측정했습니다. 우리는 AFM이 동적 조직 재구성 및 재생 중에 발생하는 기계적 변화에 대한 통찰력을 얻는 데 유용한 도구임을 보여줍니다.

서문

골격, 특히 연골과 뼈는 척추 동물에서 신체의 연조직에 대한 주요 기계적 지지를 제공합니다. 따라서 골격계의 손상은 기능과 생존에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 인간에서 골절은 가장 흔한 외상성 부상^중 하나이며1, 대부분은 몇 주 안에 회복되지만, 이 중 5%-10%는 치유가 지연되거나 완전히 회복되지 않습니다 ^2,3. 더욱이, 인간은 광범위한 뼈나 연골 손실로부터 회복할 수 없다 ^4,5. 그러나 일부 도롱뇽은 전체 팔다리⁶를 포함한 다양한 신체 구조를 재생할 수 있어 골격 재생 연구에 이상적인 모델이다.

아홀로틀(Ambystoma mexicanum)은 사지 재생이 광범위하게 연구된 도롱뇽의 일종입니다. 이 과정은 1) 상처 치유, 2) 염증/조직 용해, 3) 모세포종 형성, 4) 배반종 증식/분화의 네 가지 주요 순차적이지만 중복되는 단계로 발생합니다(

프로토콜

아홀로틀(Ambystoma mexicanum)은 드레스덴 공과대학(TUD)의 드레스덴 재생 치료 센터(CRTD)의 아홀로틀 시설에서 재배되었습니다. 사육 조건에 대한 자세한 설명은²⁴에서 찾을 수 있습니다. 간단히 말해서, 객실은 20-22 ° C로 12/12 시간 낮 / 밤주기로 유지되었습니다. 모든 취급 및 수술 절차는 현지 윤리 위원회 지침에 따라 수행되었으며 독일 Landesdirektion Sachsen의 승인을 받았습니다.

이 연구는 모든 실험에 백색(d/d) 아홀로틀을 사용했으며, 이는 신체 색소 침착이 결핍된(멜라노포어 및 크산토포어가 거의 없거나 전혀 없는) 자연적으로 발생하는 돌연변이 균주로, 눈의 홍채에만 홍채에만 홍채가 있습니다. 이 연구는 성별에 따른 편견 없이 주둥이에서 꼬리(생후 5-7개월)까지 8-15cm 크기의 아홀로틀을 사용했습니다.

1. 준비

1. axolotls의 마취 및 안락사에 사용할 10%(w/v) 벤조카인 원액을 준비합니다(아래 참조). 이를 위해 50mL 한계에 도달 할 때....

토론

여기에서는 AFM을 사용하여 아홀로틀 사지의 연골 강성을 측정하는 기술을 보여줍니다. 그러나 이 방법은 다른 조직 유형도 조사하기 위해 확장될 수 있습니다. 성공적인 AFM 측정을 위한 핵심 단계는 시료 전처리이며, 이는 아홀로틀 시료에서 특히 어려운 것으로 입증되었습니다. 우리는 아가로스 블록에 여전히 박혀 있는 조직 표면을 조사하는 것이 조직 무결성을 보존?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning