Rasterkraftmikroskopische Messungen von Knorpel in intakten und regenerierenden Axolotl-Gliedmaßen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Axolotl-Gewebe für die Rasterkraftmikroskopie (AFM) vorbereitet und Indentationsmessungen in intaktem und regenerierendem Gliedmaßenknorpel durchgeführt werden können.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte liefern wichtige Signale für die normale Zellfunktion und Musterbildung in sich entwickelnden Geweben, und ihre Rolle wurde während der Embryogenese und Pathogenese umfassend untersucht. Vergleichsweise wenig ist über diese Signale während der Regeneration von Tieren bekannt.

Der Axolotl ist ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Regeneration, da er in der Lage ist, viele Organe und Gewebe nach Verletzungen, einschließlich fehlendem Knorpel und Knochen, vollständig wiederherzustellen. Aufgrund seiner entscheidenden Rolle als wichtigstes Stützgewebe im Wirbeltierkörper erfordert die Wiedererlangung der Skelettfunktion während der Regeneration sowohl die Wiederherstellung der fehlenden Strukturen als auch deren mechanische Eigenschaften. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Aufbereitung von Axolotl-Gliedmaßenproben für die Rasterkraftmikroskopie (Rasterkraftmikroskopie), die den Goldstandard für die Untersuchung mechanischer Eigenschaften von Zellen und Geweben mit hoher räumlicher Auflösung darstellt.

Unter Ausnutzung der regenerativen Fähigkeiten des Axolotls wurde in dieser Studie die Steifigkeit des Gliedmaßenknorpels während der Homöostase und in zwei Stadien der Gliedmaßenregeneration gemessen: der Gewebehistolyse und der Knorpelkondensation. Wir zeigen, dass AFM ein wertvolles Werkzeug ist, um Einblicke in die dynamische Gewebeumstrukturierung und die mechanischen Veränderungen, die während der Regeneration auftreten, zu gewinnen.

Einleitung

Das Skelett, insbesondere Knorpel und Knochen, stellt bei Wirbeltieren die wichtigste mechanische Unterstützung für die Weichteile des Körpers dar. Daher ist es wahrscheinlich, dass jede Beschädigung des Skelettsystems die Funktionalität und sogar das Überleben stark beeinträchtigt. Beim Menschen sind Knochenbrüche eine der häufigsten traumatischen Verletzungen¹, von denen die meisten innerhalb weniger Wochen heilen, aber 5 % bis 10 % von ihnen verzögern die Heilung oder erholen sich nie vollständig ^2,3. Darüber hinaus ist der Mensch nicht in der Lage, ....

Protokoll

Axolotl (Ambystoma mexicanum) wurden in der Axolotl-Anlage des Zentrums für Regenerative Therapien Dresden (CRTD) der Technischen Universität Dresden (TUD) gezüchtet. Eine vollständige Beschreibung der Haltungsbedingungen finden Sie unter²⁴. Kurz gesagt, die Zimmer wurden bei 20-22 °C mit einem 12/12 h Tag-Nacht-Zyklus gehalten. Alle Handhabungen und chirurgischen Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der lokalen Ethikkommission durchgeführt und von der Landesdirektion Sachsen, Deutschland, genehmigt.

In dieser Studie wurden für alle Experimente weiße (....

Diskussion

Hier demonstrieren wir eine Technik zur Messung der Knorpelsteifigkeit bei Axolotl-Gliedmaßen mit AFM. Diese Methode kann jedoch auch für die Untersuchung anderer Gewebetypen erweitert werden. Ein wichtiger Schritt für erfolgreiche AFM-Messungen ist die Probenvorbereitung, die sich bei Axolotl-Proben als besonders schwierig erwies. Wir fanden heraus, dass die Sondierung der Gewebeoberfläche, die noch in den Agaroseblock eingebettet war, der beste Weg war, um die Gewebeintegrität zu .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Designer	Affinity	version 1.10.4	For figure assembling
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	For sample preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	To stain tissue
Axiozoom	Zeiss		To image samplea under the AFM
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	To anesthetize the animals
Butorphanol (+)-tartrate salt	Sigma-Aldrich	B9156	As analgesic
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	For AFM indentation measurements
Cellhesion 200 setup equipped with a motorstage	JPK/Bruker		For AFM indentation measurements
CellSense Entry			For imaging in Stereoscope Olympus UC90
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	To clean samples and section under vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	For image processing
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	To graph and statistically analyze the data
Heat-inactivated FBS	Gibco	10270-106	For cell culture medium
Histoacryl glue (2-Butyl-Cyanoacrylate)	Braun		To glue sample to petri dishes
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	To stain tissue
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500	For cell culture medium
Inverted confocal microscope	Zeiss	780 LSM	To image tissue sections
Inverted confocal microscope	Zeiss	980 LSM	To image tissue sections
JPK/Bruker data processing software	JPK/Bruker	SPM 6.4	To analyze force-distance curves
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	For cell culture medium
L-Glutamine	Gibco	25030-024	For cell culture medium
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture medium
polystyrene beads ( 20 µm diameter); )	microParticles		For AFM indentation measurements
Pyjibe	written by Paul Müller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	For viscoelastic analysis
Stereoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	For limb amputations and tissue mounting
Stereoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	For imaging
Vibratome Leica	Leica	VT 1200S	For tissue sectioning