منهجية دراسة تفاعلات مستقبلات غشاء فيتامين أ وبروتين أوبسين مع روابطها في توليد بروتين الريتينيليدين

Summary

هنا ، نصف طريقتين كميتين لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء opsin مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها.

Abstract

يعد توزيع فيتامين أ / الريتينول المتحول بالكامل (ROL) في جميع أنحاء الجسم أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على وظيفة الريتينويد في الأنسجة المحيطية وتوليد بروتين الريتينيلدين للوظيفة البصرية. RBP4-ROL هو مركب ROL مع البروتين المرتبط بالريتينول 4 (RBP4) ، الموجود في الدم. مستقبلان غشاءيان ، مستقبلات ربط الريتينول 4 مستقبلات 2 (RBPR2) في الكبد ويتم تثبيتها بواسطة حمض الريتينويك 6 الريتينول (STRA6) في العين ، يربطان RBP4 الدورة الدموية وهذه الآلية ضرورية لاستيعاب ROL في الخلايا. يعد إنشاء طرق للتحقيق في حركية المستقبلات والترابط أمرا ضروريا لفهم الوظيفة الفسيولوجية لمستقبلات فيتامين أ لتوازن الريتينويد. باستخدام فحوصات رنين البلازمون السطحي (SPR) ، يمكننا تحليل صلات الارتباط والمعلمات الحركية لمستقبلات غشاء فيتامين أ باستخدام الترابط الفسيولوجي RBP4.

يمكن أن تكشف هذه المنهجيات عن معلومات هيكلية وكيميائية حيوية جديدة عن الزخارف المرتبطة ب RBP4 في RBPR2 و STRA6 ، والتي تعتبر ضرورية لفهم الحالات المرضية لنقص فيتامين A. في العين ، يتم استقلاب ROL الداخلي إلى شبكية العين 11-cis ، وهو الصبغي البصري الذي يرتبط ب opsin في المستقبلات الضوئية لتشكيل بروتين الريتينيليدين ، رودوبسين. يتسبب امتصاص الضوء في تزومرة رابطة الدول المستقلة إلى العابرة لشبكية العين 11-cis ، مما يؤدي إلى تغييرات توافقية في رودوبسين والتنشيط اللاحق لسلسلة النقل الضوئي. يمكن أن يؤثر انخفاض تركيزات المصل و ROL العيني على تكوين بروتين الريتينيليدين ، والذي بدوره يمكن أن يتسبب في سوء تحديد موقع الرودوبسين ، وتراكم أوبسين ، والعمى الليلي ، وتنكس الجزء الخارجي لمستقبلات الضوء ، مما يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي أو داء ليبر الخلقي.

لذلك ، فإن منهجيات القياس الطيفي لتحديد كمية مركب الشبكية opsin-11-cis المقترن ببروتين G في شبكية العين أمر بالغ الأهمية لفهم آليات تنكس خلايا الشبكية في الحالات المرضية المذكورة أعلاه. باستخدام هذه المنهجيات الشاملة ، سيتمكن الباحثون من تقييم إمدادات فيتامين أ الغذائية بشكل أفضل في الحفاظ على توازن الريتينويد الجهازي والعيني ، وهو أمر بالغ الأهمية لتوليد تركيزات بروتين الريتينيلدين والحفاظ عليها في المستقبلات الضوئية ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوظيفة البصرية لدى البشر.

Introduction

يعد فيتامين أ / الريتينول / ROL الذي تم الحصول عليه في النظام الغذائي مكونا مهما يلعب دورا في الوظيفة البصرية^1،2. يرتبط شبكية الشبكية chromophore 11-cis ، وهو مستقلب لفيتامين A الغذائي ، بمستقبلات G المقترنة بالبروتين G (GPCR) opsin لتوليد بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في المستقبلات الضوئية. عندما يسقط الضوء على العين ، يخضع تكوين رودوبسين لتغيير جوهري من خلال تحويل مكون شبكية العين 11 رابطة الدول المستقلة إلى الشبكية العابرة بالكامل. يؤدي هذا التغيير في التكوين إلى سلسلة من التنبيغ الضوئي داخل المستقبلات الضوئية للقضيب ، مما يحول الضوء إ....

Protocol

1. منهجية رنين البلازمون السطحي (SPR)

1. تحضير وتنقية بروتين RBP4 للفأر
   1. صمم بادئات لإنشاء ماوس كامل الطول RBP4 (msRBP4) (التسلسل المرجعي NCBI: NM_001159487.1). استنساخ msRBP4 cDNA في ناقل تعبير مقاوم للكاناميسين pET28a والتعبير عنه في خلايا BL-21 DE3 (جدول المواد).
   2. قم بتحويل الخلايا المختصة BL-21 DE3 (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) باستخدام ناقل MSRBP4-pET28a ثم اللوحة على ألواح مرق Luria-Bertani (LB) Agar التي تحتوي على Kanamycin 50 ميكروغرام / مل^30،37. احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة ....

النتائج

يتم وصف الطرق الكمية لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها. يجب التعبير عن الفأر المؤتلف RBP4 في الإشريكية القولونية والبروتين المنقى المستخدم كرابط مترافق على شريحة SPR. يتم استخدام RBPR2 و STRA6 والم?.......

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
منهجية SPR
في تحليل النمذجة والالتحام السيليكو: يجب استخدام الهيكل المتوقع ل RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) و STRA6 ، والهيكل المعروف لقاعدة بيانات msRBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa) ، لدراسة الإرساء^29،31

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms