Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف طريقتين كميتين لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء opsin مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها.

Abstract

يعد توزيع فيتامين أ / الريتينول المتحول بالكامل (ROL) في جميع أنحاء الجسم أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على وظيفة الريتينويد في الأنسجة المحيطية وتوليد بروتين الريتينيلدين للوظيفة البصرية. RBP4-ROL هو مركب ROL مع البروتين المرتبط بالريتينول 4 (RBP4) ، الموجود في الدم. مستقبلان غشاءيان ، مستقبلات ربط الريتينول 4 مستقبلات 2 (RBPR2) في الكبد ويتم تثبيتها بواسطة حمض الريتينويك 6 الريتينول (STRA6) في العين ، يربطان RBP4 الدورة الدموية وهذه الآلية ضرورية لاستيعاب ROL في الخلايا. يعد إنشاء طرق للتحقيق في حركية المستقبلات والترابط أمرا ضروريا لفهم الوظيفة الفسيولوجية لمستقبلات فيتامين أ لتوازن الريتينويد. باستخدام فحوصات رنين البلازمون السطحي (SPR) ، يمكننا تحليل صلات الارتباط والمعلمات الحركية لمستقبلات غشاء فيتامين أ باستخدام الترابط الفسيولوجي RBP4.

يمكن أن تكشف هذه المنهجيات عن معلومات هيكلية وكيميائية حيوية جديدة عن الزخارف المرتبطة ب RBP4 في RBPR2 و STRA6 ، والتي تعتبر ضرورية لفهم الحالات المرضية لنقص فيتامين A. في العين ، يتم استقلاب ROL الداخلي إلى شبكية العين 11-cis ، وهو الصبغي البصري الذي يرتبط ب opsin في المستقبلات الضوئية لتشكيل بروتين الريتينيليدين ، رودوبسين. يتسبب امتصاص الضوء في تزومرة رابطة الدول المستقلة إلى العابرة لشبكية العين 11-cis ، مما يؤدي إلى تغييرات توافقية في رودوبسين والتنشيط اللاحق لسلسلة النقل الضوئي. يمكن أن يؤثر انخفاض تركيزات المصل و ROL العيني على تكوين بروتين الريتينيليدين ، والذي بدوره يمكن أن يتسبب في سوء تحديد موقع الرودوبسين ، وتراكم أوبسين ، والعمى الليلي ، وتنكس الجزء الخارجي لمستقبلات الضوء ، مما يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي أو داء ليبر الخلقي.

لذلك ، فإن منهجيات القياس الطيفي لتحديد كمية مركب الشبكية opsin-11-cis المقترن ببروتين G في شبكية العين أمر بالغ الأهمية لفهم آليات تنكس خلايا الشبكية في الحالات المرضية المذكورة أعلاه. باستخدام هذه المنهجيات الشاملة ، سيتمكن الباحثون من تقييم إمدادات فيتامين أ الغذائية بشكل أفضل في الحفاظ على توازن الريتينويد الجهازي والعيني ، وهو أمر بالغ الأهمية لتوليد تركيزات بروتين الريتينيلدين والحفاظ عليها في المستقبلات الضوئية ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوظيفة البصرية لدى البشر.

Introduction

يعد فيتامين أ / الريتينول / ROL الذي تم الحصول عليه في النظام الغذائي مكونا مهما يلعب دورا في الوظيفة البصرية1،2. يرتبط شبكية الشبكية chromophore 11-cis ، وهو مستقلب لفيتامين A الغذائي ، بمستقبلات G المقترنة بالبروتين G (GPCR) opsin لتوليد بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في المستقبلات الضوئية. عندما يسقط الضوء على العين ، يخضع تكوين رودوبسين لتغيير جوهري من خلال تحويل مكون شبكية العين 11 رابطة الدول المستقلة إلى الشبكية العابرة بالكامل. يؤدي هذا التغيير في التكوين إلى سلسلة من التنبيغ الضوئي داخل المستقبلات الضوئية للقضيب ، مما يحول الضوء إلى إشارة كهربائية ، والتي تنتقل إلى القشرة البصرية في الدماغ عبر العصب البصري3،4،5،6،7،8،9،10. يمكن أن يؤثر انخفاض تركيزات المصل و ROL العيني على تكوين بروتين الريتينيليدين ، والذي بدوره يتسبب في وضع خلل في opsin ، وتراكم opsin apoprotein ، والعمى الليلي ، وتنكس OS المستقبلات الضوئية ، مما يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي أو Leber Congenital Amaurosis ، والذي يمكن أن يسبب العمى3،10.

الريتينول المتحولة بالكامل هو شكل النقل الأساسي لفيتامين أ الغذائي وهو المصدر الذي يتم اشتقاق منه جميع الرتينويدات الوظيفية ومستقلبات فيتامين أ الغذائية. يعمل الكبد كعضو أساسي لتخزين فيتامين أ الغذائي. يتم نقل الريتينول الكبدي عبر المصل كمركب مع البروتين المرتبط بالريتينول 4 (RBP4). RBP4 ، الذي يتم التعبير عنه بشكل أساسي في الكبد ، يشكل مركبا هولو مع ركيزة الريتينول وترانسثيريتين (TTR) ، والذي يدخل الدورة الدموية11،12،13،14،15،16،17. أدى تقرير مستقبلات سطح الخلية ل RBP4 في السبعينيات إلى فرضية بروتينات نقل الغشاء التي تساعد في نقل الريتينويدات داخل وخارج الخلايا. تم تحديد مستقبل سطح الخلية للريتينول المرتبط ب RBP4 (RBP4-ROL) على أنه STimulated بواسطة حمض الريتينويك 6 ريتينول (STRA6) في ظهارة صبغة الشبكية (RPE) للعين. يرتبط STRA6 بمركب الدورة الدموية holo-RBP4 وينقل الريتينول المرتبط ب RBP4 عبر RPE لاستخدامه بواسطة المستقبلات الضوئية18،19. يمكن أن تؤدي الطفرات في STRA6 إلى عدد لا يحصى من الأمراض والأنماط الظاهرية المرتبطة بانخفاض تركيزات ROL في العين. يمكن أن تؤدي طفرات STRA6 أثناء التطور إلى فقدان الملتحمة ، وصغر الملتحمة ، والأعراض غير العينية الأخرى التي تتداخل مع الأنماط الظاهرية المرتبطة بمتلازمة ماثيو وود20،21،22،23،24،25،26،27. يتم التعبير عن STRA6 في أعضاء وأنسجة مختلفة ، مثل RPE في العين ، ولكن ليس في جميع الأنسجة26،27. على الرغم من أن الموقع الأساسي لتخزين الريتينويد هو الكبد ، إلا أن STRA6 لا يتم التعبير عنه في الكبد.

اكتشف ألابات وزملاؤه أن مستقبلات بروتين ربط الريتينول 4 2 (RBPR2) مرتبطة ب RBP4 مع تقارب عال وكان مسؤولا عن امتصاص الريتينول المرتبط ب RBP4 في الكبد ، على غرار STRA6 في RPE28. تم الإبلاغ عن أن RBPR2 يشترك في التماثل الهيكلي مع STRA629،30،31. يقترح RBP4 أن يرتبط بالمخلفات S294 و Y295 و L296 على RBPR2 ، وهو مجال مرتبط بالأحماض الأمينية محفوظ جزئيا بين RBPR2 و STRA6 وكذلك29،30،31. من هذه الدراسات ، يقترح أن تتفاعل مستقبلات غشاء فيتامين أ مثل STRA6 و RBPR2 ، والتي تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا / مجالات الارتباط خارج الخلية ، مع RBP4-ROL الدورة الدموية. لذلك ، تلعب مستقبلات الغشاء دورا مهما في ارتباط المستقبلات بالدورة الدموية RBP4 لاستيعاب ROL في الأنسجة المستهدفة ، مثل الكبد والعين.

في الجزء الأول من هذه الدراسة ، استخدمنا رنين البلازمون السطحي (SPR) للتحقيق في تفاعل اثنين من مستقبلات غشاء فيتامين أ (RBPR2 و STRA6) مع الترابط الفسيولوجي RBP431. يمكن قياس صلات الارتباط وحركية الارتباط / الانفصال للبروتين بمجمعات الترابط في الوقت الفعلي باستخدام SPR. تهدف هذه المنهجية إلى توفير معلومات حركية وهيكلية وكيميائية حيوية مهمة حول الزخارف المرتبطة ب RBP4 في RBPR2 و STRA6 ، والتي تعتبر ضرورية لفهم الحالات المرضية لنقص فيتامين أ31،32. كما ذكرنا أعلاه ، يتم استيعاب ROL الدورة الدموية في RPE عبر STRA6 لتوليد شبكية الصبغة 11-cis ، والتي ترتبط ب opsin لتوليد بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في المستقبلات الضوئية33. استخدمنا منهجيات القياس الطيفي لتحديد كمية GPCR-opsin ومركب شبكية الترابط 11-cis في محلل شبكية الفئران ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم آليات انخفاض بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في التهاب الشبكية الصباغي أو حالات ليبر المرضية المرضية للعين الخلقية34. بشكل عام ، يمكن تطبيق هذه البروتوكولات لدراسة العواقب الفسيولوجية المتحولة RBP4 أو STRA6 أو RBPR2 في المختبر في التأثير على توازن فيتامين أ الجهازي والعيني أو تأثير بروتينات دورة الرودوبسين أو دورة الريتينويد الطافرة على الوظيفة البصرية35،36.

Protocol

1. منهجية رنين البلازمون السطحي (SPR)

  1. تحضير وتنقية بروتين RBP4 للفأر
    1. صمم بادئات لإنشاء ماوس كامل الطول RBP4 (msRBP4) (التسلسل المرجعي NCBI: NM_001159487.1). استنساخ msRBP4 cDNA في ناقل تعبير مقاوم للكاناميسين pET28a والتعبير عنه في خلايا BL-21 DE3 (جدول المواد).
    2. قم بتحويل الخلايا المختصة BL-21 DE3 (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) باستخدام ناقل MSRBP4-pET28a ثم اللوحة على ألواح مرق Luria-Bertani (LB) Agar التي تحتوي على Kanamycin 50 ميكروغرام / مل30،37. احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة وفحص المستعمرات الإيجابية في اليوم التالي.
    3. اختر مستعمرة واحدة واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5 مل من مرق LB الذي يحتوي على Kanamycin 50 ميكروغرام / مل.
    4. للاستزراع الثانوي في 500 مل من مرق LB المحتوي على 50 ميكروغرام / مل ، استخدم حجم 1٪ من المزرعة الأولية (من الخطوة 1.1.3) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعات ؛ تحقق من الكثافة البصرية باستخدام مقياس الطيف الضوئي. من الناحية المثالية ، تابع إذا كانت قيمة OD بين 0.6 و 1 للحث على التعبير عن البروتين مع 0.5 ملي مولار IPTG عند 24 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. استخدم تركيزات IPTG متعددة من 0.1-1 ملي مولار ونطاق درجة حرارة 16-30 درجة مئوية لتحسين تعبير مللي ثانيةRBP4 واستقراره.
    6. قم بالطرد المركزي للثقافة (من الخطوة 1.1.5) عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، واحتفظ بالحبيبات على الجليد.
    7. تجانس الحبيبات مع محلول التحلل (50 ملي مولار Tris-HCl ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ (حجم / حجم) تريتون X-100 ، 10٪ جلسرين ، 0.5 ملي مولار PMSF ، ومثبطات الإنزيم البروتيني [درجة الحموضة 8.0]). قم بتشغيل المحللة لمدة 15 ثانية ودورة إيقاف تشغيل 30 ثانية باستخدام الخالط بإخراج 250 وات وتردد إخراج 40-50٪ 20 كيلو هرتز. كرر 5x.
    8. قم بإزالة بقايا الخلية والخلايا غير المتحللة عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة. مرر المادة الطافية للمحللة من خلال عمود NTA من النيكل متوازن المخزن المؤقت.
    9. اغسل العمود بمحلول التحلل (من الخطوة 1.1.8) الذي يحتوي على 30 ملي مولار من إيميدازول.
    10. في الكسور ، قم بإزالة بروتين MSRBP4 المرتبط باستخدام المخزن المؤقت الذي يحتوي على 250 ملي مولار إيميدازول. قم بتشغيل الكسور المملحة وراقب كمية البروتين بصريا باستخدام جل بولي أكريلاميد SDS بنسبة 12٪ ، ملطخ بمحلول Coomassie Brilliant Blue R-250 في محلول الميثانول: الماء: حمض الأسيتيك (45:45:10) وإزالة البقع بمحلول بدون صبغة Coomassie الميثانول: الماء: حمض الأسيتيك (45:45:10).
    11. قم بتجميع الكسور غير المستخدمة وغسيل الكسور المجمعة باستخدام كاسيت غسيل الكلى 10K بسعة 10 كيلو دالتون MWCO.
    12. قم بتقييم جودة الجزء المخلل على جل SDS-PAGE بنسبة 12٪ وحدد تركيز البروتين.
      ملاحظة: تم استخدام بروتين Apo-RBP4 في تحليل SPR. لتوليد holo-RBP4 (RBP4-retinol) ، راجع البروتوكولات التفصيلية المنشورة في مكان آخر36،37.
  2. التحقق الأولي من الببتيدات RBPR2 و STRA6 باستخدام RBP4 للبنية والتفاعل عن طريق مقايسة مضان التربتوفان والتحليل الطيفي لثنائي اللون الدائري (CD)
    1. مقايسة مضان التربتوفان
      1. استخدم أداة تحليل تكوين البروتين عبر الإنترنت (https://web.expasy.org/protparam/) والصق تسلسل الأحماض الأمينية في رمز مكون من حرف واحد لتقييم التركيب الهيكلي لبروتين RBP4 المؤتلف والببتيدات الفردية ل RBPR2 و STRA6 لتحديد بقايا الأحماض الأمينية التربتوفان في الببتيدات والبروتين الفردي (جدول المواد).
      2. انقر فوق زر معلمات الحساب وقم بتقييم تكوين الأحماض الأمينية لبقايا التربتوفان (Trp).
        ملاحظة: يجب أن تكون بقايا التربتوفان موجودة في الببتيدات الفردية أو البروتينات التي يتم تحليلها.
      3. قم بتخفيف ببتيدات RBPR2 و STRA6 الفردية بتركيزات ميكرومولار مختلفة واحتضانها بشكل فردي مع 3 ميكروغرام مللي ثانيةRBP4 في صفيحة 96 بئرا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإثارة المزيج عند 290 نانومتر ومسح الانبعاثات من 300 نانومتر إلى 400 نانومتر الطول الموجي.
      4. تطبيع البيانات باستخدام الفراغ (المخزن المؤقت فقط ، لا الببتيد ولا البروتين) وحالة التحكم في الببتيد (بدون بروتين) والمؤامرة.
        ملاحظة: تشير الزيادة الفلورية في التربتوفان عند التعرض لتركيز ببتيد منخفض إلى مرتفع إلى تفاعل إيجابي بين الببتيدات الفردية وبروتين RBP4.
    2. التحليل الطيفي لثنائي اللون الدائري (CD)
      1. خفف الببتيدات الفردية وبروتين RBP4 المؤتلف في 1x PBS buffer ، درجة الحموضة 7.0. استخدم تركيزات مختلفة من ببتيدات RBPR2 و STRA6 وبروتين RBP4 من 0.1 إلى 10 ميكروغرام / مل لفحص الجودة ، كما هو موضح أدناه.
      2. أضف الببتيدات المخففة الفردية والبروتين في كوفيت بطول مسار 0.1 سم وقم بقياس امتصاص / إهليلجية القرص المضغوط باستخدام مقياس الطيف الضوئي CD (195-250 نانومتر). استخدم الصيغة أدناه لحساب متوسط الإهليلجية للبقايا (θ).
        [v] = (S × mRw) / (10cl)
        يمثل S إشارة القرص المضغوط بالبالمتر المكعب. يمثل mRw متوسط كتلة البقايا. ج يمثل تركيز البروتين في ملغم / مل ؛ ويمثل l طول المسير بالسنتيمتر.
      3. احسب النسبة المئوية للتغير في بنية الجزيء باستخدام تحليل الهيكل الثانوي BeStSel للتنبؤ بطية البروتين بواسطة التحليل الطيفي للقرص المضغوط (https://bestsel.elte.hu).
        ملاحظة: يشير الهيكل الثانوي إلى التأكيدات المناسبة والمحفوظة الحاسمة لدراسة التفاعل ونتائج التفاعلات. افحص الهيكل المتوقع للمجال وتابع دراسة التفاعل.

2. تحليل SPR لتحديد صلات الارتباط والمعلمات الحركية لمستقبلات غشاء فيتامين أ (RBPR2 و STRA6) مع الترابط الفسيولوجي RBP4

  1. لتثبيت RBP4 على إعداد سطح رقاقة CM5 ، نستخدم شريحة مستشعر SPR ، والتي تحمل رابط كربوكسي ميثيل ديكستران ممتد إلى حجم ~ 100 نانومتر متصل تساهميا على سطح ذهبي. في وجود 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) ، يقوم N-hydroxysuccinimide (NHS) بتحويل مجموعات الكربوكسيل الموجودة على سطح الرقاقة إلى استرات N-Hydroxysuccinimide ، والتي تتفاعل تلقائيا مع مجموعات الأمين من الأحماض الأمينية والبروتينات ، مما يجبر الترابط على الارتباط بشكل تساهمي على سطح الرقاقة (جدول المواد).
    1. قم بتثبيت بروتين MSRBP4 المنقى على شريحة المستشعر (الشكل 1 والشكل 2). في قائمة تشغيل البرنامج ، اختر المعالج وتابع خيار الشلل. قم بتخفيف الترابط (مولثانيةRBP4 بروتين تم الحصول عليه من الخطوة 1.1) في مخزن مؤقت للتثبيت (10 ملي مولار من أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 5.0) إلى 10 ميكروغرام / مل (4 ميكرولتر من الترابط + 396 ميكرولتر من المخزن المؤقت) وقم بنقل كواشف الاقتران في قوارير. افتح نافذة معالج إعداد الشلل من عنصر التحكم في البرنامج ، وحدد شريحة CM5 ، وخيار تثبيت خلية التدفق 2 والمستوى المستهدف 1,200 وحدة استجابة (RU) لتحقيق Rmax يبلغ 30 RU في الدراسة الحركية ومحلول الغسيل: الإيثانول أمين. أدخل الاسم RBP4 وانقر فوق التالي.
      ملاحظة: اختياري: لا يلزم وجود مربع حوار System Preparations لخيار Prime قبل التشغيل إذا تم إجراء التحضير باستخدام PBST المؤقت قيد التشغيل (محلول ملحي مخزن مؤقت بالفوسفات مع محلول منظف Tween 20 بنسبة 0.05٪) مسبقا.
    2. في مربع الحوار موضع الحامل ، انقر فوق إخراج الرف. خذ الرف وضع القوارير ذات الأحجام المخصصة لكل كاشف: 156 ميكرولتر من مللي ثانيةRBP4 ، 177 ميكرولتر من الإيثانول أمين ، 89 ميكرولتر من EDC ، 89 ميكرولتر من NHS ، وقارورة فارغة. أدخل الرف مع قوارير العينة وانقر فوق موافق و التالي.
    3. في مربع الحوار إعداد بروتوكول التشغيل، انقر فوق البدء وحفظ.
  2. إعداد الفحص الحركي للببتيدات RBPR2 و STRA6
    1. قم بتخفيف ببتيدات RBPR2 و RBPR2 و STRA6 المتبادلة بشكل متسلسل (تم تصنيعها كيميائيا سابقا31 والمدرجة في جدول المواد) في تشغيل المخزن المؤقت في نطاق 0.8-26.6 ميكرومتر.
    2. افتح برنامج التحكم وحدد معالج الحركية/التقارب. انقر فوق ملف | افتح القالب وحدد الحركية/التقارب. أدخل مسار تدفق مربع حوار تسلسل الحقن 2-1 (خلية التدفق 2 كنشطة وخلية التدفق 1 كمرجع)، وتحقق من نوع الرقاقة CM5، وانقر فوق التالي. في مربع حوار الإعداد، تحقق من تشغيل دورات بدء التشغيل، وأدخل الحل: المخزن المؤقت والدورات: وانقر فوق التالي.
    3. في مربع حوار معلمات الحقن ، أدخل قيم معلمات العينة : وقت الاتصال: 120 ثانية ، معدل التدفق 30 ميكرولتر / دقيقة ، وقت التفكك 300 ثانية ؛ للحصول على معلمات التجديد : أدخل اسم محلول التجديد: Glycine-HCl (درجة الحوهضة 2.5) ، وقت الاتصال: 30 ثانية ، معدل التدفق: 30 ميكرولتر / دقيقة وانقر فوق التالي.
    4. في مربع حوار العينات ، أدخل اسم الببتيدات والوزن الجزيئي والتركيزات وانقر فوق التالي. في مربع حوار موضع الرف ، قم بتعيين الببتيدات المخففة كعينات فردية ~ 120 ميكرولتر بتركيزات مختلفة من 1 إلى 100 ميكرومتر و ~ 230 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، ~ 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، و ~ 1,000 ميكرولتر من الجلايسين ، درجة الحموضة 2.5 ، إلى المواضع الموجودة على الرف. انقر فوق Eject Rack وأدخل جميع القوارير. انقر فوق التالي، وفي مربع الحوار إعداد بروتوكول التشغيل، انقر فوق ابدأ، وأدخل اسم ملف، وحفظ (الشكل 2).
    5. في البرنامج، انقر فوق قائمة ابدأ وحدد التقييم. اختر فتح الملف في البرنامج ، ومن قائمة التحديد المنسدلة ، اختر Fc2-1 لتحليل مخطط الاستشعار النشط المطروح للخلية المرجعية فارغة لمراحل الاقتران والتفكك لببتيدات msRBP4 والطافرة msRBPR2 و msSTRA6.
    6. انقر فوق زر القائمة المنسدلة Kinetics / Affinity واختر Surface bound ؛ لفتح مربع الحوار تحديد المنحنيات ، حدد تضمين العمود في الجدول وانقر فوق التالي. حدد مربع حوار البيانات لإظهار أجهزة الاستشعار المطروحة الفارغة. انقر فوق Kinetics and Affinity، واحتفظ بالمعلمات الافتراضية، وانقر فوق خيار Fit لملاءمة المنحنى. افحص علامة التبويب "تقرير" بحثا عن ثابت تفكك التوازن Kd و Kأو Kعلى معدل الاقتران وKD أو Kمن معدل التفكك. احفظ مخطط استشعار بيانات Kinetics بتنسيق محدد لعلامة التبويب .txt واستخدم القيم لرسم الرسوم البيانية (الشكل 3).
    7. لتحديد ثابت حركية التقارب Kd (تركيز الترابط الذي يرتبط بنصف المستقبلات عند التوازن) ، انسخ والصق أعمدة البيانات في ملف تنسيق .txt الذي تم إنشاؤه من مخطط التقييم إلى XY المستخدم في البرنامج. انقر فوق تحليل والانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى)، وتحقق من عمود البيانات، ثم انقر فوق موافق. في مربع حوار المعلمة، انقر فوق تشبع الربط ونموذج ملاءمة ربط خاص بموقع واحد مع صيغة:
      Y = (Bmax * X) / (دينار كويتي + X)
      حيث Bmax هو الحد الأقصى لعدد مواقع الربط (وحدة الاستجابة) ، X هو تركيز الببتيدات ، و Y هو الربط (وحدة الاستجابة) (الشكل 3).

3. منهجية القياس الطيفي لتحديد مركب بروتين الشبكية GPCR-11- رابطة الدول المستقلة (بروتين الريتينيلدين رودوبسين) في محللات الشبكية

  1. انقل مجموعة الفئران المحددة مسبقا المكونة من الفئران البالغة WT-C57BL / 6J إلى الغرفة المظلمة.
  2. قم بتكييف الفئران طوال الليل لمدة 12-16 ساعة ، وتحت الضوء الأحمر ، ضع الماوس في غرفة القتل الرحيم وافتح صمام غاز ثاني أكسيد الكربون2 على المنظم إلى 5 لتر / دقيقة لمدة ~ 5 دقائق. ضمان الموت عن طريق الضغط على الرقبة والذيل المسحوب للخلف (خلع عنق الرحم).
  3. استئصال كرات العين وتجانس العينين في عازلة مثلجة باردة تحتوي على 20 ملي مولار ثنائي تريس البروبان (1،3 مكرر (تريس (هيدروكسي ميثيل) ميثيلامينو) البروبان. BTP) درجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ومع مثبط البروتياز (جدول المواد).
  4. جهاز الطرد المركزي المتجانس لمدة 15 دقيقة عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات العصارة الخلوية القابلة للذوبان في الماء. أعد تعليق وحل الغشاء المحبب وبروتينات الغشاء في مخزن مؤقت يحتوي على 20 ملي مولار n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) ، 20 ملي مولار ثنائي البروبان (BTP) درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ومع مثبط البروتياز لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية على منصة دوارة.
  5. جهاز الطرد المركزي لجزء الغشاء القابل للذوبان لمدة 1 ساعة عند 16000 × جم ، 4 درجات مئوية. امزج المادة الطافية مع 30 ميكرولتر من حبات الأجسام المضادة Rho 1D4 واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية على منصة دوارة.
  6. باستخدام حامل مغناطيسي ، افصل المنسدلة باستخدام الخرز ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسل الخرزات بمحلول عازل 20 ملي مكرر البروبان (BTP) درجة الحموضة 7.4 ، و 500 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2 ملي مولار DDM.
  7. قم بتخطيب بروتين رودوبسين عن طريق الحضانة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع محلول عازل 20 ملي مولار مكرر البروبان (BTP) درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مولار DDM يحتوي على 0.2 مجم / مل 1D4 الببتيد (-TETSQVAPA) (الشكل 4 والشكل 5).
  8. قم بتحليل السطح للامتصاص من 200 نانومتر إلى 800 نانومتر باستخدام فتحة مستطيلة ، شبه دقيقة ، كوارتز ، فتحة 2 مم ، طول مسار 10 مم ، كوفيت 50 ميكرولتر في إعداد مسح سريع باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    ملاحظة: استخدم فقط كوفيت الكوارتز عالي الجودة (الشكل 4).
  9. للتحقق من صحة الجودة وتحديدها ، تحقق من الغطاء وعرضه للضوء الساطع لمدة دقيقة واحدة ، ثم كرر الخطوة 3.8.
  10. اطرح الامتصاص الفارغ واحسب نسبة أطياف الامتصاص التي تم تحليلها مع الامتصاص عند 500 نانومتر ل 11-cis opsin المرتبط بالشبكية ، و 380 نانومتر للأوبسين المرتبط بالشبكية بالكامل المتعرض للضوء ، و 280 نانومتر لبروتين Apo-Opsin الخالي من الترابط (الشكل 6). يعطي opsin الحر الذي لا يحتوي على شبكية الترابط امتصاصا أساسيا عند 500 نانومتر.
  11. لتحديد تركيز رودوبسين ، استخدم قانون بير لامبرت:
    أ = ε · C · l أو C = A / ε · ل
    حيث A هو الامتصاص ، ε معامل الانقراض المولي (رودوبسين ε500 = 40،600 M−1 cm−1 مجانا Apo Opsin ε280 = 81،200 M−1 cm−1) ، C هو التركيز ، و l طول المسار.
  12. لقياس Opsin liganded بالنسبة المئوية ، استخدم نسبة A280 / A500.
  13. ارسم أطياف الامتصاص المطروحة الفارغة واحسب قيمة opsin الحرة32.
  14. احسب تركيز رودوبسين باستخدام معامل الانقراض ε500 = 40600 M−1 cm−1. يتم حساب تركيز opsin الخالي من الترابط باستخدام قانون Beer-Lambert باستخدام معامل الانقراضε 280 = 81،200 M−1 cm−1.

النتائج

يتم وصف الطرق الكمية لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها. يجب التعبير عن الفأر المؤتلف RBP4 في الإشريكية القولونية والبروتين المنقى المستخدم كرابط مترافق على شريحة SPR. يتم استخدام RBPR2 و STRA6 والم?...

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
منهجية SPR
في تحليل النمذجة والالتحام السيليكو: يجب استخدام الهيكل المتوقع ل RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) و STRA6 ، والهيكل المعروف لقاعدة بيانات msRBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa) ، لدراسة الإرساء29،31

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة. في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها. في كتابة المخطوطة، أو في قرار نشر النتائج.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدكتورة بياتا جاسترزيبسكا ، دكتوراه (قسم علم الأدوية ، جامعة كيس ويسترن ريزيرف ، أوهايو) على نصيحتها بشأن بروتوكول امتصاص رودوبسين. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH-NEI (EY030889 و 3R01EY030889-03S1) ، وجزئيا ، من خلال صناديق بدء تشغيل جامعة مينيسوتا إلى GPL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

References

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676 (2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229 (2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236 (2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371 (2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099 (2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657 (2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293 (2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169 (2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

212 RBPR2 STRA6 RBP4 Apoprotein

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved