A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
هنا ، نصف طريقتين كميتين لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء opsin مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها.
يعد توزيع فيتامين أ / الريتينول المتحول بالكامل (ROL) في جميع أنحاء الجسم أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على وظيفة الريتينويد في الأنسجة المحيطية وتوليد بروتين الريتينيلدين للوظيفة البصرية. RBP4-ROL هو مركب ROL مع البروتين المرتبط بالريتينول 4 (RBP4) ، الموجود في الدم. مستقبلان غشاءيان ، مستقبلات ربط الريتينول 4 مستقبلات 2 (RBPR2) في الكبد ويتم تثبيتها بواسطة حمض الريتينويك 6 الريتينول (STRA6) في العين ، يربطان RBP4 الدورة الدموية وهذه الآلية ضرورية لاستيعاب ROL في الخلايا. يعد إنشاء طرق للتحقيق في حركية المستقبلات والترابط أمرا ضروريا لفهم الوظيفة الفسيولوجية لمستقبلات فيتامين أ لتوازن الريتينويد. باستخدام فحوصات رنين البلازمون السطحي (SPR) ، يمكننا تحليل صلات الارتباط والمعلمات الحركية لمستقبلات غشاء فيتامين أ باستخدام الترابط الفسيولوجي RBP4.
يمكن أن تكشف هذه المنهجيات عن معلومات هيكلية وكيميائية حيوية جديدة عن الزخارف المرتبطة ب RBP4 في RBPR2 و STRA6 ، والتي تعتبر ضرورية لفهم الحالات المرضية لنقص فيتامين A. في العين ، يتم استقلاب ROL الداخلي إلى شبكية العين 11-cis ، وهو الصبغي البصري الذي يرتبط ب opsin في المستقبلات الضوئية لتشكيل بروتين الريتينيليدين ، رودوبسين. يتسبب امتصاص الضوء في تزومرة رابطة الدول المستقلة إلى العابرة لشبكية العين 11-cis ، مما يؤدي إلى تغييرات توافقية في رودوبسين والتنشيط اللاحق لسلسلة النقل الضوئي. يمكن أن يؤثر انخفاض تركيزات المصل و ROL العيني على تكوين بروتين الريتينيليدين ، والذي بدوره يمكن أن يتسبب في سوء تحديد موقع الرودوبسين ، وتراكم أوبسين ، والعمى الليلي ، وتنكس الجزء الخارجي لمستقبلات الضوء ، مما يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي أو داء ليبر الخلقي.
لذلك ، فإن منهجيات القياس الطيفي لتحديد كمية مركب الشبكية opsin-11-cis المقترن ببروتين G في شبكية العين أمر بالغ الأهمية لفهم آليات تنكس خلايا الشبكية في الحالات المرضية المذكورة أعلاه. باستخدام هذه المنهجيات الشاملة ، سيتمكن الباحثون من تقييم إمدادات فيتامين أ الغذائية بشكل أفضل في الحفاظ على توازن الريتينويد الجهازي والعيني ، وهو أمر بالغ الأهمية لتوليد تركيزات بروتين الريتينيلدين والحفاظ عليها في المستقبلات الضوئية ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوظيفة البصرية لدى البشر.
يعد فيتامين أ / الريتينول / ROL الذي تم الحصول عليه في النظام الغذائي مكونا مهما يلعب دورا في الوظيفة البصرية1،2. يرتبط شبكية الشبكية chromophore 11-cis ، وهو مستقلب لفيتامين A الغذائي ، بمستقبلات G المقترنة بالبروتين G (GPCR) opsin لتوليد بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في المستقبلات الضوئية. عندما يسقط الضوء على العين ، يخضع تكوين رودوبسين لتغيير جوهري من خلال تحويل مكون شبكية العين 11 رابطة الدول المستقلة إلى الشبكية العابرة بالكامل. يؤدي هذا التغيير في التكوين إلى سلسلة من التنبيغ الضوئي داخل المستقبلات الضوئية للقضيب ، مما يحول الضوء إ....
1. منهجية رنين البلازمون السطحي (SPR)
يتم وصف الطرق الكمية لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها. يجب التعبير عن الفأر المؤتلف RBP4 في الإشريكية القولونية والبروتين المنقى المستخدم كرابط مترافق على شريحة SPR. يتم استخدام RBPR2 و STRA6 والم?.......
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
منهجية SPR
في تحليل النمذجة والالتحام السيليكو: يجب استخدام الهيكل المتوقع ل RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) و STRA6 ، والهيكل المعروف لقاعدة بيانات msRBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa) ، لدراسة الإرساء29،31
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة. في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها. في كتابة المخطوطة، أو في قرار نشر النتائج.
يشكر المؤلفون الدكتورة بياتا جاسترزيبسكا ، دكتوراه (قسم علم الأدوية ، جامعة كيس ويسترن ريزيرف ، أوهايو) على نصيحتها بشأن بروتوكول امتصاص رودوبسين. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH-NEI (EY030889 و 3R01EY030889-03S1) ، وجزئيا ، من خلال صناديق بدء تشغيل جامعة مينيسوتا إلى GPL.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-D Quant Kit | Cytiva | 80648356 | |
Amine Coupling Kit | Cytiva | BR100050 | |
Biacore evaluation software | Biacore S200 | Version 1.1 | |
Biacore Sensor chip CM5 | Cytiva | BR100530 | |
Bis tris propane | Sigma | B6755-25G | 20 mM |
BL21 DE3 competent cells | Thermo Scientific | EC0114 | |
CD spectrophotometer | Jasco | J-815 Spectropolarimeter | |
Glycine HCL | Fisher Bioreagents | BP381-1 | |
GraphPad Prism | Model fitting, data analysis | ||
LB broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) | EMD Millipore | 324355-1GM | 2-20 mM |
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector | Addgene | 69864-3 | |
Plasmid purification kit | Qiagen | 27106 | |
Rho1D4 MagBeads | CubeBiotech | 33299 | |
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 | |
Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | 0.05% |
UV vis Spectrophotometer | Agilent | Cary 60 UV-Vis | |
Peptide name | Peptide sequence | HPLC-purity | Mass Spec |
Mouse Rbpr2 (42) | HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG | 92.14% | Conforms |
Mouse Stra6 (40) | SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK | 90.84% | Conforms |
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42) | HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG | 0.92% | Conforms |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved