Методология изучения взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и белка опсина с их лигандами в формировании белка ретинилидена

Резюме

В данной работе мы описываем два количественных метода изучения белок-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецепторного опсина с соответствующими физиологическими лигандами.

Аннотация

Распределение витамина А/полностью транс-ретинола (ROL) в организме имеет решающее значение для поддержания функции ретиноидов в периферических тканях и выработки белка ретинилидена для зрительной функции. RBP4-ROL представляет собой комплекс ROL с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4), который присутствует в крови. Два мембранных рецептора, рецептор 2 ретинола, связывающий белок 4 (RBPR2) в печени и ретинол ретиноевой кислоты 6 (STRA6) в глазу, связываются с циркуляторным RBP4, и этот механизм имеет решающее значение для интернализации ROL в клетки. Разработка методов исследования кинетики рецептор-лиганд имеет важное значение для понимания физиологической функции рецепторов витамина А для ретиноидного гомеостаза. Используя анализы поверхностного плазмонного резонанса (SPR), мы можем проанализировать аффинность связывания и кинетические параметры мембранных рецепторов витамина А с его физиологическим лигандом RBP4.

Эти методологии могут раскрыть новую структурную и биохимическую информацию о RBP4-связывающих мотивах в RBPR2 и STRA6, что имеет решающее значение для понимания патологических состояний дефицита витамина А. В глазу интернализованный ROL метаболизируется в 11-цис-ретиналь, зрительный хромофор, который связывается с опсином в фоторецепторах с образованием белка ретинилидена, родопсина. Поглощение света вызывает цис-в-транс-изомеризацию 11-цис-сетчатки, индуцируя конформационные изменения родопсина и последующую активацию каскада фототрансдукции. Снижение концентраций сывороточного и глазного ROL может повлиять на образование белка ретинилидена, что, в свою очередь, может вызвать неправильную локализацию родопсина, накопление апопротеинов опсина, куриную слепоту и дегенерацию внешних сегментов фоторецепторов, что приводит к пигментному ретиниту или врожденному амаврозу Лебера.

Таким образом, спектрофотометрические методики для количественного определения комплекса сетчатки, связанного с G-белком опсин-11-цис, в сетчатке имеют решающее значение для понимания механизмов дегенерации клеток сетчатки при вышеупомянутых патологических состояниях. С помощью этих всеобъемлющих методологий исследователи смогут лучше оценить поступление витамина А с пищей в поддержание системного и глазного ретиноидного гомеостаза, который имеет решающее значение для генерации и поддержания концентрации белка ретинилидена в фоторецепторах, что имеет решающее значение для поддержания зрительной функции у человека.

Введение

Полученный с пищей витамин А/полностью транс-ретинол/ROL является важным компонентом, играющим роль в зрительной функции ^1,2. Хромофор 11-цисного сетчатки, метаболит пищевого витамина А, связывается с опсином, связанным с G-белком (GPCR), для выработки ретинилиденового белка, родопсина, в фоторецепторах. Когда свет попадает на глаз, конфигурация родопсина претерпевает фундаментальные изменения за счет преобразования его 11-цис-ретинального компонента в полностью транс-ретинальный. Это изменение конфигурации запускает каскад фототрансдукции в....

протокол

1. Методология поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

1. Приготовление и очистка мышиного белка RBP4
   1. Разработка праймеров для генерации полноразмерной кДНК мыши RBP4 (msRBP4) (референсная последовательность NCBI: NM_001159487.1). Клонировать кДНК msRBP4 в вектор экспрессии pET28a His-tag Kanamycin-resistant и экспрессировать в клетках BL-21 DE3 (Таблица материалов).
   2. Компетентные клетки BL-21 DE3 (в соответствии с протоколом производителя) трансформируют с помощью лигированного вектораRBP4-pET28a и затем наносят на агаровые планшеты бульона Лурии-....

Результаты

Описаны количественные методы изучения белково-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецептора опсина с соответствующими физиологическими лигандами. Рекомбинантный мышиный RBP4 должен экспрессироваться в E. coli и очищенном белке, испол.......

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Методология SPR
Моделирование in silico и анализ докинга: Для исследования стыковки^29,31 следует использовать предсказанную структуру RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) и STRA6, а также известную с.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms