АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы описываем два количественных метода изучения белок-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецепторного опсина с соответствующими физиологическими лигандами.

Аннотация

Распределение витамина А/полностью транс-ретинола (ROL) в организме имеет решающее значение для поддержания функции ретиноидов в периферических тканях и выработки белка ретинилидена для зрительной функции. RBP4-ROL представляет собой комплекс ROL с ретинол-связывающим белком 4 (RBP4), который присутствует в крови. Два мембранных рецептора, рецептор 2 ретинола, связывающий белок 4 (RBPR2) в печени и ретинол ретиноевой кислоты 6 (STRA6) в глазу, связываются с циркуляторным RBP4, и этот механизм имеет решающее значение для интернализации ROL в клетки. Разработка методов исследования кинетики рецептор-лиганд имеет важное значение для понимания физиологической функции рецепторов витамина А для ретиноидного гомеостаза. Используя анализы поверхностного плазмонного резонанса (SPR), мы можем проанализировать аффинность связывания и кинетические параметры мембранных рецепторов витамина А с его физиологическим лигандом RBP4.

Эти методологии могут раскрыть новую структурную и биохимическую информацию о RBP4-связывающих мотивах в RBPR2 и STRA6, что имеет решающее значение для понимания патологических состояний дефицита витамина А. В глазу интернализованный ROL метаболизируется в 11-цис-ретиналь, зрительный хромофор, который связывается с опсином в фоторецепторах с образованием белка ретинилидена, родопсина. Поглощение света вызывает цис-в-транс-изомеризацию 11-цис-сетчатки, индуцируя конформационные изменения родопсина и последующую активацию каскада фототрансдукции. Снижение концентраций сывороточного и глазного ROL может повлиять на образование белка ретинилидена, что, в свою очередь, может вызвать неправильную локализацию родопсина, накопление апопротеинов опсина, куриную слепоту и дегенерацию внешних сегментов фоторецепторов, что приводит к пигментному ретиниту или врожденному амаврозу Лебера.

Таким образом, спектрофотометрические методики для количественного определения комплекса сетчатки, связанного с G-белком опсин-11-цис, в сетчатке имеют решающее значение для понимания механизмов дегенерации клеток сетчатки при вышеупомянутых патологических состояниях. С помощью этих всеобъемлющих методологий исследователи смогут лучше оценить поступление витамина А с пищей в поддержание системного и глазного ретиноидного гомеостаза, который имеет решающее значение для генерации и поддержания концентрации белка ретинилидена в фоторецепторах, что имеет решающее значение для поддержания зрительной функции у человека.

Введение

Полученный с пищей витамин А/полностью транс-ретинол/ROL является важным компонентом, играющим роль в зрительной функции 1,2. Хромофор 11-цисного сетчатки, метаболит пищевого витамина А, связывается с опсином, связанным с G-белком (GPCR), для выработки ретинилиденового белка, родопсина, в фоторецепторах. Когда свет попадает на глаз, конфигурация родопсина претерпевает фундаментальные изменения за счет преобразования его 11-цис-ретинального компонента в полностью транс-ретинальный. Это изменение конфигурации запускает каскад фототрансдукции внутри палочковых фоторецепторов, преобразуя свет в электрический сигнал, который передается в зрительную кору головного мозга через зрительный нерв 3,4,5,6,7,8,9,10 . Снижение концентрации ROL в сыворотке крови и глазного ROL может повлиять на образование белка ретинилидена, что, в свою очередь, вызывает неправильную локализацию опсина, накопление апопротеина опсина, куриную слепоту и дегенерацию фоторецепторных OS, что приводит к пигментному ретиниту или врожденному амаврозу Лебера, что может привести кслепоте 3,10.

Полностью транс-ретинол является основной транспортной формой пищевого витамина А и источником, из которого получают все функциональные ретиноиды и пищевые метаболиты витамина А. Печень служит основным органом для накопления витамина А с пищей. Ретинол печени транспортируется через сыворотку крови в виде комплекса с ретинолсвязывающим белком 4 (RBP4). RBP4, экспрессируясь в первую очередь в печени, образует голокомплекс с субстратом ретинола и транстиретином (TTR), который поступает в кровоток 11,12,13,14,15,16,17. Сообщение о рецепторе клеточной поверхности для RBP4 в 1970-х годах привело к гипотезе о мембранных транспортных белках, способствующих транспортировке ретиноидов внутрь и из клеток. Рецептор клеточной поверхности для RBP4-связанного ретинола (RBP4-ROL) был идентифицирован как STimulated ретиноевой кислотой 6 ретинолом (STRA6) в пигментном эпителии сетчатки (RPE) глаза. STRA6 связывается с циркуляторным голо-RBP4-комплексом и перемещает RBP4-связанный ретинол через РПЭ для использования фоторецепторами18,19. Мутации в STRA6 могут привести к множеству заболеваний и фенотипов, связанных со снижением концентрации ROL в глазах. Мутации STRA6 во время развития могут привести к анофтальмии, микрофтальмии и другим неглазным симптомам, которые перекрываются с фенотипами, связанными с синдромом Мэтью-Вуда 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 экспрессируется в различных органах и тканях, таких как РПЭ в глазу, но не во всех тканях26,27. Хотя основным местом хранения ретиноидов является печень, STRA6 не экспрессируется в печени.

Алапатт и его коллеги обнаружили, что рецептор 2 ретинолсвязывающего белка 4 (RBPR2) связывает RBP4 с высоким сродством и отвечает за поглощение RBP4-связанного ретинола в печени, подобно STRA6 в RPE28. Сообщалось, что RBPR2 имеет общую структурную гомологию с STRA6 29,30,31. Предполагается, что RBP4 связывается с остатками S294, Y295 и L296 на RBPR2, аминокислот-связывающем домене, частично консервативном между RBPR2 и STRA6, а также 29,30,31. В этих исследованиях было установлено, что мембранные рецепторы витамина А, такие как STRA6 и RBPR2, которые содержат один или несколько внеклеточных связывающих остатков/доменов, взаимодействуют с циркуляторным RBP4-ROL. Таким образом, мембранные рецепторы играют важную роль в связывании рецептора с циркуляторным RBP4 для интернализации ROL в ткани-мишени, такие как печень и глаз.

В первой части этого исследования мы использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR) для изучения взаимодействия двух мембранных рецепторов витамина А (RBPR2 и STRA6) с их физиологическим лигандом RBP431. Аффинность связывания и кинетику ассоциации/диссоциации белка к комплексам лигандов можно измерить в режиме реального времени с помощью SPR. Эта методология была направлена на получение критически важной кинетической, структурной и биохимической информации о RBP4-связывающих мотивах в RBPR2 и STRA6, которые имеют решающее значение для понимания патологических состояний дефицита витамина А 31,32. Как упоминалось выше, циркуляторный ROL интернализуется в RPE через STRA6 для генерации хромофора 11-цисного сетчатки, который связывается с опсином для генерации ретинилиденового белка, родопсина, в фоторецепторах33. Мы использовали методологии спектрофотометрии для количественной оценки GPCR-опсина и его лиганда 11-цис-комплекса сетчатки в лизатах сетчатки мышей, что имеет решающее значение для понимания механизмов восстановленного белка ретинилидена, родопсина, при пигментном ретините или врожденном амаврозе Лебера при патологических состояниях глаза34. В целом, эти протоколы могут быть применены для изучения in vitro физиологических последствий мутантных RBP4, STRA6 или RBPR2 во влиянии на системный и глазной гомеостаз витамина А или влияния мутантного родопсина или белков ретиноидного цикла на зрительную функцию35,36.

протокол

1. Методология поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

  1. Приготовление и очистка мышиного белка RBP4
    1. Разработка праймеров для генерации полноразмерной кДНК мыши RBP4 (msRBP4) (референсная последовательность NCBI: NM_001159487.1). Клонировать кДНК msRBP4 в вектор экспрессии pET28a His-tag Kanamycin-resistant и экспрессировать в клетках BL-21 DE3 (Таблица материалов).
    2. Компетентные клетки BL-21 DE3 (в соответствии с протоколом производителя) трансформируют с помощью лигированного вектораRBP4-pET28a и затем наносят на агаровые планшеты бульона Лурии-Бертани (LB), содержащие канамицин 50 мкг/мл30,37. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C в инкубаторе и проведите скрининг на положительные колонии на следующий день.
    3. Выберите одну колонию и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в 5 мл бульона, содержащего канамицин 50 мкг/мл.
    4. Для вторичной культуры в 500 мл LB бульона, содержащего канамицин 50 мкг/мл, используют 1% объем первичной культуры (с шага 1.1.3.) и инкубируют при 37 °C в течение 3-4 ч; Проверьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра. В идеале, если значение OD составляет от 0,6 до 1, следует приступать к стимуляции белка с помощью 0,5 мМ IPTG при 24 °C в течение ночи.
    5. Используйте несколько концентраций IPTG в диапазоне 0,1–1 мМ и 16–30 °C для оптимизации экспрессии и стабильности msRBP4.
    6. Центрифугируйте культуру (начиная с шага 1.1.5.) при 16 000 × г в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и держите гранулу на льду.
    7. Гомогенизируйте гранулу буфером для лизиса (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% глицерина, 0,5 мМ PMSF и ингибиторами протеазы [pH 8,0]). Ультразвуком обрабатывайте лизат в течение 15 с ON и 30 s OFF с помощью гомогенизатора с выходной мощностью 250 Вт и выходной частотой 40-50% 20 кГц. Повторите 5 раз.
    8. Удалите остатки клеток и нелизированные клетки центрифугированием при 16 000 × г в течение 20 минут. Пропустите надосадочную жидкость лизата через буферно-уравновешенную колонку никелевого NTA.
    9. Промыть колонку буфером для лизиса (с шага 1.1.8), содержащим 30 мМ имидазола.
    10. Во фракциях элюируют связанный белок msRBP4 с помощью буфера, содержащего 250 мМ имидазола. Запустите элюированные фракции и визуально контролируйте количество белка с помощью 12% полиакриламидного геля SDS, окрашенного Coomassie Brilliant Blue R-250 в растворе метанол:вода:уксусная кислота (45:45:10) и удалите пятна раствором без окрашивания Coomassie метанол:вода:уксусная кислота (45:45:10).
    11. Объедините неиспользованные фракции и диализуйте объединенные фракции с помощью диализной кассеты 10K емкостью 10 кДа MWCO.
    12. Оцените качество диализованной фракции на 12% геле SDS-PAGE и количественно определите концентрацию белка.
      Примечание: В анализе SPR использовался белок Apo-RBP4. Для получения голо-RBP4 (RBP4-ретинола) см. подробные протоколы, опубликованные в других местах36,37.
  2. Первичная валидация пептидов RBPR2 и STRA6 с RBP4 на структуру и взаимодействие с помощью флуоресцентного анализа триптофана и спектроскопии кругового дихроизма (CD)
    1. Флуоресцентный анализ триптофана
      1. Используйте онлайн-инструмент для анализа состава белка (https://web.expasy.org/protparam/) и вставьте аминокислотную последовательность в однобуквенный код, чтобы оценить структурный состав рекомбинантного белка RBP4 и отдельных пептидов RBPR2 и STRA6, чтобы определить остатки аминокислот триптофана в отдельных пептидах и белке (Таблица материалов).
      2. Нажмите кнопку «Вычислить параметры» и оцените аминокислотный состав для остатков триптофана (Trp).
        Примечание: Остатки триптофана должны присутствовать в отдельных анализируемых пептидах или белках.
      3. Отдельные пептиды RBPR2 и STRA6 разбавляют в различных микромолярных концентрациях и инкубируют по отдельности с 3 мкг мс RBP4в 96-луночном планшете при комнатной температуре в течение 5 минут. Возбуждайте микс на длине волны 290 нм и сканируйте излучение в диапазоне от 300 нм до 400 нм.
      4. Нормализуйте данные с помощью Blank (только буфер, без пептида и белка) и условия контроля пептида (без белка) и построите график.
        Примечание: Увеличение флуоресценции триптофана при воздействии низкой или высокой концентрации пептидов предполагает положительное взаимодействие между двумя отдельными пептидами и белком RBP4.
    2. Спектроскопия кругового дихроизма (CD)
      1. Разбавьте отдельные пептиды и рекомбинантный белок RBP4 в 1x PBS буфере, pH 7,0. Используйте различные концентрации пептидов RBPR2 и STRA6 и белка RBP4 от 0,1 до 10 мкг/мл для проверки качества, как описано ниже.
      2. Добавьте отдельные разведенные пептиды и белок в кювету длиной 0,1 см и измерьте абсорбцию/эллиптичность CD с помощью CD-спектрофотометра (195-250 нм). Используйте приведенную ниже формулу для расчета средней эллиптичности остатков (θ).
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S представляет сигнал CD в mθ; mRw представляет собой среднюю массу остатка; c представляет собой концентрацию белка в мг/мл; а l представляет длину пути в см.
      3. Рассчитайте процентное изменение структуры молекулы с помощью анализа вторичной структуры BeStSel для прогнозирования сворачивания белка с помощью CD-спектроскопии (https://bestsel.elte.hu).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичная структура указывает на правильную сворачиваемость и сохранение подтверждений, имеющих решающее значение для исследования взаимодействия и результата взаимодействий. Изучите предсказанную структуру домена и перейдите к дальнейшему исследованию взаимодействия.

2. Анализ SPR для определения аффинности связывания и кинетических параметров мембранных рецепторов витамина А (RBPR2 и STRA6) с их физиологическим лигандом RBP4

  1. Для иммобилизации RBP4 на настройке поверхности чипа CM5 мы используем чип датчика SPR, который несет удлиненный до размера ~100 нм карбоксиметилдекстран, ковалентно прикрепленный к золотой поверхности. В присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS) превращает карбоксильные группы на поверхности чипа в эфиры N-гидроксисукцинимида, которые спонтанно реагируют с аминогруппами аминокислот и белков, заставляя лиганд ковалентно связываться с поверхностью чипа (Таблица материалов).
    1. Иммобилизуйте очищенный белок msRBP4 на сенсорном чипе (рис. 1 и рис. 2). В меню «Выполнить» выберите «Мастер» и перейдите к опции иммобилизации. Разведите лиганд (белок msRBP4, полученный на стадии 1.1) в иммобилизационном буфере (10 мМ буфера ацетата натрия, pH 5,0) до 10 мкг/мл (4 мкл лиганда + 396 мкл буфера) и аликвотируйте связывающие реагенты во флаконах. Откройте окно мастера настройки иммобилизации из программного управления, выберите CM5 Chip и опцию Immobilize flow cell 2 and target level 1,200 Response Unit (RU) для достижения Rmax 30 RU в кинетическом исследовании и растворе Wash: Ethanolamine. Введите имя RBP4 и нажмите Далее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: Диалоговое окно «Подготовка системы » для параметра «Подготовка к запуску » не требуется, если ранее была выполнена грунтовка с помощью буфера PBST (фосфатно-буферный солевой раствор с 0,05% раствором моющего средства Tween 20).
    2. В диалоговом окне Положение стойки нажмите кнопку Извлечь стойку. Возьмите штатив и поместите флаконы с назначенными объемами для каждого реагента: 156 мкл msRBP4, 177 μл этаноламина, 89 μL EDC, 89 μL NHS и пустой флакон. Вставьте штатив с флаконами с образцами и нажмите OK и Next.
    3. В диалоговом окне "Подготовка протокола выполнения " нажмите кнопку "Пуск" и "Сохранить".
  2. Установка для кинетического анализа пептидов RBPR2 и STRA6
    1. Последовательно разбавляют мышиные пептиды RBPR2, мутантные RBPR2 и STRA6 (химически синтезированные ранее31 и перечисленные в таблице материалов) в рабочем буфере в диапазоне 0,8-26,6 мкМ.
    2. Откройте управляющее программное обеспечение и выберите мастер Kinetics/Affinity. Нажмите «Файл» | Откройте шаблон и выберите Kinetics/Affinity. Введите в диалоговое окно последовательности впрыска путь потока 2-1 (активная ячейка потока 2 и ячейка потока 1 как эталонная), проверьте тип микросхемы CM5 и нажмите кнопку Далее. В диалоговом окне настройки установите флажок Запускать циклы запуска, введите Решение: буфер и циклы: и нажмите Далее.
    3. В диалоговом окне параметров впрыска введите значения параметров образца : время контакта: 120 с, расход 30 мкл/мин, время диссоциации 300 с; для параметров регенерации : введите название раствора для регенерации: Glycine-HCl (pH 2,5), время контакта: 30 с, расход: 30 мкл/мин и нажмите Далее.
    4. В диалоговом окне образцов введите название пептидов, молекулярную массу и концентрацию, а затем нажмите кнопку «Далее». В диалоговом окне «Положение штатива» назначьте разведенные пептиды в виде отдельных образцов объемом ~120 мкл различных концентраций от 1 до 100 мкМ и ~230 мкл буфера, ~120 мкл буфера и ~1 000 мкл глицина с pH 2,5 к позициям на штативе. Нажмите «Извлечь штатив» и вставьте все флаконы. Нажмите кнопку Next и в диалоговом окне Prepare Run Protocol нажмите кнопку Start, введите имя файла и нажмите кнопку Save (рисунок 2).
    5. В программном обеспечении щелкните меню «Пуск » и выберите «Оценка». Откройте файл в программном обеспечении и в выпадающем меню выберите Fc2-1 для анализа сенсорной граммы Reference cell Blank-subtracted Active на наличие фаз ассоциации и диссоциации пептидов msRBP4 и мутантных msRBPR2 и msSTRA6.
    6. Нажмите на выпадающую кнопку Kinetics/Affinity и выберите Surface bound; чтобы открыть диалоговое окно «Выбрать кривые », отметьте галочкой столбец «Включить» в таблице и нажмите «Далее». Выберите диалоговое окно «Данные », чтобы отобразить пустые и вычтенные сенсорные граммы; нажмите Кинетика и сходство, оставьте параметры по умолчанию, а затем нажмите Опция подгонки для подгонки кривой. Проверьте вкладку Отчет на наличие константы равновесной диссоциации Kd и Ka или Kпо скорости ассоциации и скорости диссоциации Kd или Koff . Сохраните сенсорную диаграмму данных Kinetics в формате с разделителями.txt табуляторами и используйте значения для построения графиков (рис. 3).
    7. Чтобы определить константу кинетики сродства Kd (концентрация лиганда, которая связывается с половиной рецепторов в равновесии), скопируйте и вставьте столбцы данных в файл формата .txt, сгенерированный на основе графика Evaluation to XY, используемого в программном обеспечении. Нажмите кнопку Анализ и нелинейная регрессия (аппроксимация кривой), проверьте столбец данных и нажмите кнопку ОК. В диалоговом окне параметров нажмите Насыщенность привязки и Модель подгонки привязки для одного сайта с формулой:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Где Bmax — максимальное количество сайтов связывания (единица ответа), X — концентрация пептидов, а Y — единица связывания (единица ответа) (рис. 3).

3. Методология спектрофотометрии для количественного определения комплекса белка сетчатки GPCR-11-цис (ретинилиденбелка родопсина) в лизатах сетчатки

  1. Транспортировка заранее определенной группы мышей, состоящей из взрослых мышей WT-C57BL/6J, в темную комнату.
  2. В темноте адаптируйте мышей на ночь в течение 12-16 часов, а при красном свете поместите мышь в камеру эвтаназии и откройте газовый клапан CO2 на регуляторе до 5 л/мин на ~5 минут. Обеспечить смерть путем надавливания на отведенную назад шею и хвост (шейный вывих).
  3. Энуклеируйте глазные шарики и гомогенизируйте глаза в ледяном буфере, содержащем 20 мМ бис-трис пропана (1,3-бис (трис(гидроксиметил)метиламино)пропана; BTP) pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и с ингибитором протеазы (Таблица материалов).
  4. Центрифугируйте гомогенат в течение 15 мин при 16000 x g при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, содержащую водорастворимые цитозольные белки. Ресуспендировать и солюбилизировать гранулированные мембранные и мембранные белки в буфере, содержащем 20 мМ n-додецил-β-d-мальтозид (ДДМ), 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и с ингибитором протеазы в течение 1 ч при 4 °С на вращающейся платформе.
  5. Центрифугирование резолюбилизированной мембранной фракции в течение 1 ч при 16000 x g, 4 °C. Смешайте надосадочную жидкость с 30 мкл гранул антител Rho 1D4 и инкубируйте в течение 1 ч при 4 °C на вращающейся платформе.
  6. С помощью магнитной подставки отделите пулдаун с помощью шариков, выбросьте надосадочную жидкость и промойте шарики буфером 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 500 мМ NaCl и 2 мМ ДДМ.
  7. Разбавляют белок родопсина путем инкубации в течение 5-10 мин при комнатной температуре с буфером 20 мМ бис-трис пропана (BTP) pH 7,4, 100 мМ NaCl, 2 мМ DDM, содержащего 0,2 мг/мл пептида 1D4 (-TETSQVAPA) (рис. 4 и рис. 5).
  8. Проанализируйте элюирование на поглощение от 200 нм до 800 нм с помощью прямоугольной, субмикромикро, кварцевой, апертуры 2 мм, длины пути 10 мм, кюветы 50 мкл в условиях быстрого сканирования с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только высококачественные кюветы из кварца (Рисунок 4).
  9. Чтобы проверить и определить качество, проверьте и подвергните элюирование воздействию яркого света в течение 1 минуты, затем повторите шаг 3.8.
  10. Вычтите абсорбцию Бланка и рассчитайте отношение анализируемых спектров поглощения с абсорбцией при 500 нм для 11-цисцис-связанного опсина сетчатки, 380 нм для полностью транс связанного с ретиналью опсина и 280 нм для безлигандного белка Apo-Opsin (рис. 6). Свободный опсин без лиганда ретиналь дает базовую абсорбцию при длине волны 500 нм.
  11. Чтобы количественно определить концентрацию родопсина, используйте закон Бера-Ламберта:
    А=ε· C·l или C=A/ε·l
    Где A — поглощение, ε коэффициент молярного угасания (родопсин ε500 = 40 600 M−1 см−1 для свободного Apo Opsin ε280 = 81 200 M−1 см−1), C — концентрация, а длина пути l — длинна.
  12. Для количественного определения лигандид-опсина в процентах используйте соотношение A280/A500.
  13. Построим график спектров поглощения с вычитанием из пустого поля и вычислим значение свободного опсина32.
  14. Рассчитайте концентрацию родопсина с использованием коэффициента экстинкции ε500 = 40600 М−1 см−1. Концентрация безлигандного опсина рассчитывается с помощью закона Бера-Ламберта с использованием коэффициента экстинкции ε280 = 81 200 М−1 см−1.

Результаты

Описаны количественные методы изучения белково-лигандных взаимодействий мембранных рецепторов витамина А и фоторецептора опсина с соответствующими физиологическими лигандами. Рекомбинантный мышиный RBP4 должен экспрессироваться в E. coli и очищенном белке, испол...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Методология SPR
Моделирование in silico и анализ докинга: Для исследования стыковки29,31 следует использовать предсказанную структуру RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) и STRA6, а также известную с...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования; при сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи или при принятии решения о публикации результатов.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Беату Ястшебску, доктора философии (факультет фармакологии, Университет Кейс Вестерн Резерв, штат Огайо) за ее советы по протоколу абсорбции родопсина. Эта работа была поддержана грантом NIH-NEI (EY030889 и 3R01EY030889-03S1) и, частично, стартовыми фондами Университета Миннесоты для G.P.L.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

Ссылки

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676 (2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229 (2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236 (2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371 (2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099 (2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657 (2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293 (2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169 (2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

212RBPR2STRA6RBP4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены