Méthodologie d’étude des interactions des récepteurs membranaires de la vitamine A et de la protéine opsine avec leurs ligands dans la génération de la protéine rétinylidène

Résumé

Ici, nous décrivons deux méthodes quantitatives pour étudier les interactions protéine-ligand des récepteurs membranaires de la vitamine A et de l’opsine photorécepteur avec leurs ligands physiologiques respectifs.

Résumé

La distribution de la vitamine A/rétinol tout-trans (ROL) alimentaire dans tout le corps est essentielle pour maintenir la fonction rétinoïde dans les tissus périphériques et générer la protéine rétinylidène pour la fonction visuelle. RBP4-ROL est le complexe de ROL avec la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4), qui est présente dans le sang. Deux récepteurs membranaires, le récepteur 2 de la protéine de liaison au rétinol 4 (RBPR2) dans le foie et le récepteur STimilé par l’acide rétinoïque 6 (STRA6) dans l’œil, se lient à RBP4 circulatoire et ce mécanisme est essentiel à l’internalisation du ROL dans les cellules. L’établissement de méthodes pour étudier la cinétique récepteur-ligand est essentiel pour comprendre la fonction physiologique des récepteurs de la vitamine A pour l’homéostasie rétinoïde. À l’aide de tests de résonance plasmonique de surface (SPR), nous pouvons analyser les affinités de liaison et les paramètres cinétiques des récepteurs membranaires de la vitamine A avec son ligand physiologique RBP4.

Ces méthodologies peuvent révéler de nouvelles informations structurales et biochimiques sur les motifs de liaison à RBP4 dans RBPR2 et STRA6, qui sont essentiels pour comprendre les états pathologiques de carence en vitamine A. Dans l’œil, le ROL internalisé est métabolisé en 11-cis rétinien, le chromophore visuel qui se lie à l’opsine dans les photorécepteurs pour former la protéine rétinylidène, la rhodopsine. L’absorbance de la lumière provoque l’isomérisation cis-trans de la rétine 11-cis, induisant des changements conformationnels de la rhodopsine et l’activation ultérieure de la cascade de phototransduction. Une diminution des concentrations sériques et oculaires peut avoir un impact sur la formation de la protéine rétinylidène, ce qui peut entraîner une mauvaise localisation de la rhodopsine, une accumulation d’apoprotéine opsine, une cécité nocturne et une dégénérescence du segment externe des photorécepteurs, entraînant une rétinite pigmentaire ou une amaurose congénitale de Leber.

Par conséquent, les méthodologies spectrophotométriques permettant de quantifier le complexe rétinien opsine-11-cis du récepteur couplé aux protéines G dans la rétine sont essentielles pour comprendre les mécanismes de dégénérescence des cellules rétiniennes dans les états pathologiques mentionnés ci-dessus. Grâce à ces méthodologies complètes, les chercheurs seront en mesure de mieux évaluer l’apport alimentaire en vitamine A dans le maintien de l’homéostasie rétinoïde systémique et oculaire, qui est essentielle à la génération et au maintien des concentrations de protéines de rétinylidène dans les photorécepteurs, qui est essentielle au maintien de la fonction visuelle chez les humains.

Introduction

La vitamine A/rétinol tout-trans/ROL obtenue par voie alimentaire est un composant important jouant un rôle dans la fonction visuelle ^1,2. Le chromophore 11-cis rétinal, un métabolite de la vitamine A alimentaire, se lie à l’opsine du récepteur couplé aux protéines G (RCPG) pour générer la protéine rétinylidène, la rhodopsine, dans les photorécepteurs. Lorsque la lumière tombe sur l’œil, la configuration de la rhodopsine subit un changement fondamental via la conversion de sa composante 11-cis-rétinienne en tout-trans-rétinienne. Ce changeme....

Protocole

1. Méthodologie de la résonance plasmonique de surface (SPR)

1. Préparation et purification de la protéine RBP4 de souris
   1. Concevez des amorces pour générer de l’ADNc RBP4 (msRBP4) de souris pleine longueur (séquence de référence NCBI : NM_001159487.1). Clonez l’ADNc msRBP4 dans un vecteur d’expression résistant à la kanamycine pET28a His-tag et exprimez-le dans les cellules BL-21 DE3 (Table des matériaux).
   2. Transformer les cellules compétentes BL-21 DE3 (selon le protocole du fabricant) avec le vecteur msRBP4-pET28a ligaturé puis déposer sur des plaqu....

Discussion

Étapes critiques du protocole
Méthodologie SPR
Modélisation in silico et analyse d’amarrage : La structure prédite de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) et STRA6, ainsi que la structure connue de la base de données PDB msRBP4 (RSCB PDB ID : 2wqa), doivent être utilisées pour l’étude d’amarrage^29,31. De plus, des méthodes in vitro (cult.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms