Méthodologie d’étude des interactions des récepteurs membranaires de la vitamine A et de la protéine opsine avec leurs ligands dans la génération de la protéine rétinylidène

Résumé

Ici, nous décrivons deux méthodes quantitatives pour étudier les interactions protéine-ligand des récepteurs membranaires de la vitamine A et de l’opsine photorécepteur avec leurs ligands physiologiques respectifs.

Résumé

La distribution de la vitamine A/rétinol tout-trans (ROL) alimentaire dans tout le corps est essentielle pour maintenir la fonction rétinoïde dans les tissus périphériques et générer la protéine rétinylidène pour la fonction visuelle. RBP4-ROL est le complexe de ROL avec la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4), qui est présente dans le sang. Deux récepteurs membranaires, le récepteur 2 de la protéine de liaison au rétinol 4 (RBPR2) dans le foie et le récepteur STimilé par l’acide rétinoïque 6 (STRA6) dans l’œil, se lient à RBP4 circulatoire et ce mécanisme est essentiel à l’internalisation du ROL dans les cellules. L’établissement de méthodes pour étudier la cinétique récepteur-ligand est essentiel pour comprendre la fonction physiologique des récepteurs de la vitamine A pour l’homéostasie rétinoïde. À l’aide de tests de résonance plasmonique de surface (SPR), nous pouvons analyser les affinités de liaison et les paramètres cinétiques des récepteurs membranaires de la vitamine A avec son ligand physiologique RBP4.

Ces méthodologies peuvent révéler de nouvelles informations structurales et biochimiques sur les motifs de liaison à RBP4 dans RBPR2 et STRA6, qui sont essentiels pour comprendre les états pathologiques de carence en vitamine A. Dans l’œil, le ROL internalisé est métabolisé en 11-cis rétinien, le chromophore visuel qui se lie à l’opsine dans les photorécepteurs pour former la protéine rétinylidène, la rhodopsine. L’absorbance de la lumière provoque l’isomérisation cis-trans de la rétine 11-cis, induisant des changements conformationnels de la rhodopsine et l’activation ultérieure de la cascade de phototransduction. Une diminution des concentrations sériques et oculaires peut avoir un impact sur la formation de la protéine rétinylidène, ce qui peut entraîner une mauvaise localisation de la rhodopsine, une accumulation d’apoprotéine opsine, une cécité nocturne et une dégénérescence du segment externe des photorécepteurs, entraînant une rétinite pigmentaire ou une amaurose congénitale de Leber.

Par conséquent, les méthodologies spectrophotométriques permettant de quantifier le complexe rétinien opsine-11-cis du récepteur couplé aux protéines G dans la rétine sont essentielles pour comprendre les mécanismes de dégénérescence des cellules rétiniennes dans les états pathologiques mentionnés ci-dessus. Grâce à ces méthodologies complètes, les chercheurs seront en mesure de mieux évaluer l’apport alimentaire en vitamine A dans le maintien de l’homéostasie rétinoïde systémique et oculaire, qui est essentielle à la génération et au maintien des concentrations de protéines de rétinylidène dans les photorécepteurs, qui est essentielle au maintien de la fonction visuelle chez les humains.

Introduction

La vitamine A/rétinol tout-trans/ROL obtenue par voie alimentaire est un composant important jouant un rôle dans la fonction visuelle ^1,2. Le chromophore 11-cis rétinal, un métabolite de la vitamine A alimentaire, se lie à l’opsine du récepteur couplé aux protéines G (RCPG) pour générer la protéine rétinylidène, la rhodopsine, dans les photorécepteurs. Lorsque la lumière tombe sur l’œil, la configuration de la rhodopsine subit un changement fondamental via la conversion de sa composante 11-cis-rétinienne en tout-trans-rétinienne. Ce changement de configuration déclenche une cascade de phototransduction dans les photorécepteurs à bâtonnets, convertissant la lumière en un signal électrique, qui est transmis au cortex visuel du cerveau via le nerf optique 3,4,5,6,7,8,9,10 . Une diminution des concentrations sériques et oculaires peut avoir un impact sur la formation de la protéine rétinylidène, ce qui provoque à son tour une mauvaise localisation de l’opsine, une accumulation d’opsine apoprotéique, une cécité nocturne et une dégénérescence des photorécepteurs OS, conduisant à une rétinite pigmentaire ou à une amaurose congénitale de Leber, qui peut provoquer la cécité ^3,10.

Le rétinol tout-trans est la forme de transport fondamentale de la vitamine A alimentaire, et c’est la source à partir de laquelle tous les rétinoïdes fonctionnels et les métabolites de la vitamine A alimentaire sont dérivés. Le foie sert d’organe principal pour le stockage de la vitamine A alimentaire. Le rétinol hépatique est transporté par le sérum sous forme de complexe avec la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4). RBP4, principalement exprimé dans le foie, forme un holo-complexe avec le substrat du rétinol et la transthyrétine (TTR), qui entre dans la circulation 11,12,13,14,15,16,17. Dans les années 1970, l’apparition d’un récepteur de surface cellulaire pour RBP4 a conduit à l’hypothèse que les protéines de transport membranaire aident au transport des rétinoïdes à l’intérieur et à l’extérieur des cellules. Le récepteur de surface cellulaire du rétinol lié à RBP4 (RBP4-ROL) a été identifié comme étant STimulé par l’acide rétinoïque 6 rétinol (STRA6) dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de l’œil. STRA6 se lie au complexe holo-RBP4 circulatoire et transporte le rétinol lié à RBP4 à travers l’EPR pour être utilisé par les photorécepteurs^18,19. Les mutations de STRA6 peuvent entraîner une myriade de maladies et de phénotypes associés à des concentrations oculaires réduites de ROL. Les mutations STRA6 au cours du développement peuvent entraîner une anophtalmie, une microphtalmie et d’autres symptômes non oculaires qui se chevauchent avec les phénotypes associés au syndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 est exprimé dans différents organes et tissus, tels que l’EPR dans l’œil, mais pas dans tous les tissus^26,27. Bien que le principal site de stockage des rétinoïdes soit le foie, STRA6 n’est pas exprimé dans le foie.

Alapatt et ses collègues ont découvert que le récepteur 2 de la protéine de liaison au rétinol 4 (RBPR2) liait RBP4 avec une grande affinité et était responsable de l’absorption du rétinol lié à RBP4 dans le foie, similaire à STRA6 dans le RPE²⁸. RBPR2 a été signalé comme partageant une homologie structurale avec STRA6 29,30,31. Il est proposé que RBP4 se lie aux résidus S294, Y295 et L296 sur RBPR2, un domaine de liaison aux acides aminés partiellement conservé entre RBPR2 et STRA6 ainsi que 29,30,31. D’après ces études, il est proposé que les récepteurs membranaires de la vitamine A tels que STRA6 et RBPR2, qui contiennent un ou plusieurs résidus/domaines de liaison extracellulaires, interagissent avec RBP4-ROL circulatoire. Les récepteurs membranaires jouent donc un rôle important dans la liaison des récepteurs à RBP4 circulatoire pour l’internalisation de ROL dans les tissus cibles, tels que le foie et l’œil.

Dans la première partie de cette étude, nous avons utilisé la résonance plasmonique de surface (SPR) pour étudier l’interaction de deux récepteurs membranaires de la vitamine A (RBPR2 et STRA6) avec leur ligand physiologique RBP4³¹. Les affinités de liaison et la cinétique d’association/dissociation des complexes protéiques et ligands peuvent être mesurées en temps réel à l’aide de la SPR. Cette méthodologie visait à fournir des informations cinétiques, structurelles et biochimiques critiques sur les motifs de liaison à RBP4 dans RBPR2 et STRA6, qui sont essentiels pour comprendre les états pathologiques de carence en vitamine A^31,32. Comme mentionné ci-dessus, le ROL circulatoire est internalisé dans l’EPR via STRA6 pour générer le chromophore 11-cis rétinal, qui se lie à l’opsine pour générer la protéine rétinylidène, la rhodopsine, dans les photorécepteurs³³. Nous avons utilisé des méthodologies de spectrophotométrie pour quantifier le GPCR-opsine et son ligand 11-cis complexe rétinien dans les lysats rétiniens murins, ce qui est essentiel pour comprendre les mécanismes de la protéine rétinylidène réduite, la rhodopsine, dans la rétinite pigmentaire ou l’amaurose congénitale de Leber³⁴. En général, ces protocoles peuvent être appliqués pour étudier in vitro les conséquences physiologiques des mutants RBP4, STRA6 ou RBPR2 dans l’influence de l’homéostasie systémique et oculaire de la vitamine A ou l’impact des protéines mutantes du cycle de la rhodopsine ou des rétinoïdes sur la fonction visuelle^35,36.

Protocole

1. Méthodologie de la résonance plasmonique de surface (SPR)

1. Préparation et purification de la protéine RBP4 de souris
   1. Concevez des amorces pour générer de l’ADNc RBP4 (msRBP4) de souris pleine longueur (séquence de référence NCBI : NM_001159487.1). Clonez l’ADNc msRBP4 dans un vecteur d’expression résistant à la kanamycine pET28a His-tag et exprimez-le dans les cellules BL-21 DE3 (Table des matériaux).
   2. Transformer les cellules compétentes BL-21 DE3 (selon le protocole du fabricant) avec le vecteur msRBP4-pET28a ligaturé puis déposer sur des plaques de gélose au bouillon Luria-Bertani (LB) contenant de la Kanamycine 50 μg/mL^30,37. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur et dépister les colonies positives le lendemain.
   3. Cueillir une seule colonie et incuber toute la nuit à 37 °C dans 5 mL de bouillon LB contenant 50 μg/mL de kanamycine.
   4. Pour la culture secondaire dans 500 mL de bouillon LB contenant 50 μg/mL de Kanamycine, utiliser 1 % du volume de la culture primaire (à partir de l’étape 1.1.3) et incuber à 37 °C pendant 3 à 4 h ; Vérifiez la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre. Idéalement, si la valeur de la DO est comprise entre 0,6 et 1, il faut induire l’expression de la protéine avec 0,5 mM d’IPTG à 24 °C pendant la nuit.
   5. Utilisez plusieurs concentrations IPTG de 0,1 à 1 mM et une plage de température de 16 à 30 °C pour optimiser l’expression et la stabilité de msRBP4.
   6. Centrifugez la culture (à partir de l’étape 1.1.5) à 16 000 × g pendant 10 min, jetez le surnageant et conservez la pastille sur de la glace.
   7. Homogénéiser la pastille avec un tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1 % (v/v) de Triton X-100, 10 % de glycérol, 0,5 mM de PMSF et inhibiteurs de protéase [pH 8,0]). Sonicez le lysat pendant un cycle de 15 secondes et 30 secondes d’arrêt à l’aide d’un homogénéisateur d’une puissance de 250 watts et d’une fréquence de sortie de 40 à 50 % à 20 kHz. Répétez l’opération 5 fois.
   8. Retirer les débris cellulaires et les cellules non lysées par centrifugation à 16 000 × g pendant 20 min. Faites passer le surnageant du lysat à travers une colonne de nickel NTA équilibrée par un tampon.
   9. Laver la colonne avec un tampon de lyse (à partir de l’étape 1.1.8) contenant 30 mM d’imidazole.
   10. En fractions, éluer la protéine RBP4liée à ms à l’aide d’un tampon contenant 250 mM d’imidazole. Analysez les fractions éluées et surveillez visuellement la quantité de protéines avec un gel de polyacrylamide SDS à 12 %, coloré au Coomassie Brilliant Blue R-250 dans une solution méthanol :eau :acide acétique (45:45:10) et décolorez avec une solution sans colorant Coomassie méthanol :eau :acide acétique (45:45:10).
   11. Regrouper les fractions inutilisées et dialyser les fractions regroupées à l’aide d’une cassette de dialyse 10K de 10 kDa MWCO.
   12. Évaluer la qualité de la fraction dialysée sur un gel SDS-PAGE à 12 % et quantifier la concentration en protéines.
       REMARQUE : La protéine Apo-RBP4 a été utilisée dans l’analyse SPR. Pour la génération de l’holo-RBP4 (RBP4-rétinol), reportez-vous aux protocoles détaillés publiés ailleurs^36,37.
2. Validation initiale de la structure et de l’interaction des peptides RBPR2 et STRA6 avec RBP4 par dosage de fluorescence du tryptophane et spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
   1. Essai de fluorescence du tryptophane
      1. Utilisez l’outil d’analyse de la composition des protéines en ligne (https://web.expasy.org/protparam/) et collez la séquence d’acides aminés dans un code d’une lettre pour évaluer la composition structurelle de la protéine recombinante RBP4 et des peptides individuels de RBPR2 et STRA6 afin de déterminer les résidus d’acides aminés tryptophane dans les peptides et les protéines individuels (Tableau des matériaux).
      2. Cliquez sur le bouton de calcul des paramètres et évaluez la composition en acides aminés pour les résidus de tryptophane (Trp).
         REMARQUE : Des résidus de tryptophane doivent être présents dans les peptides ou les protéines analysés.
      3. Diluer les peptides RBPR2 et STRA6 individuels à différentes concentrations micromolaires et incuber individuellement avec 3 μg msde RBP4 dans une plaque à 96 puits à température ambiante pendant 5 min. Excité le mélange à 290 nm et balayage de l’émission de 300 nm à 400 nm de longueur d’onde.
      4. Normalisez les données avec le blanc (tampon uniquement, pas de peptide et pas de protéine) et la condition de contrôle du peptide (pas de protéine) et le graphique.
         REMARQUE : L’augmentation de la fluorescence du tryptophane lors de l’exposition à une concentration peptidique faible à élevée suggère une interaction positive entre les deux peptides individuels et la protéine RBP4.
   2. Spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
      1. Diluer les peptides individuels et la protéine RBP4 recombinante dans 1 tampon PBS, pH 7,0. Pour un contrôle de qualité, veuillez utiliser diverses concentrations de peptides RBPR2 et STRA6 et de protéine RBP4 de 0,1 à 10 μg/mL, comme décrit ci-dessous.
      2. Ajouter des peptides dilués et des protéines individuels dans une cuvette de 0,1 cm de longueur de trajet et mesurer l’absorbance/ellipticité du CD à l’aide d’un spectrophotomètre CD (195-250 nm). Utilisez la formule ci-dessous pour calculer l’ellipticité moyenne du résidu (θ).
         [v] = (S × mRw)/(10cl)
         S représente le signal CD en mθ ; mRw représente la masse moyenne du résidu ; c représente la concentration de la protéine en mg/mL ; et l représente la longueur du chemin en cm.
      3. Calculez le pourcentage de changement de la structure moléculaire à l’aide de l’analyse de la structure secondaire BeStSel pour la prédiction du repliement des protéines par spectroscopie CD (https://bestsel.elte.hu).
         REMARQUE : La structure secondaire indique le pliage correct et les confirmations conservées cruciales pour l’étude des interactions et le résultat des interactions. Inspectez la structure prédite du domaine et poursuivez l’étude d’interaction.

2. Analyse SPR pour déterminer les affinités de liaison et les paramètres cinétiques des récepteurs membranaires de la vitamine A (RBPR2 et STRA6) avec leur ligand physiologique RBP4

1. Pour l’immobilisation de RBP4 sur la configuration de surface de la puce CM5, nous utilisons la puce de capteur SPR, qui porte un linker carboxyméthyl dextran étendu à une taille de ~100 nm fixé de manière covalente sur une surface dorée. En présence de chlorhydrate de carbodiimide (EDC) 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl), le N-hydroxysuccinimide (NHS) convertit les groupes carboxyle à la surface de la puce en esters de N-hydroxysuccinimide, qui réagissent spontanément avec les groupes amines des acides aminés et des protéines, forçant le ligand à se lier de manière covalente à la surface de la puce (Tableau des matériaux).
   1. Immobiliser la protéine msRBP4 purifiée sur la puce du capteur (Figure 1 et Figure 2). Dans le menu Exécuter du logiciel, choisissez l’Assistant et procédez à l’option d’immobilisation . Diluer le ligand (protéine RBP4 msobtenue à l’étape 1.1) dans un tampon d’immobilisation (tampon d’acétate de sodium 10 mM, pH 5,0) à 10 μg/mL (4 μL de ligand + 396 μL de tampon) et aliquote les réactifs de couplage dans les flacons. Ouvrez la fenêtre de l’assistant de configuration de l’immobilisation à partir de la commande logicielle, sélectionnez la puce CM5 et l’option Cellule d’écoulement d’immobilisation 2 et le niveau cible de 1 200 unités de réponse (RU) pour atteindre un Rmax de 30 RU dans l’étude cinétique et la solution de lavage : éthanolamine. Entrez le nom RBP4 et cliquez sur Suivant.
      REMARQUE : Facultatif : La boîte de dialogue Préparations du système pour l’option Amorcer avant l’exécution n’est pas nécessaire si l’amorçage avec un tampon de fonctionnement PBST (solution saline tamponnée au phosphate avec une solution détergente Tween 20 à 0,05 %) a été effectué précédemment.
   2. Dans la boîte de dialogue Position du rack , cliquez sur Éjecter le rack. Prenez le support et placez les flacons avec les volumes attribués à chaque réactif : 156 μL de msRBP4, 177 μL d’éthanolamine, 89 μL d’EDC, 89 μL de NHS et un flacon vide. Insérez le support contenant les flacons d’échantillons et cliquez sur OK et Suivant.
   3. Dans la boîte de dialogue Préparer le protocole d’exécution , cliquez sur Démarrer et enregistrer.
2. Configuration du dosage cinétique des peptides RBPR2 et STRA6
   1. Diluer en série les peptides RBPR2, RBPR2 mutant et STRA6 de souris (synthétisés chimiquement précédemment³¹ et répertoriés dans la table des matériaux) dans un tampon de fonctionnement dans une plage de 0,8 à 26,6 μM.
   2. Ouvrez le logiciel de contrôle et sélectionnez l’assistant Cinétique/Affinité. Cliquez sur Fichier | Ouvrez le modèle et sélectionnez Cinétique/Affinité. Saisissez le chemin d’écoulement 2-1 de la boîte de dialogue de séquence d’injection (cellule d’écoulement 2 active et cellule d’écoulement 1 comme référence), vérifiez le type de puce CM5 et cliquez sur Suivant. Dans la boîte de dialogue de configuration, cochez la case Exécuter les cycles de démarrage, entrez Solution : tampon et cycles : et cliquez sur Suivant.
   3. Dans la boîte de dialogue des paramètres d’injection , entrez les valeurs des paramètres de l’échantillon : temps de contact : 120 s, débit 30 μL/min, temps de dissociation 300 s ; pour les paramètres de régénération : entrez le nom de la solution de régénération : Glycine-HCl (pH 2,5), temps de contact : 30 s, débit : 30 μL/min et cliquez sur Suivant.
   4. Dans la boîte de dialogue des échantillons , entrez le nom des peptides, la masse moléculaire et les concentrations , puis cliquez sur Suivant. Dans la boîte de dialogue Position du rack , attribuez les peptides dilués sous forme d’échantillons individuels de ~120 μL de différentes concentrations de 1 à 100 μM et de ~230 μL de tampon, ~120 μL de tampon et ~1 000 μL de glycine, pH 2,5, aux positions sur le rack. Cliquez sur Eject Rack (Éjecter le rack ) et insérez tous les flacons. Cliquez sur Suivant, puis dans la boîte de dialogue Préparer le protocole d’exécution , cliquez sur Démarrer, entrez un nom de fichier et enregistrez (Figure 2).
   5. Dans le logiciel, cliquez sur le menu Démarrer et sélectionnez Évaluation. Choisissez d’ouvrir le fichier dans le logiciel, et dans le menu déroulant de sélection, choisissez Fc2-1 pour analyser la cellule de référence Blank-subtracted Active sensorgram pour les phases d’association et de dissociation des peptides msRBP4 et mutant msRBPR2 et msSTRA6.
   6. Cliquez sur le bouton déroulant Cinétique/Affinité et choisissez Limité à la surface ; pour ouvrir la boîte de dialogue Sélectionner les courbes , cochez la case Inclure la colonne dans le tableau et cliquez sur Suivant. Sélectionnez la boîte de dialogue Données pour afficher les sensorgrammes soustraits à blanc ; cliquez sur Cinétique et Affinité, conservez les paramètres par défaut, puis cliquez sur l’option Ajuster pour l’ajustement de la courbe. Inspectez l’onglet Rapport pour trouver la constante de dissociation d’équilibre K_d et K_a ou K_sur le taux_{d’association} et K d ou K sur le taux_de dissociation. Enregistrez le sensorgramme de données Kinetics dans .txt format délimité par des tabulations et utilisez les valeurs pour tracer des graphiques (Figure 3).
   7. Pour déterminer la constante de cinétique d’affinité K_d (concentration de ligands qui se lie à la moitié des récepteurs à l’équilibre), copiez et collez les colonnes de données dans le fichier au format .txt généré à partir du graphique Évaluation en XY utilisé dans le logiciel. Cliquez sur Analyser et régression non linéaire (ajustement de courbe), vérifiez la colonne de données, puis cliquez sur OK. Dans la boîte de dialogue des paramètres , cliquez sur Saturation de la liaison et Modèle d’ajustement de liaison spécifique à un site avec la formule suivante :
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Où Bmax est le nombre maximal de sites de liaison (unité de réponse), X est la concentration des peptides et Y est la liaison (unité de réponse) (figure 3).

3. Méthodologie de spectrophotométrie pour quantifier le complexe protéique rétinien cis GPCR-11-(protéine rétinylidène rhodopsine) dans les lysats rétiniens

1. Transportez le groupe de souris prédéterminé composé de souris adultes WT-C57BL/6J dans la chambre noire.
2. Adaptez les souris pendant la nuit pendant 12 à 16 h, et sous lumière rouge, placez la souris dans une chambre d’euthanasie et ouvrez la vanne de gaz CO₂ sur le régulateur à 5 L / min pendant ~5 min. Assurer la mort en appliquant une pression sur le cou et la queue tirée vers l’arrière (luxation cervicale).
3. Énucléer les globes oculaires et homogénéiser les yeux dans un tampon glacé contenant 20 mM de bis-tris propane (1,3-bis (tris(hydroxyméthyl)méthylamino)propane ; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA et avec inhibiteur de protéase (Tableau des matériaux).
4. Centrifuger l’homogénat pendant 15 min à 16000 x g à 4 °C, jeter le surnageant contenant des protéines cytosoliques solubles dans l’eau. Remettre en suspension et solubiliser la membrane granulée et les protéines membranaires dans un tampon contenant 20 mM de n-dodécyl-β-d-maltoside (DDM), 20 mM de bis-tris propane (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA et avec un inhibiteur de protéase pendant 1 h à 4 °C sur une plate-forme rotative.
5. Centrifuger la fraction membranaire résoluble pendant 1 h à 16000 x g, 4 °C. Mélangez le surnageant avec 30 μL de billes d’anticorps Rho 1D4 et incubez pendant 1 h à 4 °C sur une plate-forme rotative.
6. À l’aide d’un support magnétique, séparez le dispositif rétractable à l’aide de billes, jetez le surnageant et lavez les billes avec un tampon de 20 mM de bis-tris propane (BTP) pH 7,4, 500 mM de NaCl et 2 mM de DDM.
7. Eluter la protéine de rhodopsine en l’incubant pendant 5 à 10 minutes à température ambiante avec un tampon de 20 mM de bis-tris propane (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 2 mM de DDM contenant 0,2 mg/mL de peptide 1D4 (-TETSQVAPA) (Figure 4 et Figure 5).
8. Analysez l’absorbance de l’élu de 200 nm à 800 nm à l’aide d’une cuvette rectangulaire, submicro, quartz, de 2 mm, de 10 mm de longueur de trajet, de 50 μL dans un réglage de balayage rapide avec un spectrophotomètre.
   REMARQUE : N’utilisez que des cuvettes en quartz de haute qualité (Figure 4).
9. Pour valider et déterminer la qualité, vérifiez et exposez l’élu à une lumière vive pendant 1 min, puis répétez l’étape 3.8.
10. Soustrayez l’absorbance à blanc et calculez le rapport entre les spectres d’absorbance analysés et l’absorbance à 500 nm pour l’opsine rétinienne 11-cis , à 380 nm pour l’opsine liée à la rétine tout-trans exposée à la lumière et à 280 nm pour la protéine Apo-Opsin sans ligand (Figure 6). L’opsine libre sans ligand rétinal donne une absorbance de base à 500 nm.
11. Pour quantifier la concentration en rhodopsine, utilisez la loi de Beer-Lambert :
    A=ε· C·l ou C=A/ε·l
    Où A est l’absorbance, ε le coefficient d’extinction molaire (rhodopsine ε500 = 40 600 M⁻¹ cm⁻¹ pour l’Apo Opsin libre ε280 = 81 200 M⁻¹ cm⁻¹), C est la concentration et l la longueur du trajet.
12. Pour quantifier l’opsine ligandée en pourcentage, utilisez un rapport A280/A500.
13. Tracez les spectres d’absorbance soustraits à blanc et calculez la valeur d’opsine libre³².
14. Calculez la concentration de rhodopsine en utilisant le coefficient d’extinction ε₅₀₀ = 40600 M⁻¹ cm⁻¹. La concentration d’opsine sans ligand est calculée à l’aide de la loi de Beer-Lambert en utilisant le coefficient d’extinction ε₂₈₀ = 81 200 M⁻¹ cm⁻¹.

Résultats

Des méthodes quantitatives sont décrites pour étudier les interactions protéine-ligand des récepteurs membranaires de la vitamine A et de l’opsine photorécepteur avec leurs ligands physiologiques respectifs. La souris recombinante RBP4 doit être exprimée dans E. coli et la protéine purifiée doit être utilisée comme ligand conjugué sur une puce SPR. Le RBPR2, STRA6 et le mutant S294A RBPR2 « SYL motif RBP4 interagissant avec le site extracellulaire » synthétis...

Discussion

Étapes critiques du protocole
Méthodologie SPR
Modélisation in silico et analyse d’amarrage : La structure prédite de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) et STRA6, ainsi que la structure connue de la base de données PDB msRBP4 (RSCB PDB ID : 2wqa), doivent être utilisées pour l’étude d’amarrage^29,31. De plus, des méthodes in vitro (cult...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms