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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, describimos dos métodos cuantitativos para estudiar las interacciones proteína-ligando de los receptores de membrana de vitamina A y la opsina fotorreceptora con sus respectivos ligandos fisiológicos.

Resumen

La distribución de la vitamina A en la dieta/retinol todo-trans (ROL) en todo el cuerpo es fundamental para mantener la función de los retinoides en los tejidos periféricos y generar la proteína retinilideno para la función visual. RBP4-ROL es el complejo de ROL con la proteína 4 de unión al retinol (RBP4), que está presente en la sangre. Dos receptores de membrana, el receptor 2 de la proteína de unión al retinol 4 (RBPR2) en el hígado y el receptor STimulado por el ácido retinoico 6 retinol (STRA6) en el ojo, se unen a la RBP4 circulatoria y este mecanismo es fundamental para internalizar el ROL en las células. El establecimiento de métodos para investigar la cinética receptor-ligando es esencial para comprender la función fisiológica de los receptores de vitamina A para la homeostasis de los retinoides. Mediante ensayos de resonancia de plasmón de superficie (SPR), podemos analizar las afinidades de unión y los parámetros cinéticos de los receptores de membrana de la vitamina A con su ligando fisiológico RBP4.

Estas metodologías pueden revelar nueva información estructural y bioquímica de los motivos de unión a RBP4 en RBPR2 y STRA6, que son críticos para comprender los estados patológicos de la deficiencia de vitamina A. En el ojo, el ROL internalizado se metaboliza a 11-cis retinal, el cromóforo visual que se une a la opsina en los fotorreceptores para formar la proteína retinilideno, rodopsina. La absorbancia de la luz provoca la isomerización cis-trans del retinal 11-cis, induciendo cambios conformacionales en la rodopsina y la posterior activación de la cascada de fototransducción. La disminución de las concentraciones séricas y el ROL ocular pueden afectar la formación de la proteína retinilideno, que a su vez puede causar una mala localización de la rodopsina, acumulación de opsina de apoproteína, ceguera nocturna y degeneración del segmento externo de los fotorreceptores, lo que conduce a la retinosis pigmentaria o amaurosis congénita de Leber.

Por lo tanto, las metodologías espectrofotométricas para cuantificar el complejo retiniano opsina-11-cis del receptor acoplado a proteína G en la retina son críticas para comprender los mecanismos de degeneración de las células de la retina en los estados patológicos mencionados anteriormente. Con estas metodologías integrales, los investigadores podrán evaluar mejor el suministro de vitamina A en la dieta para mantener la homeostasis sistémica y ocular de los retinoides, que es fundamental para generar y mantener las concentraciones de proteína retinilideno en los fotorreceptores, que es fundamental para mantener la función visual en los seres humanos.

Introducción

La vitamina A / retinol todo-trans / ROL es un componente importante que desempeña un papel en la función visual 1,2. El cromóforo 11-cis retinal, un metabolito de la vitamina A de la dieta, se une a la opsina del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) para generar la proteína retinilideno, rodopsina, en los fotorreceptores. Cuando la luz incide sobre el ojo, la configuración de la rodopsina sufre un cambio fundamental a través de la conversión de su componente 11-cis-retinal en el todo-trans-retinal. Este cambio de configuración desencadena una cascada de fototransducción dentro de los fotorreceptores de los bastones, convirtiendo la luz en una señal eléctrica, que se transmite a la corteza visual en el cerebro a través del nervio óptico 3,4,5,6,7,8,9,10 . La disminución de las concentraciones séricas y el ROL ocular pueden afectar la formación de la proteína retinilideno, lo que a su vez causa la mala localización de la opsina, la acumulación de apoproteínas opsinas, la ceguera nocturna y la degeneración del sistema operativo de los fotorreceptores, lo que conduce a la retinosis pigmentaria o amaurosis congénita de Leber, que puede causar ceguera 3,10.

El retinol totalmente trans es la forma de transporte fundamental de la vitamina A en la dieta y es la fuente de la que se derivan todos los retinoides funcionales y los metabolitos de la vitamina A en la dieta. El hígado es el órgano principal para el almacenamiento de vitamina A en la dieta. El retinol hepático se transporta a través del suero en forma de complejo con la proteína 4 de unión al retinol (RBP4). La RBP4, expresada principalmente en el hígado, forma un holocomplejo con el sustrato de retinol y la transtiretina (TTR), que entra en la circulación 11,12,13,14,15,16,17. El informe de un receptor de superficie celular para RBP4 en la década de 1970 condujo a la hipótesis de que las proteínas transportadoras de membrana ayudaban al transporte de retinoides dentro y fuera de las células. El receptor de la superficie celular para el retinol unido a RBP4 (RBP4-ROL) se identificó como estimulado por el ácido retinoico 6 retinol (STRA6) en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) del ojo. STRA6 se une al complejo holo-RBP4 circulatorio y transporta el retinol unido a RBP4 a través del EPR para ser utilizado por los fotorreceptores18,19. Las mutaciones en STRA6 pueden conducir a una miríada de enfermedades y fenotipos asociados con concentraciones reducidas de ROL ocular. Las mutaciones en STRA6 durante el desarrollo pueden provocar anoftalmia, microftalmia y otros síntomas no oculares que se superponen con los fenotipos asociados con el síndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. La STRA6 se expresa en diferentes órganos y tejidos, como el EPR del ojo, pero no en todos los tejidos26,27. Aunque el sitio principal de almacenamiento de retinoides es el hígado, STRA6 no se expresa en el hígado.

Alapatt y sus colegas descubrieron que el receptor 2 de la proteína de unión al retinol 4 (RBPR2) se unió a RBP4 con alta afinidad y fue responsable de la absorción de retinol unido a RBP4 en el hígado, similar a STRA6 en el RPE28. Se ha reportado que RBPR2 comparte homología estructural con STRA6 29,30,31. Se propone que RBP4 se une a los residuos S294, Y295 y L296 en RBPR2, un dominio de unión a aminoácidos parcialmente conservado entre RBPR2 y STRA6 29,30,31. A partir de estos estudios, se propone que los receptores de membrana de la vitamina A, como STRA6 y RBPR2, que contienen uno o más residuos/dominios de unión extracelular, interactúan con el RBP4-ROL circulatorio. Los receptores de membrana, por lo tanto, desempeñan un papel importante en la unión del receptor a RBP4 circulatorio para la internalización de ROL en tejidos diana, como el hígado y el ojo.

En la primera parte de este estudio, utilizamos la Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) para investigar la interacción de dos receptores de membrana de vitamina A (RBPR2 y STRA6) con su ligando fisiológico RBP431. Las afinidades de unión y la cinética de asociación/disociación de la proteína a los complejos de ligandos se pueden medir en tiempo real mediante el uso de SPR. Esta metodología tuvo como objetivo proporcionar información cinética, estructural y bioquímica crítica sobre los motivos de unión a RBP4 en RBPR2 y STRA6, que son críticos para comprender los estados patológicos de la deficiencia de vitamina A31,32. Como se mencionó anteriormente, el ROL circulatorio se internaliza en el EPR a través de STRA6 para generar el cromóforo 11-cis retinal, que se une a la opsina para generar la proteína retinilideno, rodopsina, en los fotorreceptores33. Utilizamos metodologías de espectrofotometría para cuantificar la GPCR-opsina y su ligando 11-cis retinal complex en lisados de retina murinos, lo cual es crítico para comprender los mecanismos de la proteína retinilideno reducida, rodopsina, en los estados patológicos oculares de Retinitis Pigmentosa o Amaurosis Congénita de Leber34. En general, estos protocolos se pueden aplicar para estudiar in vitro las consecuencias fisiológicas de los mutantes RBP4, STRA6 o RBPR2 en la influencia de la homeostasis sistémica y ocular de la vitamina A sistémica y ocular o el impacto de las proteínas mutantes de la rodopsina o del ciclo de los retinoides en la función visual35,36.

Protocolo

1. Metodología de resonancia de plasmón de superficie (SPR)

  1. Preparación y purificación de la proteína RBP4 de ratón
    1. Diseñe cebadores para generar ADNc de ratón RBP4 (msRBP4) de longitud completa (Secuencia de referencia del NCBI: NM_001159487.1). Clone el ADNc msRBP4 en un vector de expresión resistente a la kanamicina pET28a His-tag y expréselo en células BL-21 DE3 (Tabla de materiales).
    2. Transformar las células competentes BL-21 DE3 (según el protocolo del fabricante) con el vector msRBP4-pET28a ligado y, a continuación, colocar la placa en placas de agar de caldo Luria-Bertani (LB) que contienen kanamicina 50 μg/mL30,37. Incubar las placas durante la noche a 37 °C en una incubadora y detectar colonias positivas al día siguiente.
    3. Elija una sola colonia e incube durante la noche a 37 °C en 5 mL de caldo LB que contenga Kanamicina 50 μg/mL.
    4. Para el cultivo secundario en 500 mL de caldo LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina, utilizar un volumen de cultivo primario al 1% (a partir del paso 1.1.3.) e incubar a 37 °C durante 3-4 h; Compruebe la densidad óptica con un espectrofotómetro. Lo ideal es proceder si el valor de OD está entre 0,6 y 1 para inducir la expresión de proteínas con 0,5 mM de IPTG a 24 °C durante la noche.
    5. Utilice múltiples concentraciones de IPTG de 0,1-1 mM y un rango de temperatura de 16-30 °C para optimizar laexpresión y la estabilidad de MS RBP4.
    6. Centrifugar el cultivo (desde el paso 1.1.5.) a 16.000 × g durante 10 min, desechar el sobrenadante y mantener el pellet en hielo.
    7. Homogeneizar el pellet con tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% (v/v) de Triton X-100, 10% de glicerol, 0,5 mM de PMSF e inhibidores de la proteasa [pH 8,0]). Sonicar el lisado durante un ciclo de 15 s ON y 30 s OFF utilizando un homogeneizador con una potencia de salida de 250 vatios y una frecuencia de salida del 40-50% a 20 kHz. Repita 5 veces.
    8. Eliminar los restos celulares y las células no lisadas mediante centrifugación a 16.000 × g durante 20 min. Pase el sobrenadante del lisado a través de una columna NTA de níquel equilibrado por tampón.
    9. Lave la columna con tampón de lisis (del paso 1.1.8) que contenga 30 mM de imidazol.
    10. En fracciones, eluir la proteína msRBP4 unida utilizando un tampón que contenga 250 mM de imidazol. Ejecute las fracciones eluidas y controle visualmente la cantidad de proteína con un gel de poliacrilamida SDS al 12%, teñido con Coomassie Brilliant Blue R-250 en solución de metanol:agua:ácido acético (45:45:10) y elimine las manchas con solución sin tinción de Coomassie metanol:agua:ácido acético (45:45:10).
    11. Agrupe las fracciones no utilizadas y dialice las fracciones agrupadas con un casete de diálisis de 10K de 10 kDa MWCO.
    12. Evaluar la calidad de la fracción dializada en un gel SDS-PAGE al 12% y cuantificar la concentración de proteína.
      NOTA: Se utilizó la proteína Apo-RBP4 en el análisis SPR. Para la generación de holo-RBP4 (RBP4-retinol), consulte los protocolos detallados publicados en otros lugares36,37.
  2. Validación inicial de los péptidos RBPR2 y STRA6 con RBP4 para su estructura e interacción mediante ensayo de fluorescencia de triptófano y espectroscopía de dicroísmo circular (CD)
    1. Ensayo de fluorescencia de triptófano
      1. Utilice la herramienta de análisis de composición de proteínas en línea (https://web.expasy.org/protparam/) y pegue la secuencia de aminoácidos en un código de una letra para evaluar la composición estructural de la proteína RBP4 recombinante y los péptidos individuales de RBPR2 y STRA6 para determinar los residuos de aminoácidos de triptófano en los péptidos y proteínas individuales (Tabla de materiales).
      2. Haga clic en el botón de cálculo de parámetros y evalúe la composición de aminoácidos para los residuos de triptófano (Trp).
        NOTA: Los residuos de triptófano deben estar presentes en los péptidos o proteínas individuales que se están analizando.
      3. Diluir los péptidos RBPR2 y STRA6 individuales en varias concentraciones micromolares e incubar individualmente con 3 μg ms deRBP4 en una placa de 96 pocillos a temperatura ambiente durante 5 min. Excite la mezcla a 290 nm y escanee la emisión de 300 nm a 400 nm de longitud de onda.
      4. Normalice los datos con la condición de control en blanco (solo tampón, sin péptido y sin proteína) y péptido (sin proteína) y gráfica.
        NOTA: El incremento de la fluorescencia del triptófano tras la exposición a una concentración de péptidos de baja a alta sugiere una interacción positiva entre los dos péptidos individuales y la proteína RBP4.
    2. Espectroscopía de dicroísmo circular (CD)
      1. Diluya los péptidos individuales y la proteína RBP4 recombinante en 1x tampón PBS, pH 7.0. Utilice varias concentraciones de péptidos RBPR2 y STRA6 y proteína RBP4 de 0,1 a 10 μg/ml para un control de calidad, como se describe a continuación.
      2. Añada péptidos diluidos individuales y proteínas en una cubeta de 0,1 cm de longitud de paso y mida la absorbancia/elipticidad de la CD utilizando un espectrofotómetro de CD (195-250 nm). Utilice la siguiente fórmula para calcular la elipticidad media del residuo (θ).
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S representa la señal CD en mθ; mRw representa la masa media del residuo; c representa la concentración de la proteína en mg/mL; y l representa la longitud del camino en cm.
      3. Calcule el cambio porcentual en la estructura de la molécula utilizando el análisis de estructura secundaria de BeStSel para la predicción del pliegue de proteínas mediante espectroscopia CD (https://bestsel.elte.hu).
        NOTA: La estructura secundaria indica el plegamiento adecuado y las confirmaciones conservadas cruciales para el estudio de la interacción y el resultado de las interacciones. Inspeccione la estructura predicha del dominio y continúe con el estudio de interacción.

2. Análisis SPR para determinar las afinidades de unión y los parámetros cinéticos de los receptores de membrana de la vitamina A (RBPR2 y STRA6) con su ligando fisiológico RBP4

  1. Para la inmovilización de RBP4 en la configuración de la superficie del chip CM5, utilizamos el chip sensor SPR, que lleva un enlazador de carboximetildextrano extendido a un tamaño de ~ 100 nm unido covalentemente sobre una superficie de oro. En presencia de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) carbodiimida (EDC), la N-hidroxisuccinimida (NHS) convierte los grupos carboxilo en la superficie del chip en ésteres de N-hidroxisuccinimida, que reaccionan espontáneamente con los grupos amina de aminoácidos y proteínas, obligando al ligando a unirse covalentemente a la superficie del chip (Tabla de materiales).
    1. Inmovilice la proteína msRBP4 purificada en el chip sensor (Figura 1 y Figura 2). En el menú Ejecutar software, elija el Asistente y proceda con la opción de inmovilización . Diluir el ligando (proteína msRBP4 obtenida del paso 1.1) en tampón de inmovilización (tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 5,0) a 10 μg/mL (4 μL de ligando + 396 μL de tampón) y alícuota los reactivos de acoplamiento en viales. Abra la ventana del asistente de configuración de inmovilización desde el control de software, seleccione Chip CM5 y opción Inmovilizar celda de flujo 2 y nivel objetivo de 1,200 Unidad de respuesta (RU) para lograr Rmax de 30 RU en el estudio cinético y solución de lavado: Etanolamina. Introduzca el nombre RBP4 y haga clic en Siguiente.
      NOTA: Opcional: El cuadro de diálogo Preparativos del sistema para la opción Centrar antes de la ejecución no es necesario si anteriormente se realizó el cebado con tampón de funcionamiento PBST (solución salina tamponada con fosfato con una solución detergente Tween 20 al 0,05 %).
    2. En el cuadro de diálogo Posición del bastidor , haga clic en Expulsar bastidor. Tome la gradilla y coloque los viales con volúmenes asignados para cada reactivo: 156 μL de msRBP4, 177 μL de etanolamina, 89 μL de EDC, 89 μL de NHS y un vial vacío. Inserte la gradilla con los viales de muestra y haga clic en Aceptar y Siguiente.
    3. En el cuadro de diálogo Preparar protocolo de ejecución , haga clic en Iniciar y guardar.
  2. Configuración del ensayo cinético de péptidos RBPR2 y STRA6
    1. Diluir en serie los péptidos RBPR2 de ratón, RBPR2 mutante y STRA6 (sintetizados químicamente anteriormente31 y enumerados en la Tabla de materiales) en un tampón en funcionamiento en un rango de 0,8-26,6 μM.
    2. Abra el software de control y seleccione Asistente de cinética/afinidad. Haga clic en Archivo | Abra la plantilla y seleccione Cinética/Afinidad. Introduzca la ruta de flujo 2-1 del cuadro de diálogo de secuencia de inyección (celda de flujo 2 como activa y celda de flujo 1 como referencia), verifique el tipo de chip CM5 y haga clic en Siguiente. En el cuadro de diálogo de configuración , marque Ejecutar ciclos de inicio, introduzca Solución: búfer y ciclos: y haga clic en Siguiente.
    3. En el cuadro de diálogo de parámetros de inyección , introduzca los valores de los parámetros de muestra : tiempo de contacto: 120 s, caudal 30 μL/min, tiempo de disociación 300 s; para los parámetros de regeneración : introduzca el nombre de la solución de regeneración: Glicina-HCl (pH 2,5), tiempo de contacto: 30 s, caudal: 30 μL/min y haga clic en Siguiente.
    4. En el cuadro de diálogo de muestras , introduzca el nombre de los péptidos, el peso molecular y las concentraciones y haga clic en Siguiente. En el cuadro de diálogo Posición de la grada , asigne los péptidos diluidos como muestras individuales de ~120 μL de varias concentraciones de 1 a 100 μM y ~230 μL de tampón, ~120 μL de tampón y ~1.000 μL de glicina, pH 2,5, a las posiciones del Rack. Haga clic en Eject Rack e inserte todos los viales. Haga clic en Siguiente y, en el cuadro de diálogo Preparar protocolo de ejecución , haga clic en Iniciar, escriba un nombre de archivo y Guardar (Figura 2).
    5. En el software, haga clic en el menú Inicio y seleccione Evaluación. Elija abrir el archivo en el software y, en el menú desplegable de selección, elija Fc2-1 para analizar el sensorgrama activo sustraído en blanco de la celda de referencia para las fases de asociación y disociación de los péptidos msRBP4 y mutantes msRBPR2 y msSTRA6.
    6. Haga clic en el botón desplegable Cinética/Afinidad y elija Superficie enlazada; para abrir el cuadro de diálogo Seleccionar curvas , marque Incluir columna en la tabla y haga clic en Siguiente. Seleccione el cuadro de diálogo Datos para mostrar los sensorgramas sustraídos en blanco; haga clic en Cinética y afinidad, mantenga los parámetros predeterminados y haga clic en la opción Ajustar para el ajuste de curvas. Inspeccione la pestaña Informe para ver la constante de disociación de equilibrio Kd y Ka o Ken la tasa de asociación y Kd o Ken la tasa de disociación. Guarde el sensorgrama de datos de Kinetics en .txt formato delimitado por tabulaciones y utilice los valores para trazar gráficos (Figura 3).
    7. Para determinar la constante cinética de afinidad Kd (concentración de ligando que se une a la mitad de los receptores en equilibrio), copie y pegue las columnas de datos en el archivo de formato .txt generado a partir de la gráfica de evaluación a XY utilizada en el software. Haga clic en Analizar y regresión no lineal (ajuste de curva), compruebe la columna de datos y haga clic en Aceptar. En el cuadro de diálogo de parámetros , haga clic en Saturación de encuadernación y Modelo de ajuste de encuadernación específico de un sitio con la fórmula de:
      Y= (Bmax * X)/(Kd + X)
      Donde Bmax es el número máximo de sitios de unión (unidad de respuesta), X es la concentración de los péptidos e Y es la unión (unidad de respuesta) (Figura 3).

3. Metodología de espectrofotometría para cuantificar el complejo proteico retiniano GPCR-11-cis (proteína retinilideno rodopsina) en lisados de retina

  1. Transporta el grupo predeterminado de ratones que consta de ratones WT-C57BL/6J adultos al cuarto oscuro.
  2. Adapte los ratones a la oscuridad durante la noche durante 12-16 h, y bajo luz roja, coloque al ratón en una cámara de eutanasia y abra la válvula de gas CO2 en el regulador a 5 L / min durante ~ 5 min. Asegurar la muerte aplicando presión sobre el cuello y la cola tirada hacia atrás (luxación cervical).
  3. Enuclear los globos oculares y homogeneizar los ojos en un tampón helado que contenga 20 mM de bis-tris propano (1,3-bis (tris(hidroximetil)metilamino)propano; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA y con inhibidor de proteasa (Tabla de Materiales).
  4. Centrifugar el homogeneizado durante 15 min a 16000 x g a 4 °C, desechar el sobrenadante que contiene proteínas citosólicas solubles en agua. Vuelva a suspender y solubilizar la membrana peletizada y las proteínas de la membrana en un tampón que contenga 20 mM de n-dodecil-β-d-maltósido (DDM), 20 mM de bis-tris propano (BTP), pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA y con inhibidor de la proteasa durante 1 h a 4 °C en una plataforma giratoria.
  5. Centrifugar la fracción de membrana resolubilizada durante 1 h a 16000 x g, 4 °C. Mezclar el sobrenadante con 30 μL de perlas de anticuerpos Rho 1D4 e incubar durante 1 h a 4 °C en una plataforma giratoria.
  6. Con un soporte magnético, separe el pulldown con perlas, deseche el sobrenadante y lave las perlas con tampón 20 mM de propano bis-tris (BTP) pH 7.4, 500 mM de NaCl y 2 mM de DDM.
  7. Eluir la proteína de rodopsina incubando durante 5-10 min a temperatura ambiente con tampón 20 mM de bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 2 mM de DDM que contiene 0,2 mg/mL de péptido 1D4 (-TETSQVAPA) (Figura 4 y Figura 5).
  8. Analice el eluto para la absorbancia de 200 nm a 800 nm utilizando una cubeta rectangular, submicro, de cuarzo, de 2 mm de apertura, 10 mm de longitud de trayectoria, 50 μL en un ajuste de escaneo rápido con espectrofotómetro.
    NOTA: Utilice únicamente cubetas de cuarzo de alta calidad (Figura 4).
  9. Para validar y determinar la calidad, verifique y exponga el eluido a luz brillante durante 1 minuto, luego repita el paso 3.8.
  10. Reste la absorbancia en blanco y calcule la relación de los espectros de absorbancia analizados con absorbancia a 500 nm para la opsina unida a la retina 11-cis, 380 nm para la opsina unida a la retina totalmente trans expuesta a la luz y 280 nm para la proteína Apo-Opsina libre de ligando (Figura 6). La opsina libre sin ligando retinal proporciona una absorbancia de referencia a 500 nm.
  11. Para cuantificar la concentración de rodopsina, utilice la Ley de Beer-Lambert:
    A=ε· C·l o C=A/ε·l
    Donde A es la absorbancia, ε el coeficiente de extinción molar (rodopsina ε500 = 40.600 M−1 cm−1 para Apo Opsina ε280 libre = 81.200 M−1 cm−1), C es la concentración y l longitud del trayecto.
  12. Para cuantificar la opsina ligada en porcentaje, utilice una relación de A280/A500.
  13. Traza los espectros de absorbancia sustraídos en blanco y calcula el valor de opsina libre32.
  14. Calcule la concentración de rodopsina utilizando el coeficiente de extinción ε500 = 40600 M−1 cm−1. La concentración de opsina libre de ligando se calcula con la ley de Beer-Lambert utilizando el coeficiente de extinción ε280 = 81.200 M−1 cm−1.

Resultados

Se describen métodos cuantitativos para estudiar las interacciones proteína-ligando de los receptores de membrana de vitamina A y la opsina de los fotorreceptores con sus respectivos ligandos fisiológicos. La RBP4 recombinante de ratón debe expresarse en E. coli y la proteína purificada debe utilizarse como ligando conjugado en un chip SPR. El RBPR2, STRA6 y el mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" sintetizados químicamente de un péptido de ~...

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
Metodología SPR
Modelado in silico y análisis de acoplamiento: La estructura predicha de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) y STRA6, y la estructura conocida para la base de datos MSRBP 4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa), deben utilizarse para el estudio de acoplamiento29,31. Además, se deben utilizar métodos in vitro (cult...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito, o en la decisión de publicar los resultados.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. Beata Jastrzebska, Ph.D. (Departamento de Farmacología, Universidad Case Western Reserve, OH) por su consejo sobre el protocolo de absorción de rodopsina. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH-NEI (EY030889 y 3R01EY030889-03S1) y, en parte, por los fondos iniciales de la Universidad de Minnesota para G.P.L.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

Referencias

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676 (2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229 (2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236 (2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371 (2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099 (2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657 (2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293 (2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169 (2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207 (2017).

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