Retinylidene Proteininin Üretilmesinde A Vitamini Membran Reseptörleri ve Opsin Proteininin Ligandları ile Etkileşimlerinin İncelenmesi için Metodoloji

Özet

Burada, A vitamini membran reseptörlerinin ve fotoreseptör opsin'in ilgili fizyolojik ligandları ile protein-ligand etkileşimlerini incelemek için iki kantitatif yöntem tanımlanmıştır.

Özet

Diyetle alınan A vitamini / all-trans retinolün (ROL) vücut boyunca dağılımı, periferik dokularda retinoid fonksiyonunu sürdürmek ve görsel fonksiyon için retinylidene proteinini üretmek için kritik öneme sahiptir. RBP4-ROL, kanda bulunan retinol bağlayıcı protein 4 (RBP4) ile ROL kompleksidir. Karaciğerde Retinol Bağlayıcı Protein 4 Reseptörü 2 (RBPR2) ve gözde Retinoik Asit 6 Retinol (STRA6) tarafından imile edilen iki zar reseptörü dolaşım RBP4'ü bağlar ve bu mekanizma ROLÜ'nün hücrelere içselleştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Reseptör-ligand kinetiğini araştırmak için yöntemler oluşturmak, retinoid homeostazı için A vitamini reseptörlerinin fizyolojik fonksiyonunu anlamak için esastır. Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) deneylerini kullanarak, fizyolojik ligandı RBP4 ile A vitamini membran reseptörlerinin bağlanma afinitelerini ve kinetik parametrelerini analiz edebiliriz.

Bu metodolojiler, A vitamini eksikliğinin patolojik durumlarını anlamak için kritik olan RBPR2 ve STRA6'daki RBP4 bağlayıcı motiflerin yeni yapısal ve biyokimyasal bilgilerini ortaya çıkarabilir. Gözde, içselleştirilmiş ROL, retiniliden proteini rodopsin oluşturmak için fotoreseptörlerde opsine bağlanan görsel kromofor olan 11-cis retinal'e metabolize edilir. Işığın emilmesi, 11-cis retinalin cis-trans izomerizasyonuna neden olur, bu da rodopsinde konformasyonel değişikliklere ve ardından fototransdüksiyon kaskadının aktivasyonuna neden olur. Azalan serum ve oküler ROL konsantrasyonları, retiniliden protein oluşumunu etkileyebilir ve bu da rodopsin yanlış lokalizasyonuna, apoprotein opsin birikimine, gece körlüğüne ve fotoreseptör dış segment dejenerasyonuna neden olarak Retinitis Pigmentosa veya Leber Konjenital Amauroz'a yol açabilir.

Bu nedenle, retinadaki G proteinine bağlı reseptör opsin-11-cis retina kompleksini ölçmek için spektrofotometrik metodolojiler, yukarıda belirtilen patolojik durumlarda retina hücre dejenerasyonunun mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu kapsamlı metodolojilerle araştırmacılar, insanlarda görsel fonksiyonun sürdürülmesi için kritik olan fotoreseptörlerde retiniliden protein konsantrasyonlarının üretilmesi ve sürdürülmesi için kritik olan sistemik ve oküler retinoid homeostazın korunmasında diyetle alınan A vitamini tedarikini daha iyi değerlendirebileceklerdir.

Giriş

Diyetle elde edilen Vitamin A/all-trans retinol/ROL, görme fonksiyonunda rol oynayan önemli bir bileşendir ^1,2. Diyetle alınan A vitamininin bir metaboliti olan kromofor 11-cis retinal, fotoreseptörlerde retiniliden proteini, rodopsin oluşturmak için G proteinine bağlı reseptör (GPCR) opsinine bağlanır. Işık göze düştüğünde, rodopsinin konfigürasyonu, 11-cis-retinal bileşeninin all-trans-retinal'e dönüştürülmesi yoluyla temel bir değişikliğe uğrar. Bu konfigürasyon değişikliği, çubuk fotoreseptörleri içinde bir fototransdüksiyon kaskadını te....

Protokol

1. Yüzey plazmon rezonansı (SPR) metodolojisi

1. Fare RBP4 proteininin hazırlanması ve saflaştırılması
   1. Tam uzunlukta fare RBP4 (msRBP4) cDNA (NCBI Referans Dizisi: NM_001159487.1) oluşturmak için astarlar tasarlayın. MSRBP4 cDNA'yı bir pET28a His-tag Kanamisine dirençli ekspresyon vektörüne klonlayın ve BL-21 DE3 hücrelerinde eksprese edin (Malzeme Tablosu).
   2. BL-21 DE3 yetkin hücrelerini (üreticinin protokolüne göre) bağlanmış msRBP4-pET28a vektörü ile dönüştürün ve ardından Kanamisin 50 μg/mL^30,37<....

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
SPR Metodolojisi
In silico modelleme ve yerleştirme analizi: RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) ve STRA6'nın tahmin edilen yapısı ve msRBP4 PDB veritabanı için bilinen yapı (RSCB PDB ID: 2wqa), yerleştirme çalışması^29,31 için kullanılmalıdır. Ek olarak, A vitamini reseptörleri (RBPR2 ve STRA6) üzerindeki varsayı.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms