Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, A vitamini membran reseptörlerinin ve fotoreseptör opsin'in ilgili fizyolojik ligandları ile protein-ligand etkileşimlerini incelemek için iki kantitatif yöntem tanımlanmıştır.

Özet

Diyetle alınan A vitamini / all-trans retinolün (ROL) vücut boyunca dağılımı, periferik dokularda retinoid fonksiyonunu sürdürmek ve görsel fonksiyon için retinylidene proteinini üretmek için kritik öneme sahiptir. RBP4-ROL, kanda bulunan retinol bağlayıcı protein 4 (RBP4) ile ROL kompleksidir. Karaciğerde Retinol Bağlayıcı Protein 4 Reseptörü 2 (RBPR2) ve gözde Retinoik Asit 6 Retinol (STRA6) tarafından imile edilen iki zar reseptörü dolaşım RBP4'ü bağlar ve bu mekanizma ROLÜ'nün hücrelere içselleştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Reseptör-ligand kinetiğini araştırmak için yöntemler oluşturmak, retinoid homeostazı için A vitamini reseptörlerinin fizyolojik fonksiyonunu anlamak için esastır. Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) deneylerini kullanarak, fizyolojik ligandı RBP4 ile A vitamini membran reseptörlerinin bağlanma afinitelerini ve kinetik parametrelerini analiz edebiliriz.

Bu metodolojiler, A vitamini eksikliğinin patolojik durumlarını anlamak için kritik olan RBPR2 ve STRA6'daki RBP4 bağlayıcı motiflerin yeni yapısal ve biyokimyasal bilgilerini ortaya çıkarabilir. Gözde, içselleştirilmiş ROL, retiniliden proteini rodopsin oluşturmak için fotoreseptörlerde opsine bağlanan görsel kromofor olan 11-cis retinal'e metabolize edilir. Işığın emilmesi, 11-cis retinalin cis-trans izomerizasyonuna neden olur, bu da rodopsinde konformasyonel değişikliklere ve ardından fototransdüksiyon kaskadının aktivasyonuna neden olur. Azalan serum ve oküler ROL konsantrasyonları, retiniliden protein oluşumunu etkileyebilir ve bu da rodopsin yanlış lokalizasyonuna, apoprotein opsin birikimine, gece körlüğüne ve fotoreseptör dış segment dejenerasyonuna neden olarak Retinitis Pigmentosa veya Leber Konjenital Amauroz'a yol açabilir.

Bu nedenle, retinadaki G proteinine bağlı reseptör opsin-11-cis retina kompleksini ölçmek için spektrofotometrik metodolojiler, yukarıda belirtilen patolojik durumlarda retina hücre dejenerasyonunun mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu kapsamlı metodolojilerle araştırmacılar, insanlarda görsel fonksiyonun sürdürülmesi için kritik olan fotoreseptörlerde retiniliden protein konsantrasyonlarının üretilmesi ve sürdürülmesi için kritik olan sistemik ve oküler retinoid homeostazın korunmasında diyetle alınan A vitamini tedarikini daha iyi değerlendirebileceklerdir.

Giriş

Diyetle elde edilen Vitamin A/all-trans retinol/ROL, görme fonksiyonunda rol oynayan önemli bir bileşendir 1,2. Diyetle alınan A vitamininin bir metaboliti olan kromofor 11-cis retinal, fotoreseptörlerde retiniliden proteini, rodopsin oluşturmak için G proteinine bağlı reseptör (GPCR) opsinine bağlanır. Işık göze düştüğünde, rodopsinin konfigürasyonu, 11-cis-retinal bileşeninin all-trans-retinal'e dönüştürülmesi yoluyla temel bir değişikliğe uğrar. Bu konfigürasyon değişikliği, çubuk fotoreseptörleri içinde bir fototransdüksiyon kaskadını tetikleyerek, ışığı bir elektrik sinyaline dönüştürür ve bu sinyal, optik sinir 3,4,5,6,7,8,9,10 aracılığıyla beyindeki görsel kortekse iletilir . Azalan serum ve oküler ROL konsantrasyonları, retiniliden protein oluşumunu etkileyebilir, bu da opsin yanlış lokalizasyonuna, apoprotein opsin birikimine, gece körlüğüne ve fotoreseptör OS dejenerasyonuna neden olarak körlüğe neden olabilen Retinitis Pigmentosa veya Leber Konjenital Amauroz'a yol açabilir 3,10.

All-trans retinol, diyetle alınan A vitamininin temel taşıma şeklidir ve tüm fonksiyonel retinoidlerin ve diyetle alınan A vitamini metabolitlerinin türetildiği kaynaktır. Karaciğer, diyetle alınan A vitamini depolaması için birincil organ olarak görev yapar. Hepatik retinol, retinol bağlayıcı protein 4 (RBP4) ile kompleksi olarak serum yoluyla taşınır. Esas olarak karaciğerde eksprese edilen RBP4, 11,12,13,14,15,16,17 dolaşımına giren retinol substratı ve transtiretin (TTR) ile bir holo-kompleks oluşturur. 1970'lerde RBP4 için bir hücre yüzeyi reseptörünün raporu, retinoidlerin hücrelerin içine ve dışına taşınmasına yardımcı olan zar taşıma proteinleri hipotezine yol açtı. RBP4'e bağlı retinol (RBP4-ROL) için hücre yüzeyi reseptörü, gözün retina pigment epitelinde (RPE) Retinoik Asit 6 Retinol (STRA6) tarafından STimüle edilmiş olarak tanımlandı. STRA6, dolaşım holo-RBP4 kompleksine bağlanır ve fotoreseptörler18,19 tarafından kullanılmak üzere RBP4'e bağlı retinol'ü RPE boyunca hareket ettirir. STRA6'daki mutasyonlar, azalmış oküler ROL konsantrasyonları ile ilişkili sayısız hastalığa ve fenotipe yol açabilir. Gelişim sırasında STRA6 mutasyonları, Matthew-Wood sendromu20,21,22,23,24,25,26,27 ile ilişkili fenotiplerle örtüşen anoftalmi, mikroftalmi ve diğer oküler olmayan semptomlara yol açabilir. STRA6, gözdeki RPE gibi farklı organ ve dokularda eksprese edilir, ancak tüm dokularda eksprese edilmez26,27. Retinoid depolamanın birincil bölgesi karaciğer olmasına rağmen, STRA6 karaciğerde eksprese edilmez.

Alapatt ve meslektaşları, Retinol Bağlayıcı Protein 4 Reseptörü 2'nin (RBPR2) RBP4'ü yüksek afinite ile bağladığını ve RPE28'deki STRA6'ya benzer şekilde karaciğerde RBP4'e bağlı retinolün alımından sorumlu olduğunu keşfettiler. RBPR2'nin STRA6 29,30,31 ile yapısal homolojiyi paylaştığı bildirilmiştir. RBP4'ün, RBPR294 ve STRA295 ile STRA296 arasında kısmen korunmuş bir amino asit bağlama alanı olan RBPR2 üzerindeki S2, Y6 veL29,30,31 kalıntılarına bağlanması önerilmektedir. Bu çalışmalardan, bir veya daha fazla hücre dışı bağlanma kalıntısı/alanı içeren STRA6 ve RBPR2 gibi A vitamini membran reseptörlerinin dolaşım RBP4-ROL ile etkileşime girdiği öne sürülmüştür. Bu nedenle membran reseptörleri, karaciğer ve göz gibi hedef dokulara ROL içselleştirmesi için dolaşım RBP4'e reseptör bağlanmasında önemli bir rol oynar.

Bu çalışmanın ilk bölümünde, iki A vitamini membran reseptörünün (RBPR2 ve STRA6) fizyolojik ligandları RBP431 ile etkileşimini araştırmak için Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) kullandık. Proteinin ligand komplekslerine bağlanma afiniteleri ve birleşme/ayrışma kinetiği, SPR kullanılarak gerçek zamanlı olarak ölçülebilir. Bu metodoloji, A vitamini eksikliğinin patolojik durumlarını anlamak için kritik olan RBPR2 ve STRA6'daki RBP4 bağlayıcı motifler hakkında kritik kinetik, yapısal ve biyokimyasal bilgiler sağlamayı amaçlamıştır31,32. Yukarıda bahsedildiği gibi, dolaşım ROL, fotoreseptörlerde retiniliden proteini, rodopsin oluşturmak için opsin'e bağlanan kromofor 11-cis retinalini oluşturmak için STRA6 aracılığıyla RPE'ye içselleştirilir33. Retinitis Pigmentosa veya Leber Konjenital Amaurosis oküler patolojik durumlarında indirgenmiş retinylidene proteini, rodopsin mekanizmalarını anlamak için kritik olan murin retinal lizatlarında GPCR-opsin ve ligand 11-cis retinal kompleksini ölçmek için spektrofotometri metodolojileri kullandık34. Genel olarak, bu protokoller, mutant RBP4, STRA6 veya RBPR2'nin sistemik ve oküler A vitamini homeostazını etkilemedeki fizyolojik sonuçlarını veya mutant rodopsin veya retinoid döngü proteinlerinin görsel işlev üzerindeki etkisini in vitro olarak incelemek için uygulanabilir35,36.

Protokol

1. Yüzey plazmon rezonansı (SPR) metodolojisi

  1. Fare RBP4 proteininin hazırlanması ve saflaştırılması
    1. Tam uzunlukta fare RBP4 (msRBP4) cDNA (NCBI Referans Dizisi: NM_001159487.1) oluşturmak için astarlar tasarlayın. MSRBP4 cDNA'yı bir pET28a His-tag Kanamisine dirençli ekspresyon vektörüne klonlayın ve BL-21 DE3 hücrelerinde eksprese edin (Malzeme Tablosu).
    2. BL-21 DE3 yetkin hücrelerini (üreticinin protokolüne göre) bağlanmış msRBP4-pET28a vektörü ile dönüştürün ve ardından Kanamisin 50 μg/mL30,37 içeren Luria-Bertani (LB) et suyu Agar plakalarına plakalayın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin ve ertesi gün pozitif koloniler için tarama yapın.
    3. Tek bir koloni seçin ve 50 μg/mL Kanamisin içeren 5 mL LB suyunda 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
    4. 50 μg / mL Kanamisin içeren 500 mL LB suyundaki ikincil kültür için,% 1 hacimce birincil kültür kullanın (adım 1.1.3'ten itibaren) ve 37 ° C'de 3-4 saat inkübe edin; Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu kontrol edin. İdeal olarak, gece boyunca 24 ° C'de 0,5 mM IPTG ile protein ekspresyonunu indüklemek için OD değeri 0,6 ile 1 arasındaysa devam edin.
    5. MSRBP4 ekspresyonunu ve stabilitesini optimize etmek için 0,1-1 mM ve 16-30 °C sıcaklık aralığında birden fazla IPTG konsantrasyonu kullanın.
    6. Kültürü (adım 1.1.5'ten itibaren) 16.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti buz üzerinde tutun.
    7. Peleti lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, %0.1 (h/h) Triton X-100, %10 Gliserol, 0.5 mM PMSF ve Proteaz İnhibitörleri [pH 8.0]) ile homojenize edin. 250 Watt çıkışlı ve% 40-50 20 kHz çıkış frekansına sahip bir homojenizatör kullanarak lizatı 15 s AÇIK ve 30 s KAPALI döngüsü için sonikleştirin. 5x tekrarlayın.
    8. Hücre kalıntılarını ve parçalanmamış hücreleri 20 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleme ile çıkarın. Lizatın süpernatantını tampon dengelenmiş bir nikel NTA kolonundan geçirin.
    9. Kolonu 30 mM imidazol içeren lizis tamponu (adım 1.1.8'den itibaren) ile yıkayın.
    10. Fraksiyonlarda, 250 mM imidazol içeren tampon kullanarak bağlı msRBP4 proteinini elüte edin. Ayrıştırılmış fraksiyonları çalıştırın ve protein miktarını metanol:su:asetik asit (45:45:10) çözeltisi içinde Coomassie Brilliant Blue R-250 ile boyanmış %12 SDS poliakrilamid jel ile görsel olarak izleyin ve Coomassie lekesi metanol:su:asetik asit (45:45:10) içermeyen çözelti ile lekeyi çıkarın.
    11. Kullanılmayan fraksiyonları bir araya getirin ve havuzlanan fraksiyonları 10 kDa MWCO'luk 10K diyaliz kaseti ile diyaliz edin.
    12. Diyalize edilen fraksiyonun kalitesini %12'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde değerlendirin ve protein konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: SPR analizinde Apo-RBP4 proteini kullanılmıştır. Holo-RBP4 (RBP4-retinol) oluşturmak için, başka bir yerde yayınlanan ayrıntılı protokollere bakın 36,37.
  2. RBPR2 ve STRA6 peptitlerinin RBP4 ile yapı ve etkileşim için Triptofan floresan testi ve dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi ile ilk doğrulaması
    1. Triptofan floresan deneyi
      1. Tek tek peptitler ve proteindeki triptofan amino asit kalıntılarını belirlemek için rekombinant RBP4 proteininin ve RBPR2 ve STRA6'nın ayrı peptitlerinin yapısal bileşimini değerlendirmek için çevrimiçi protein bileşimi analiz aracını (https://web.expasy.org/protparam/) kullanın ve amino asit dizisini tek harfli koda yapıştırın.
      2. Hesaplama parametreleri düğmesine tıklayın ve triptofan (Trp) kalıntıları için amino asit bileşimini değerlendirin.
        NOT: Triptofan kalıntıları, analiz edilen tek tek peptitlerde veya proteinlerde bulunmalıdır.
      3. Tek tek RBPR2 ve STRA6 peptitlerini çeşitli mikromolar konsantrasyonlarda seyreltin ve oda sıcaklığında 96 oyuklu bir plakada 5 dakika boyunca 3 μg msRBP4 ile ayrı ayrı inkübe edin. Karışımı 290 nm'de heyecanlandırın ve emisyonu 300 nm'den 400 nm dalga boyuna kadar tarayın.
      4. Verileri Blank (yalnızca tampon, peptit ve protein yok) ve peptit kontrol koşulu (protein yok) ve çizim ile normalleştirin.
        NOT: Düşük ila yüksek peptit konsantrasyonuna maruz kaldığında triptofan floresan artışı, iki ayrı peptit ve RBP4 proteini arasında pozitif bir etkileşim olduğunu düşündürür.
    2. Dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi
      1. Tek tek peptitleri ve rekombinant RBP4 proteinini 1x PBS tamponu, pH 7.0 içinde seyreltin. Aşağıda açıklandığı gibi bir kalite kontrolü için 0,1 ila 10 μg/mL arasında çeşitli konsantrasyonlarda RBPR2 ve STRA6 peptitleri ve RBP4 proteini kullanın.
      2. 0,1 cm yol uzunluğunda bir küvete tek tek seyreltilmiş peptitler ve protein ekleyin ve bir CD spektrofotometresi (195-250 nm) kullanarak CD absorbansını / eliptikliğini ölçün. Ortalama kalıntı eliptikliğini (θ) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S, mθ cinsinden CD sinyalini temsil eder; mRw, ortalama kalıntı kütlesini temsil eder; c, proteinin mg/mL cinsinden konsantrasyonunu temsil eder; ve L, cm cinsinden yol uzunluğunu temsil eder.
      3. CD Spektroskopisi ile Protein Kıvrımı Tahminine BeStSel İkincil Yapı Analizini kullanarak molekül yapısındaki yüzde değişimi hesaplayın (https://bestsel.elte.hu).
        NOT: İkincil yapı, etkileşim çalışması ve etkileşimlerin sonucu için çok önemli olan uygun katlama ve korunmuş onayları gösterir. Etki alanının öngörülen yapısını inceleyin ve etkileşim etüdü ile daha fazla ilerleyin.

2. A vitamini membran reseptörlerinin (RBPR2 ve STRA6) fizyolojik ligandları RBP4 ile bağlanma afinitelerini ve kinetik parametrelerini belirlemek için SPR analizi

  1. RBP4'ün CM5 Çip yüzey kurulumunda immobilizasyonu için, altın bir yüzeye kovalent olarak tutturulmuş ~ 100 nm boyutuna uzatılmış bir karboksimetil dekstran bağlayıcı taşıyan SPR sensör çipini kullanıyoruz. 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) varlığında, N-hidroksisüksinid (NHS), çipin yüzeyindeki karboksil gruplarını, amino asitlerin ve proteinlerin amin grupları ile kendiliğinden reaksiyona giren N-Hidroksisüksinamid esterlere dönüştürür ve ligandı çipin yüzeyine kovalent olarak bağlanmaya zorlar (Malzeme Tablosu).
    1. Saflaştırılmış msRBP4 proteinini Sensör çipi üzerinde hareketsiz hale getirin (Şekil 1 ve Şekil 2). Yazılım Çalıştır menüsünde, Sihirbazı seçin ve immobilizasyon seçeneğine devam edin. Ligandı (adım 1.1'den elde edilen msRBP4 proteini) immobilizasyon tamponunda (10 mM Sodyum asetat tamponu, pH 5.0) 10 μg / mL'ye (4 μL ligand + 396 μL tampon) seyreltin ve birleştirme reaktiflerini şişelerde alikotlayın. Yazılım kontrolünden İmmobilizasyon Kurulum sihirbazı penceresini açın, CM5 Çipi'ni seçin ve kinetik etütte 30 RU Rmax elde etmek için Akış hücresi 2'yi ve hedef seviye 1.200 Yanıt Birimi (RU) seçeneğini belirleyin ve Yıkama solüsyonu: Etanolamin. RBP4 adını girin ve İleri'ye tıklayın.
      NOT: İsteğe bağlı: Daha önce çalışan tampon PBST (%0,05 Tween 20 deterjan çözeltisi içeren fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi) ile astarlama yapıldıysa, çalıştırmadan önce astarlama seçeneği için Sistem Hazırlıkları iletişim kutusu gerekli değildir.
    2. Raf konumu iletişim kutusunda, Rafı Çıkar'ı tıklatın. Rafı alın ve her reaktif için atanmış hacimlere sahip şişeleri yerleştirin: 156 μL msRBP4, 177 μL etanolamin, 89 μL EDC, 89 μL NHS ve boş bir şişe. Numune şişelerinin bulunduğu rafı yerleştirin ve Tamam ve İleri'ye tıklayın.
    3. Prepare Run Protocol (Çalıştırma Protokolünü Hazırla) iletişim kutusunda, Start (Başlat) ve Save (Kaydet) öğesine tıklayın.
  2. RBPR2 ve STRA6 peptitleri kinetik test kurulumu
    1. Fare RBPR2, mutant RBPR2 ve STRA6 peptitlerini (daha önce31 kimyasal olarak sentezlenmiş ve Malzeme Tablosunda listelenmiştir) 0.8-26.6 μM aralığında çalışan tamponda seri olarak seyreltin.
    2. Kontrol yazılımını açın ve Kinetik/Benzeşim sihirbazı'nı seçin. Dosya | Şablonu açın ve Kinetik/Benzeşim'i seçin. Enjeksiyon dizisi iletişim kutusu akış yolunu 2-1 girin (aktif olarak Akış hücresi 2 ve referans olarak Akış hücresi 1), Çip Tipi CM5'i kontrol edin ve İleri'ye tıklayın. Kurulum iletişim kutusunda, Başlangıç döngülerini çalıştır seçeneğini işaretleyin, Solution: buffer and cycles: girin ve İleri'ye tıklayın.
    3. Enjeksiyon parametreleri iletişim kutusunda, numune parametreleri için değerleri girin: temas süresi: 120 s, akış hızı 30 μL/dak, Ayrışma süresi 300 s; rejenerasyon parametreleri için: Rejenerasyon çözeltisi adını girin: Glisin-HCl (pH 2.5), temas süresi: 30 s, akış hızı: 30 μL/dak ve İleri'ye tıklayın.
    4. Örnekler iletişim kutusunda, peptitlerin adını, moleküler ağırlığını ve konsantrasyonlarını girin ve ileri'ye tıklayın. Raf konumu iletişim kutusunda, seyreltilmiş peptitleri 1 ila 100 μM ve ~230 μL Tampon, ~120 μL Tampon ve ~1.000 μL Glisin, pH 2.5 gibi çeşitli konsantrasyonlarda ayrı ayrı ~120 μL numuneler olarak Raf üzerindeki konumlara atayın. Rafı Çıkar'a tıklayın ve tüm şişeleri yerleştirin. İleri'ye tıklayın ve Çalıştırma Protokolünü Hazırla iletişim kutusunda Başlat'a tıklayın, bir dosya adı girin ve Kaydet'e tıklayın (Şekil 2).
    5. Yazılımda, Başlat menüsüne tıklayın ve Değerlendirme'yi seçin. Dosyayı yazılımda açmayı seçin ve açılır seçim menüsünden, ms RBP4 ve mutant msRBPR2 ve msSTRA6 peptitlerinin ilişkilendirme ve ayrışma fazları için Referans hücresi Boş çıkarılmış Aktif sensörgramı analiz etmek için Fc2-1'i seçin.
    6. Açılır Kinetik/Benzeşim düğmesine tıklayın ve Yüzeye bağlı'yı seçin; Eğrileri Seç iletişim kutusunu açmak için, tablodaki sütunu dahil et seçeneğini işaretleyin ve İleri'ye tıklayın. Boş çıkarılmış sensorgramları göstermek için Veri iletişim kutusunu seçin; Kinetik ve Benzeşim'e tıklayın, varsayılan parametreleri koruyun ve eğri uydurma için Sığdır seçeneğine tıklayın. Denge ayrışma sabiti Kd ve Ka veya Kilişkilendirme oranı ve K ayrışma oranı üzerinde Kd veya Kiçin Rapor sekmesini inceleyin. Kinetik veri sensörgramını sekmeyle ayrılmış .txt biçimde kaydedin ve grafikleri çizmek için değerleri kullanın (Şekil 3).
    7. Afinite kinetik sabiti Kd'yi (dengede reseptörlerin yarısına bağlanan ligand konsantrasyonu) belirlemek için, yazılımda kullanılan Evaluation to XY grafiğinden oluşturulan .txt formatındaki veri sütunlarını kopyalayıp yapıştırın. Analiz ve Doğrusal Olmayan regresyon (eğri uyumu) seçeneğine tıklayın, veri sütununu kontrol edin ve Tamam'a tıklayın. Parametre iletişim kutusunda, aşağıdaki formülle Bağlama doygunluğu ve Bir siteye özel bağlama uydurma modeli'ne tıklayın:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Bmax'ın maksimum bağlanma bölgesi sayısı (Yanıt Birimi) olduğu yerde, X peptitlerin konsantrasyonudur ve Y bağlanmadır (Yanıt birimi) (Şekil 3).

3. Retina lizatlarında GPCR-11-cis retinal protein kompleksini ( retinylidene protein rhodopsin) ölçmek için spektrofotometri metodolojisi

  1. Yetişkin WT-C57BL/6J farelerden oluşan önceden belirlenmiş fare grubunu karanlık odaya taşıyın.
  2. Karanlık, fareleri gece boyunca 12-16 saat boyunca uyarlayın ve kırmızı ışık altında, fareyi bir ötenazi odasına yerleştirin ve regülatör üzerindeki CO2 gaz vanasını ~ 5 dakika boyunca 5 L / dk'ya açın. Geriye doğru çekilen boyun ve kuyruğa baskı uygulayarak ölümü sağlayın (servikal çıkık).
  3. Göz kürelerini enüklee edin ve gözleri 20 mM bis-tris propan (1,3-bis (tris (hidroksimetil) metilamino) propan içeren buz gibi soğuk bir tamponda homojenize edin; BTP) pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ve proteaz inhibitörü ile (Malzeme Tablosu).
  4. Homojenatı 4 ° C'de 16000 x g'de 15 dakika santrifüjleyin, suda çözünür sitozolik proteinler içeren süpernatanı atın. Peletlenmiş membran ve membran proteinlerini 20 mM n-dodesil-β-d-maltosit (DDM), 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA içeren tampon içinde ve proteaz inhibitörü ile dönen bir platform üzerinde 4 ° C'de 1 saat boyunca yeniden askıya alın ve çözündürün.
  5. Yeniden çözünmüş membran fraksiyonunu 16000 x g, 4 ° C'de 1 saat santrifüjleyin. Süpernatanı 30 μL Rho 1D4 antikor boncukları ile karıştırın ve dönen bir platform üzerinde 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  6. Manyetik bir stand kullanarak, boncuklar kullanarak açılır menüyü ayırın, süpernatanı atın ve boncukları tampon 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7.4, 500 mM NaCl ve 2 mM DDM ile yıkayın.
  7. Rodopsin proteinini, 0.2 mg/mL 1D4 peptit (-TETSQVAPA) içeren 20 mM bis-tris propan (BTP) pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM tamponu ile oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe ederek elde edin (Şekil 4 ve Şekil 5).
  8. Aspektrofotometre ile hızlı bir tarama ayarında dikdörtgen, alt mikro, kuvars, 2 mm açıklık, 10 mm yol uzunluğu, 50 μL küvet kullanarak 200 nm ila 800 nm arasında absorbans için elute analiz edin.
    NOT: Yalnızca yüksek kaliteli Kuvars küvetler kullanın (Şekil 4).
  9. Kaliteyi doğrulamak ve belirlemek için elute'u kontrol edin ve 1 dakika boyunca parlak ışığa maruz bırakın, ardından adım 3.8'i tekrarlayın.
  10. Boş absorbansı çıkarın ve analiz edilen absorbans spektrumlarının 11-cis retinal bağlı opsin için 500 nm'de, ışığa maruz kalan all-trans retinal bağlı opsin için 380 nm'de ve ligand içermeyen Apo-Opsin proteini için 280 nm'de absorbans ile oranını hesaplayın (Şekil 6). Ligand retinal içermeyen serbest opsin, 500 nm'de bir temel absorbans sağlar.
  11. Rodopsin konsantrasyonunu ölçmek için Beer-Lambert Yasasını kullanın:
    A=ε· C·l veya C=A/ε·l
    Burada A absorbans, ε molar sönme katsayısı (rodopsin ε500 = 40.600 M−1 cm−1 serbest Apo Opsin ε280 = 81.200 M−1 cm−1 için), C konsantrasyon ve l yol uzunluğudur.
  12. Liganded-Opsin'i yüzde olarak ölçmek için A280/A500 oranını kullanın.
  13. Boş çıkarılmış absorbans spektrumlarını çizin ve serbest opsin değerini32 hesaplayın.
  14. 500 = 40600 M−1 cm−1 ε yok olma katsayısını kullanarak rodopsin konsantrasyonunu hesaplayın. Ligand içermeyen opsin konsantrasyonu,280 = 81.200 M−1 cm−1 ε yok olma katsayısı kullanılarak Beer-Lambert Yasası ile hesaplanır.

Sonuçlar

A vitamini membran reseptörlerinin ve fotoreseptör opsin'in ilgili fizyolojik ligandları ile protein-ligand etkileşimlerini incelemek için kantitatif yöntemler tanımlanmıştır. Rekombinant fare RBP4, E. coli'de ve bir SPR Çipi üzerinde konjuge bir ligand olarak kullanılan saflaştırılmış proteinde ifade edilmelidir. Bir ~40 amino asit peptidinin kimyasal olarak sentezlenmiş RBPR2, STRA6 ve mutant S294A RBPR2 "SYL motifi RBP4 etkileşimli hücre dışı bölgesi"...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
SPR Metodolojisi
In silico modelleme ve yerleştirme analizi: RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) ve STRA6'nın tahmin edilen yapısı ve msRBP4 PDB veritabanı için bilinen yapı (RSCB PDB ID: 2wqa), yerleştirme çalışması29,31 için kullanılmalıdır. Ek olarak, A vitamini reseptörleri (RBPR2 ve STRA6) üzerindeki varsayı...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Fon sağlayıcıların çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında; makalenin yazımında veya sonuçların yayınlanması kararında.

Teşekkürler

Yazarlar, rodopsin absorbans protokolü hakkındaki tavsiyesi için Dr. Beata Jastrzebska, Ph.D. (Farmakoloji Anabilim Dalı, Case Western Reserve Üniversitesi, OH). Bu çalışma bir NIH-NEI hibesi (EY030889 ve 3R01EY030889-03S1) ve kısmen Minnesota Üniversitesi başlangıç fonları tarafından GPL'ye desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

Referanslar

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676 (2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229 (2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236 (2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371 (2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099 (2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657 (2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293 (2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169 (2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 212Y zey Plazmon RezonansRetinolRBPR2STRA6RBP4Rodopsin absorbansApoprotein opsin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır