JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה אנו מתארים שתי שיטות כמותיות לחקר יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנדים של קולטני קרום ויטמין A ואופסין פוטורצפטור עם הליגנדות הפיזיולוגיות שלהם.

Abstract

פיזור ויטמין A/all-trans רטינול (ROL) בתזונה בכל הגוף הוא קריטי לשמירה על תפקוד רטינואיד ברקמות היקפיות ולייצור חלבון רטיניל לתפקוד הראייה. RBP4-ROL הוא קומפלקס של ROL עם חלבון קושר רטינול 4 (RBP4), אשר נמצא בדם. שני קולטני ממברנה, קולטן חלבון קושר רטינול 4 2 (RBPR2) בכבד ומגורה על ידי חומצה רטינואית 6 רטינול (STRA6) בעין, קושרים RBP4 במחזור הדם ומנגנון זה קריטי להפנמת ROL לתאים. ביסוס שיטות לחקר קינטיקה של קולטן-ליגנד חיוני להבנת התפקוד הפיזיולוגי של קולטני ויטמין A להומאוסטזיס רטינואידי. באמצעות מבחני תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אנו יכולים לנתח את זיקות הקישור ואת הפרמטרים הקינטיים של קולטני קרום ויטמין A עם ליגנד פיזיולוגי RBP4.

מתודולוגיות אלה יכולות לחשוף מידע מבני וביוכימי חדש של מוטיבים קושרי RBP4 ב-RBPR2 וב-STRA6, שהם קריטיים להבנת מצבים פתולוגיים של מחסור בוויטמין A. בעין, ROL מופנם עובר מטבוליזם לרשתית 11-cis, הכרומופור החזותי שנקשר לאופסין בפוטורצפטורים ליצירת חלבון רטיניליידן, רודופסין. בליעת האור גורמת לאיזומריזציה cis-to-trans של רשתית 11-cis, מה שגורם לשינויים קונפורמטיביים ברודופסין ולהפעלה שלאחר מכן של מפל הפוטוטרנסדוקציה. ירידה בריכוזים של ROL בסרום ובעין יכולה להשפיע על היווצרות חלבון רטיניליידן, אשר בתורו יכול לגרום למיקום שגוי של רודופסין, הצטברות אפופרוטאין אופסין, עיוורון לילה וניוון המקטע החיצוני של קולטני האור, מה שמוביל לרטיניטיס פיגמנטוזה או לבר אמאורוזיס מולד.

לכן, מתודולוגיות ספקטרופוטומטריות לכימות קומפלקס הרשתית opsin-11-cis המצומד לחלבון G ברשתית הן קריטיות להבנת מנגנונים של ניוון תאי רשתית במצבים הפתולוגיים שהוזכרו לעיל. בעזרת מתודולוגיות מקיפות אלה, החוקרים יוכלו להעריך טוב יותר את אספקת ויטמין A בתזונה בשמירה על הומאוסטזיס רטינואידי מערכתי ועיני, שהוא קריטי לייצור ושמירה על ריכוזי חלבון רטיניל בפוטורצפטורים, שהוא קריטי לשמירה על תפקוד הראייה בבני אדם.

Introduction

ויטמין A/all-trans רטינול/ROL המתקבל מתזונה הוא מרכיב חשוב הממלא תפקיד בתפקוד הראייה 1,2. כרומופור 11-cis retinal, מטבוליט של ויטמין A תזונתי, נקשר לאופסין קולטן מצומד חלבון G (GPCR) כדי לייצר את חלבון רטיניליידן, רודופסין, בפוטורצפטורים. כאשר האור נופל על העין, התצורה של רודופסין עוברת שינוי מהותי באמצעות המרה של רכיב הרשתית 11-cis-שלה לכל-trans-retinal. שינוי תצורה זה מפעיל מפל פוטוטרנסדוקציה בתוך הפוטורצפטורים של המוט, הממיר אור לאות חשמלי, המועבר לקליפת המוח הראייתית במוח דרך עצב הראייה 3,4,5,6,7,8,9,10 . ירידה בריכוזים של ROL בסרום ובעין יכולה להשפיע על היווצרות חלבון רטיניליידן, שבתורו גורם ללוקליזציה שגויה של אופסין, הצטברות אפופרוטאין אופסין, עיוורון לילה וניוון קולטני אור של מערכת ההפעלה, מה שמוביל לרטיניטיס פיגמנטוזה או אמאורוזיס מולד של לבר, שיכולים לגרום לעיוורון 3,10.

רטינול All-trans הוא צורת ההובלה הבסיסית של ויטמין A תזונתי והוא המקור שממנו נגזרים כל הרטינואידים הפונקציונליים והמטבוליטים התזונתיים של ויטמין A. הכבד משמש כאיבר העיקרי לאחסון ויטמין A בתזונה. רטינול בכבד מועבר דרך הסרום כקומפלקס שלו עם חלבון קושר רטינול 4 (RBP4). RBP4, המתבטא בעיקר בכבד, יוצר קומפלקס הולו-קומפלקס עם מצע רטינול וטרנסתירטין (TTR), אשר נכנס למחזור הדם 11,12,13,14,15,16,17. הדיווח על קולטן פני התא ל-RBP4 בשנות ה-70 של המאה ה-20 הוביל להשערה של חלבוני הובלת ממברנות המסייעים להובלת רטינואידים לתוך התאים והחוצה מהם. קולטן פני התא לרטינול הקשור ל-RBP4 (RBP4-ROL) זוהה כמגורה על ידי רטינול 6 רטינול (STRA6) באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) של העין. STRA6 נקשר לקומפלקס הולו-RBP4 במחזור הדם ומעביר את הרטינול הקשור ל-RBP4 על פני RPE לשימוש על ידי פוטורצפטורים18,19. מוטציות ב-STRA6 יכולות להוביל למספר עצום של מחלות ופנוטיפים הקשורים לירידה בריכוזי ROL עיניים. מוטציות STRA6 במהלך ההתפתחות יכולות להוביל לאנופתלמיה, מיקרופתלמיה ותסמינים אחרים שאינם עיניים החופפים לפנוטיפים הקשורים לתסמונת מתיו-ווד 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 מתבטא באיברים ורקמות שונים, כגון RPE בעין, אך לא בכל הרקמות26,27. למרות שהאתר העיקרי של אחסון רטינואיד הוא הכבד, STRA6 אינו מתבטא בכבד.

אלאפאט ועמיתיו גילו כי קולטן 4 לחלבון קושר רטינול 4 (RBPR2) קשר RBP4 עם זיקה גבוהה והיה אחראי לספיגה של רטינול הקשור ל-RBP4 בכבד, בדומה ל-STRA6 ב-RPE28. דווח כי RBPR2 חולק הומולוגיה מבנית עם STRA6 29,30,31. מוצע לקשור את RBP4 לשאריות S294, Y295 ו-L296 ב-RBPR2, תחום קושר חומצות אמינו שנשמר חלקית בין RBPR2 ל-STRA6 וכן 29,30,31. ממחקרים אלה, קולטני קרום ויטמין A כגון STRA6 ו- RBPR2, המכילים שאריות/תחומים קושרים חוץ-תאיים אחד או יותר, מוצעים לאינטראקציה עם RBP4-ROL במחזור הדם. קולטני הממברנה, אם כן, ממלאים תפקיד חשוב בקשירת הקולטן ל-RBP4 במחזור הדם להפנמת ROL לרקמות המטרה, כגון הכבד והעין.

בחלק הראשון של מחקר זה, השתמשנו בתהודה פלסמונית פני השטח (SPR) כדי לחקור את האינטראקציה של שני קולטני קרום ויטמין A (RBPR2 ו- STRA6) עם הליגנד הפיזיולוגי שלהם RBP431. זיקות הקישור וקינטיקה של אסוציאציה/דיסוציאציה של חלבון לקומפלקסים ליגנדים ניתנות למדידה בזמן אמת באמצעות SPR. מתודולוגיה זו נועדה לספק מידע קינטיצי, מבני וביוכימי קריטי על מוטיבים קושרי RBP4 ב-RBPR2 וב-STRA6, שהם קריטיים להבנת מצבים פתולוגיים של מחסור בוויטמין A31,32. כפי שהוזכר לעיל, ROL במחזור הדם מופנם לתוך RPE באמצעות STRA6 כדי ליצור את כרומופור 11-cis רשתית, אשר נקשר לאופסין כדי ליצור את חלבון רטינילidene, רודופסין, בפוטורצפטורים33. השתמשנו במתודולוגיות ספקטרופוטומטריה כדי לכמת את GPCR-opsin ואת קומפלקס הרשתית ליגנד 11-cis שלו בליזטים ברשתית מורין, שהוא קריטי להבנת מנגנונים של חלבון רטיניל מופחת, רודופסין, ברטיניטיס פיגמנטוזה או במצבים פתולוגיים עיניים מולדים של אמאורוזיסמולד 34. באופן כללי, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מיושמים כדי לחקור במבחנה את ההשלכות הפיזיולוגיות של RBP4, STRA6 או RBPR2 מוטנטיים בהשפעה על הומאוסטזיס ויטמין A מערכתי ועיני או על ההשפעה של רודופסין מוטנטי או חלבוני מחזור רטינואידי על תפקוד הראייה35,36.

Protocol

1. מתודולוגיית תהודה פלסמונית פני השטח (SPR)

  1. הכנה וטיהור של חלבון RBP4 עכבר
    1. תכנן פריימרים ליצירת עכבר באורך מלא RBP4 (msRBP4) cDNA (NCBI Reference Sequence: NM_001159487.1). שכפל את msRBP4 cDNA לתוך pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector and express in BL-21 DE3 cells (Table of Materials).
    2. הפוך את התאים המוסמכים BL-21 DE3 (על פי פרוטוקול היצרן) עם וקטור msRBP4-pET28a קשור ולאחר מכן צלחת על ציר לוריא-ברטאני (LB) לוחות אגר המכילים Kanamycin 50 מיקרוגרם / מ"ל30,37. לדגור על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ולסנן מושבות חיוביות למחרת.
    3. בחרו מושבה בודדת ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ב-5 מ"ל של ציר LB המכיל Kanamycin 50 מיקרוגרם/מ"ל.
    4. עבור תרבית משנית ב 500 מ"ל של מרק LB המכיל Kanamycin 50 מיקרוגרם / מ"ל, להשתמש 1% נפח של תרבית ראשונית (משלב 1.1.3.) לדגור ב 37 ° C במשך 3-4 שעות; בדוק את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר. באופן אידיאלי, המשך אם ערך OD הוא בין 0.6 ל- 1 כדי לגרום לביטוי חלבון עם IPTG של 0.5 mM ב- 24 ° C למשך הלילה.
    5. השתמש בריכוזי IPTG מרובים של 0.1-1 mM וטווח טמפרטורות של 16-30 ° C כדי למטב את הביטוי והיציבות של msRBP4.
    6. צנטריפוגה את התרבית (משלב 1.1.5.) ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות, להשליך את supernatant, ולשמור את הגלולה על קרח.
    7. הומוגניזציה של הגלולה עם חיץ ליזיס (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 10% גליצרול, 0.5 mM PMSF ומעכבי פרוטאז [pH 8.0]). סוניק את הליזט למחזור הפעלה וכיבוי של 15 שניות ו- 30 שניות באמצעות הומוגנייזר עם פלט של 250 וואט ותדר פלט של 40-50% 20 קילוהרץ. חזור על הפעולה 5x.
    8. הסר את פסולת התאים ואת התאים שלא עברו ניתוח באמצעות צנטריפוגה במהירות של 16,000 × גרם למשך 20 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט של הליזט דרך עמודת ניקל בשווי חיץ של נת"ע.
    9. שטפו את העמוד עם חיץ ליזיס (משלב 1.1.8) המכיל 30 mM imidazole.
    10. בשברים, יש לבודד את חלבון MSRBP4 הקשור באמצעות חיץ המכיל 250 mM imidazole. הפעל את השברים המדוללים ונטר חזותית את כמות החלבון עם ג'ל פוליאקרילאמיד SDS 12%, מוכתם ב- Coomassie Brilliant Blue R-250 במתנול: מים: חומצה אצטית (45: 45: 10) פתרון ו de-stain עם תמיסה ללא כתם קומאסי מתנול: מים: חומצה אצטית (45: 45: 10).
    11. אחסן את השברים שאינם בשימוש ובצע דיאליזה של השברים המאוגמים באמצעות קלטת דיאליזה 10K של 10 kDa MWCO.
    12. הערך את איכות המקטע המחויג בג'ל SDS-PAGE 12% וכמת את ריכוז החלבון.
      הערה: חלבון Apo-RBP4 שימש בניתוח SPR. ליצירת הולו-RBP4 (RBP4-רטינול), עיין בפרוטוקולים מפורטים שפורסמו במקום אחר36,37.
  2. אימות ראשוני של פפטידים RBPR2 ו- STRA6 עם RBP4 למבנה ואינטראקציה על ידי בדיקת פלואורסצנטיות טריפטופן וספקטרוסקופיית דיכרואיזם מעגלי (CD)
    1. בדיקת פלואורסצנטיות טריפטופן
      1. השתמש בכלי המקוון לניתוח הרכב חלבונים (https://web.expasy.org/protparam/) והדבק את רצף חומצות האמינו בקוד בן אות אחת כדי להעריך את ההרכב המבני של חלבון RBP4 רקומביננטי ואת הפפטידים הבודדים של RBPR2 ו- STRA6 כדי לקבוע את שאריות חומצות האמינו טריפטופן בפפטידים ובחלבונים בודדים (טבלה של חומרים).
      2. לחץ על כפתור פרמטרי המחשוב והערך את הרכב חומצות האמינו עבור שאריות טריפטופן (Trp).
        הערה: שאריות טריפטופן חייבות להימצא בפפטידים או חלבונים בודדים המנותחים.
      3. יש לדלל את הפפטידים RBPR2 ו-STRA6 הבודדים בריכוזים מיקרומולאריים שונים ולדגור בנפרד עם 3 מיקרוגרם msRBP4 בצלחת של 96 בארות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הלהיבו את התערובת ב-290 ננומטר וסרקו את הפליטה מאורך גל של 300 ננומטר עד 400 ננומטר.
      4. נרמל את הנתונים עם Blank (מאגר בלבד, ללא פפטיד וללא חלבון) ותנאי בקרת פפטיד (ללא חלבון) ו- plot.
        הערה: תוספת פלואורסצנטיות של טריפטופן לאחר חשיפה לריכוז פפטידים נמוך עד גבוה מצביעה על אינטראקציה חיובית בין שני הפפטידים הבודדים לבין חלבון RBP4.
    2. ספקטרוסקופיית דיכרואיזם מעגלי (CD)
      1. לדלל את הפפטידים הבודדים ואת חלבון RBP4 רקומביננטי במאגר PBS 1x, pH 7.0. השתמש בריכוזים שונים של פפטידים RBPR2 ו- STRA6 וחלבון RBP4 מ- 0.1 עד 10 מיקרוגרם/מ"ל לבדיקת איכות, כמתואר להלן.
      2. הוסף פפטידים מדוללים בודדים וחלבון בקובט באורך נתיב של 0.1 ס"מ ומדוד את ספיגת התקליטור/אליפטיות באמצעות ספקטרופוטומטר CD (195-250 ננומטר). השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את האליפסטיות הממוצעת של השאריות (θ).
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S מייצג את אות התקליטור ב-mθ; mRw מייצג את מסת השאריות הממוצעת; c מייצג את ריכוז החלבון במ"ג/מ"ל; ו- L מייצג את אורך הנתיב בס"מ.
      3. חשב את אחוז השינוי במבנה המולקולה באמצעות BeStSel Secondary Structure Analysis to Protein Fold Prediction by CD Spectroscopy (https://bestsel.elte.hu).
        הערה: המבנה המשני מציין את הקיפול הנכון ואת אישורי השימור החיוניים למחקר האינטראקציה ולתוצאות האינטראקציות. בדוק את המבנה החזוי של התחום והמשך הלאה עם מחקר האינטראקציה.

2. ניתוח SPR כדי לקבוע את זיקות הקישור ואת הפרמטרים הקינטיים של קולטני קרום ויטמין A (RBPR2 ו- STRA6) עם הליגנד הפיזיולוגי שלהם RBP4

  1. לצורך אימוביליזציה של RBP4 על פני השטח של שבב CM5, אנו משתמשים בשבב חיישן SPR, הנושא מקשר קרבוקסימתיל דקסטרן המורחב לגודל של ~100 ננומטר המחובר באופן קוולנטי על משטח זהב. בנוכחות 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) ממיר את קבוצות הקרבוקסיל על פני השטח של השבב לאסטרים N-Hydroxysuccinimide, אשר מגיבים באופן ספונטני עם קבוצות אמין של חומצות אמינו וחלבונים, מה שמאלץ את הליגנד להיקשר באופן קוולנטי על פני השטח של השבב (טבלה של חומרים).
    1. השתיקו את חלבון MSRBP4 המטוהר על שבב החיישן (איור 1 ואיור 2). בתפריט הפעלה של התוכנה, בחר את האשף והמשך באפשרות האימוביליזציה . לדלל את הליגנד (חלבון msRBP4 המתקבל משלב 1.1) במאגר אימוביליזציה (10 mM נתרן אצטט חוצץ, pH 5.0) ל 10 מיקרוגרם / מ"ל (4 μL של ליגנד + 396 μL של חיץ) ו aliquot את ריאגנטים צימוד בבקבוקונים. פתח את חלון אשף הגדרת אימוביליזציה מפקדת התוכנה, בחר שבב CM5 ואפשרות השתק תא זרימה 2 ורמת יעד של יחידת תגובה של 1,200 (RU) להשגת Rmax של 30 RU במחקר הקינטי ותמיסת השטיפה: אתנולמין. הזן את השם RBP4 ולחץ על הבא.
      הערה: אופציונלי: תיבת הדו-שיח 'הכנות מערכת' עבור האפשרות Prime לפני הפעלה אינה נדרשת אם קודם לכן בוצעה קודם לכן הכנה עם PBST חוצץ ריצה (תמיסת מלח חוצצת פוספט עם תמיסת דטרגנט 0.05% Tween 20).
    2. בתיבת הדו-שיח מיקום ארון תקשורת , לחץ על הוצא ארון תקשורת. קח את המדף והנח את הבקבוקונים עם אמצעי אחסון מוקצים עבור כל מגיב: 156 μL של msRBP4, 177 μL של אתנולמין, 89 μL של EDC, 89 μL של NHS, בקבוקון ריק. הכנס את ארון התקשורת עם בקבוקונים לדוגמה ולחץ על אישור ועל הבא.
    3. בתיבת הדו-שיח Prepare Run Protocol , לחץ על Start and Save.
  2. הגדרת בדיקה קינטית של פפטידים RBPR2 ו- STRA6
    1. לדלל באופן סדרתי את הפפטידים RBPR2, RBPR2 מוטנטי ו-STRA6 (מסונתזים כימית בעבר31 ורשומים בטבלת החומרים) במאגר ריצה בטווח של 0.8-26.6 מיקרומטר.
    2. פתח את תוכנת הבקרה ובחר Kinetics/Affinity wizard. לחץ על קובץ | פתח תבנית ובחר Kinetics/Affinity. הזן את נתיב זרימת הדו-שיח של רצף ההזרקה 2-1 (תא זרימה 2 כפעיל ותא זרימה 1 כהפניה), סמן את סוג השבב CM5 ולחץ על הבא. בתיבת הדו-שיח של ההתקנה, בדוק את הפעל מחזורי אתחול, הזן פתרון: מאגר ומחזורים: ולחץ על הבא.
    3. בתיבת הדו-שיח פרמטרים של הזרקה , הזן את הערכים עבור פרמטרים לדוגמה : זמן מגע: 120 שניות, קצב זרימה 30 מיקרוליטר/דקה, זמן דיסוציאציה 300 שניות; עבור פרמטרים רגנרציה : הזן את שם פתרון הרגנרציה: גליצין-HCl (pH 2.5), זמן מגע: 30 שניות, קצב זרימה: 30 מיקרוליטר/דקה ולחץ על הבא.
    4. בתיבת הדו-שיח דגימות, הזן את שם הפפטידים, המשקל המולקולרי והריכוזים ולחץ על הבא. בתיבת הדו-שיח מיקום ארון תקשורת, הקצה את הפפטידים המדוללים כדגימות בודדות ~ 120 μL בריכוזים שונים 1 עד 100 μM ו- ~ 230 μL של חיץ, ~ 120 μL של Buffer, ו- ~1,000 μL של גליצין, pH 2.5, למיקומים על המדף. לחץ על הוצא מדף והכנס את כל הבקבוקונים. לחץ על הבא, ובתיבת הדו-שיח הכן פרוטוקול הפעלה, לחץ על התחל, הזן שם קובץ ושמור (איור 2).
    5. בתוכנה, לחץ על תפריט התחלה ובחר הערכה. בחר פתח את הקובץ בתוכנה, ומתפריט הבחירה הנפתח, בחר Fc2-1 כדי לנתח את תא ההפניה חיישן פעיל ריק מופחת עבור שלבי השיוך והדיסוציאציה של הפפטידים msRBP4 ו- msRBPR2 ו - msSTRA6 המוטנטים.
    6. לחץ על הלחצן הנפתח Kinetics/Affinity ובחר Surface bound; כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח בחירת עקומות , סמן את העמודה כלול בטבלה ולחץ על הבא. בחר בתיבת הדו-שיח 'נתונים ' כדי להציג חיישנים ריקים שהוחסרו; לחצו על 'קינטיקה וזיקה', שמרו על פרמטרי ברירת המחדל ולחצו על האפשרות 'התאמה ' להתאמת עקומה. בדוק את הכרטיסיה דוח עבור קבוע דיסוציאציה שיווי משקל Kd ו- Ka או Kבקצב אסוציאציה ו- Kd או Kמחוץ לשיעור הדיסוציאציה. שמרו את חיישן הנתונים Kinetics בתבנית המופרדת באמצעות טאבים .txt והשתמשו בערכים כדי להתוות גרפים (איור 3).
    7. כדי לקבוע את קבוע קינטיקה הזיקה Kd (ריכוז ליגנד הנקשר למחצית הקולטנים בשיווי משקל), העתק והדבק את עמודות הנתונים בקובץ תבנית .txt שנוצר מתרשים הערכה ל- XY המשמש בתוכנה. לחץ על נתח ורגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה), בדוק את עמודת הנתונים ולחץ על אישור. בתיבת הדו-שיח של הפרמטר, לחץ על רוויית איגוד ועל אתר אחד מודל התאמת איגוד ספציפי עם הנוסחה של:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      כאשר Bmax הוא המספר המרבי של אתרי קישור (יחידת תגובה), X הוא ריכוז הפפטידים, ו-Y הוא הקשירה (יחידת תגובה) (איור 3).

3. מתודולוגיית ספקטרופוטומטריה לכימות קומפלקס חלבון הרשתית GPCR-11- cis (חלבון רטיניל רודופסין) בליזטים ברשתית

  1. העבירו את קבוצת העכברים שנקבעה מראש המורכבת מעכברים בוגרים WT-C57BL/6J לחדר החשוך.
  2. חושך להתאים את העכברים במשך לילה במשך 12-16 שעות, ותחת אור אדום, מניחים את העכבר בתא המתת חסד ולפתוח את שסתום גז CO2 על הרגולטור ל 5 ליטר / דקה למשך ~ 5 דקות. להבטיח מוות על ידי הפעלת לחץ על הצוואר והזנב המשוך לאחור (נקע צוואר הרחם).
  3. לחנך את גלובוס העיניים ולהפוך את העיניים להומוגניות בחיץ קר כקרח המכיל פרופאן ביס-טריס 20 mM (1,3-bis (tris(hydroxymethyl)methylamino)propane; BTP) pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ועם מעכב פרוטאז (טבלה של חומרים).
  4. צנטריפוגה הומוגנט במשך 15 דקות ב 16000 x גרם ב 4 ° C, להשליך את supernatant המכיל חלבונים cytosolic מסיסים במים. יש להשהות מחדש ולהמיס את חלבוני הממברנה והממברנה במאגר המכיל 20 mM n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM), 20 mM bis-tris propane (BTP) pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ועם מעכב פרוטאז למשך שעה אחת ב-4°C על פלטפורמה מסתובבת.
  5. צנטריפוגה את חלק הממברנה resolubilized במשך 1 שעה ב 16000 x גרם, 4 ° C. מערבבים את הסופרנאטנט עם 30 μL של חרוזי נוגדן Rho 1D4 ודגרים במשך שעה אחת ב-4°C על פלטפורמה מסתובבת.
  6. באמצעות מעמד מגנטי, להפריד את המשיכה כלפי מטה באמצעות חרוזים, להשליך את supernatant, ולשטוף את החרוזים עם חיץ 20 mM bis-tris propane (BTP) pH 7.4, 500 mM NaCl, ו 2 mM DDM.
  7. האטו את חלבון הרודופסין על-ידי דגירה במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר עם חיץ 20 mM bis-tris propane (BTP) pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM המכיל 0.2 מ"ג/מ"ל 1D4 פפטיד (-TETSQVAPA) (איור 4 ואיור 5).
  8. נתח את האלוטה לספיגה מ-200 ננומטר עד 800 ננומטר באמצעות קוורץ מלבני, תת-מיקרו, קוורץ, צמצם 2 מ"מ, אורך נתיב 10 מ"מ, קובטה 50 מיקרוליטר בהגדרת סריקה מהירה עם ספקטרופוטומטר.
    הערה: השתמשו רק בקובטות קוורץ איכותיות (איור 4).
  9. כדי לאמת ולקבוע איכות, בדוק וחשף את האלוטה לאור בהיר למשך דקה אחת, ולאחר מכן חזור על שלב 3.8.
  10. החסרו את הספיגה הריקה וחשבו את היחס בין ספקטרום הספיגה המנותח לספיגה של 500 ננומטר עבור אופסין קשור רשתית של 11 סיס , 380 ננומטר עבור אופסין הקשור לרשתית טרנס שנחשף לאור ו-280 ננומטר עבור חלבון אפו-אופסין נטול ליגנד (איור 6). האופסין החופשי ללא רשתית ליגנד נותן ספיגה בסיסית של 500 ננומטר.
  11. כדי לכמת את ריכוז הרודופסין, השתמש בחוק באר-למברט:
    A=ε· C·l או C=A/ε·l
    כאשר A הוא הספיגה, ε מקדם ההכחדה המולרי (רודופסין ε500 = 40,600 M−1 ס"מ−1 בחינם אפו אופסין ε280 = 81,200 M−1 ס"מ−1), C הוא הריכוז, ואורך נתיב l .
  12. לכימות ליגנד-אופסין באחוזים, השתמש ביחס של A280/A500.
  13. התווה את ספקטרום הבליעה הריק שהוחסר וחשב את ערך האופסין החופשי32.
  14. חישוב ריכוז הרודופסין באמצעות מקדם ההכחדה ε500 = 40600 M−1 cm−1. ריכוז האופסין נטול הליגנד מחושב באמצעות חוק באר-למברט באמצעות מקדם ההכחדהε 280 = 81,200 M−1 cm−1.

תוצאות

שיטות כמותיות מתוארות כדי לחקור אינטראקציות חלבון-ליגנד של קולטני קרום ויטמין A ואופסין פוטורצפטור עם ליגנדות פיזיולוגיות בהתאמה. העכבר הרקומביננטי RBP4 צריך לבוא לידי ביטוי ב- E. coli ובחלבון המטוהר המשמש כליגנד מצומד על שבב SPR. RBPR2, STRA6 והמוטציה S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extra...

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
מתודולוגיית SPR
במידול סיליקו וניתוח עגינה: המבנה החזוי של RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) ו- STRA6, והמבנה הידוע עבור מסדהנתונים MS RBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa), צריכים לשמש למחקר עגינה29,31. בנוסף, יש להשתמ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד, או בהחלטה לפרסם את התוצאות.

Acknowledgements

המחברים מודים לד"ר ביאטה יסטרזבסקה, Ph.D. (המחלקה לפרמקולוגיה, אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב, אוהיו) על עצתה לגבי פרוטוקול ספיגת רודופסין. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH-NEI (EY030889 ו- 3R01EY030889-03S1) ובחלקו, על ידי קרנות הזנק של אוניברסיטת מינסוטה ל- G.P.L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

References

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676 (2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229 (2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236 (2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371 (2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099 (2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657 (2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293 (2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169 (2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

212RBPR2STRA6RBP4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved