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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir zwei quantitative Methoden zur Untersuchung der Protein-Liganden-Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Photorezeptor-Opsin mit ihren jeweiligen physiologischen Liganden.

Zusammenfassung

Die Verteilung von Vitamin A/all-trans-Retinol (ROL) über die Nahrung im Körper ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Retinoidfunktion in peripheren Geweben und die Bildung des Retinyliden-Proteins für die Sehfunktion. RBP4-ROL ist der Komplex von ROL mit dem Retinol-bindenden Protein 4 (RBP4), das im Blut vorhanden ist. Zwei Membranrezeptoren, Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) in der Leber und STimuliert durch Retinsäure 6 Retinol (STRA6) im Auge, binden zirkulatorisches RBP4 und dieser Mechanismus ist entscheidend für die Internalisierung von ROL in die Zellen. Die Etablierung von Methoden zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Kinetik ist essentiell für das Verständnis der physiologischen Funktion von Vitamin-A-Rezeptoren für die Retinoid-Homöostase. Mit Hilfe von Oberflächenplasmonenresonanz-Assays (SPR) können wir die Bindungsaffinitäten und kinetischen Parameter von Vitamin-A-Membranrezeptoren mit seinem physiologischen Liganden RBP4 analysieren.

Diese Methoden können neue strukturelle und biochemische Informationen von RBP4-Bindungsmotiven in RBPR2 und STRA6 aufdecken, die für das Verständnis pathologischer Zustände von Vitamin-A-Mangel entscheidend sind. Im Auge wird internalisiertes ROL zu 11-cis Retinal metabolisiert, dem visuellen Chromophor, das in Photorezeptoren an Opsin bindet, um das Retinylidenprotein Rhodopsin zu bilden. Die Absorption von Licht bewirkt die cis-zu-trans-Isomerisierung von 11-cis-Retinal, was zu Konformationsänderungen im Rhodopsin und der anschließenden Aktivierung der Phototransduktionskaskade führt. Verminderte Konzentrationen von Serum- und okulärer ROL können die Bildung von Retonylidenprotein beeinflussen, was wiederum zu einer Rhodopsin-Fehllokalisation, einer Apoprotein-Opsin-Akkumulation, Nachtblindheit und einer Degeneration des äußeren Photorezeptorsegments führen kann, was zu Retinitis Pigmentosa oder Leber Congenital Amaurose führt.

Daher sind spektrophotometrische Methoden zur Quantifizierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors Opsin-11-cis-Netzhautkomplex in der Netzhaut entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der retinalen Zelldegeneration in den oben genannten pathologischen Zuständen. Mit diesen umfassenden Methoden werden die Forscher in der Lage sein, die Vitamin-A-Versorgung über die Nahrung bei der Aufrechterhaltung der systemischen und okulären Retinoid-Homöostase besser zu beurteilen, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Retinyliden-Proteinkonzentrationen in Photorezeptoren entscheidend ist, was für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion beim Menschen entscheidend ist.

Einleitung

Über die Nahrung gewonnenes Vitamin A/all-trans-Retinol/ROL ist eine wichtige Komponente, die eine Rolle bei der Sehfunktion spielt 1,2. Das Chromophor 11-cis Retinal, ein Metabolit von Vitamin A in der Nahrung, bindet an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Opsin, um das Retinyliden-Protein Rhodopsin in den Photorezeptoren zu erzeugen. Wenn Licht auf das Auge fällt, erfährt die Konfiguration von Rhodopsin eine grundlegende Veränderung durch die Umwandlung seiner 11-cis-retinalen Komponente in die all-trans-retinal. Diese Konfigurationsänderung löst eine Phototransduktionskaskade innerhalb der Photorezeptoren der Stäbchen aus, die Licht in ein elektrisches Signal umwandelt, das über den Sehnerv an den visuellen Kortex im Gehirn weitergeleitet wird 3,4,5,6,7,8,9,10 . Verminderte Konzentrationen von Serum- und okulärer ROL können die Bildung von Retanylidenprotein beeinflussen, was wiederum zu einer Opsin-Fehllokalisation, einer Apoprotein-Opsin-Akkumulation, Nachtblindheit und einer Degeneration des Photorezeptor-OS führt, was zu Retinitis Pigmentosa oder Leber Congenital Amaurose führt, die zur Erblindung führen kann 3,10.

All-trans-Retinol ist die grundlegende Transportform von Vitamin A in der Nahrung und es ist die Quelle, aus der alle funktionellen Retinoide und Vitamin-A-Metaboliten in der Nahrung gewonnen werden. Die Leber dient als primäres Organ für die Vitamin-A-Speicherung über die Nahrung. Leberretinol wird über das Serum als dessen Komplex mit dem Retinol-bindenden Protein 4 (RBP4) transportiert. RBP4, das hauptsächlich in der Leber exprimiert wird, bildet mit dem Retinolsubstrat und Transthyretin (TTR) einen Holo-Komplex, der in den Kreislauf gelangt 11,12,13,14,15,16,17. Der Bericht über einen Zelloberflächenrezeptor für RBP4 in den 1970er Jahren führte zu der Hypothese, dass Membrantransportproteine den Transport von Retinoiden in und aus Zellen unterstützen. Der Zelloberflächenrezeptor für RBP4-gebundenes Retinol (RBP4-ROL) wurde im retinalen Pigmentepithel (RPE) des Auges als STimuliert durch Retinsäure 6 Retinol (STRA6) identifiziert. STRA6 bindet an den zirkulatorischen Holo-RBP4-Komplex und transportiert das RBP4-gebundene Retinol über das RPE, um von Photorezeptoren genutzt zu werden18,19. Mutationen in STRA6 können zu einer Vielzahl von Krankheiten und Phänotypen führen, die mit reduzierten okulären ROL-Konzentrationen verbunden sind. STRA6-Mutationen während der Entwicklung können zu Anophthalmie, Mikrophthalmie und anderen nicht-okulären Symptomen führen, die sich mit Phänotypen überschneiden, die mit dem Matthew-Wood-Syndrom assoziiert sind 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 wird in verschiedenen Organen und Geweben exprimiert, wie z.B. dem RPE im Auge, aber nicht in allen Geweben26,27. Obwohl der primäre Ort der Retinoidspeicherung die Leber ist, wird STRA6 nicht in der Leber exprimiert.

Alapatt und Kollegen entdeckten, dass der Retinol-Bindungsprotein-4-Rezeptor 2 (RBPR2) RBP4 mit hoher Affinität bindet und für die Aufnahme von RBP4-gebundenem Retinol in der Leber verantwortlich ist, ähnlich wie STRA6 im RPE28. Es wurde berichtet, dass RBPR2 die strukturelle Homologie mit STRA6teilt 29,30,31. Es wird vorgeschlagen, dass RBP4 an die Reste S294, Y295 und L296 auf RBPR2 bindet, einer Aminosäurebindungsdomäne, die teilweise auch zwischen RBPR2 und STRA6 konserviert ist 29,30,31. Aus diesen Studien wird vorgeschlagen, dass Vitamin-A-Membranrezeptoren wie STRA6 und RBPR2, die eine oder mehrere extrazelluläre Bindungsreste/-domänen enthalten, mit zirkulatorischem RBP4-ROL interagieren. Membranrezeptoren spielen daher eine wichtige Rolle bei der Rezeptorbindung an zirkulatorisches RBP4 für die ROL-Internalisierung in Zielgewebe wie Leber und Auge.

Im ersten Teil dieser Studie untersuchten wir mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) die Interaktion von zwei Vitamin-A-Membranrezeptoren (RBPR2 und STRA6) mit ihrem physiologischen Liganden RBP431. Die Bindungsaffinitäten und die Assoziations-/Dissoziationskinetik von Protein-Liganden-Komplexen können mit Hilfe von SPR in Echtzeit gemessen werden. Diese Methodik zielte darauf ab, kritische kinetische, strukturelle und biochemische Informationen über RBP4-Bindungsmotive in RBPR2 und STRA6 zu liefern, die für das Verständnis pathologischer Zustände von Vitamin-A-Mangel entscheidend sind31,32. Wie oben erwähnt, wird zirkulatorisches ROL über STRA6 in das RPE internalisiert, um das Chromophor 11-cis Retinal zu erzeugen, das an Opsin bindet, um das Retinylidenprotein Rhodopsin in Photorezeptorenzu erzeugen 33. Wir verwendeten spektrophotometrische Methoden, um das GPCR-Opsin und seinen Liganden 11-cis-Retina-Komplex in retinalen Lysaten von Mäusen zu quantifizieren, was für das Verständnis der Mechanismen des reduzierten Retinyliden-Proteins, Rhodopsin, bei retinitis pigmentosa oder Leber kongenitalen Amaurosa okulären pathologischen Zuständen entscheidend ist34. Im Allgemeinen können diese Protokolle angewendet werden, um in vitro die physiologischen Auswirkungen von mutierten RBP4, STRA6 oder RBPR2 auf die Beeinflussung der systemischen und okulären Vitamin-A-Homöostase oder den Einfluss von mutierten Rhodopsin- oder Retinoid-Zyklusproteinen auf die Sehfunktion zu untersuchen35,36.

Protokoll

1. Methodik der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

  1. Aufbereitung und Aufreinigung des RBP4-Proteins der Maus
    1. Entwerfen Sie Primer zur Generierung von Maus-RBP4 (msRBP4) cDNA in voller Länge (NCBI-Referenzsequenz: NM_001159487.1). Klonieren Sie die msRBP4 cDNA in einen pET28a His-Tag Kanamycin-resistenten Expressionsvektor und exprimieren Sie sie in BL-21 DE3-Zellen (Table of Materials).
    2. Die BL-21 DE3-kompetenten Zellen (gemäß dem Protokoll des Herstellers) werden mit einem ligierten msRBP4-pET28a-Vektor transformiert und dann auf Luria-Bertani (LB) Bouillon-Agarplatten mit Kanamycin 50 μg/ml30,37 aufgebracht. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator und screenen Sie am nächsten Tag nach positiven Kolonien.
    3. Eine einzelne Kolonie wird entnommen und über Nacht bei 37 °C in 5 ml LB-Bouillon mit 50 μg/ml Kanamycin inkubiert.
    4. Für die Sekundärkultur in 500 ml LB-Bouillon mit Kanamycin 50 μg/ml ist 1 Vol.-% der Primärkultur (aus Schritt 1.1.3.) zu verwenden und 3-4 h lang bei 37 °C zu inkubieren; Überprüfen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer. Idealerweise ist bei einem OD-Wert zwischen 0,6 und 1 vorzugehen, um über Nacht eine Proteinexpression mit 0,5 mM IPTG bei 24 °C zu induzieren.
    5. Verwenden Sie mehrere IPTG-Konzentrationen von 0,1-1 mM und einen Temperaturbereich von 16-30 °C, um die Expression und Stabilität von msRBP4 zu optimieren.
    6. Die Kultur (aus Schritt 1.1.5.) bei 16.000 × g für 10 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet auf Eis legen.
    7. Homogenisieren Sie das Pellet mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 10 % Glycerin, 0,5 mM PMSF und Proteaseinhibitoren [pH 8,0]). Beschallung des Lysats für einen 15 s EIN- und 30 s AUS-Zyklus mit einem Homogenisator mit einer Ausgangsleistung von 250 Watt und einer Ausgangsfrequenz von 40-50 % 20 kHz. 5x wiederholen.
    8. Entfernen Sie die Zelltrümmer und unlysierten Zellen durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 20 Minuten. Führen Sie den Überstand des Lysats durch eine pufferäquilibrierte Nickel-NTA-Säule.
    9. Die Säule wird mit Lysepuffer (aus Schritt 1.1.8) gewaschen, der 30 mM Imidazol enthält.
    10. In Fraktionen eluiert das gebundene msRBP4-Protein mit einem Puffer, der 250 mM Imidazol enthält. Führen Sie die eluierten Fraktionen durch und überwachen Sie die Proteinmenge visuell mit einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel, das mit Coomassie Brilliant Blue R-250 in der Lösung Methanol:Wasser:Essigsäure (45:45:10) gefärbt wurde, und entfärben Sie es mit einer Lösung ohne Coomassie Methanol:Wasser:Essigsäure (45:45:10).
    11. Poolen Sie die ungenutzten Fraktionen und dialysieren Sie die gepoolten Fraktionen mit einer 10K-Dialysekassette von 10 kDa MWCO.
    12. Bewerten Sie die Qualität der dialysierten Fraktion auf einem 12%igen SDS-PAGE-Gel und quantifizieren Sie die Proteinkonzentration.
      HINWEIS: In der SPR-Analyse wurde das Apo-RBP4-Protein verwendet. Zur Erzeugung von Holo-RBP4 (RBP4-Retinol) siehe detaillierte Protokolle, die an anderer Stelle veröffentlicht wurden36,37.
  2. Erste Validierung von RBPR2- und STRA6-Peptiden mit RBP4 für Struktur und Interaktion mittels Tryptophan-Fluoreszenzassay und Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie
    1. Tryptophan-Fluoreszenz-Assay
      1. Verwenden Sie das Online-Tool zur Analyse der Proteinzusammensetzung (https://web.expasy.org/protparam/) und fügen Sie die Aminosäuresequenz in einen Ein-Buchstaben-Code ein, um die strukturelle Zusammensetzung des rekombinanten RBP4-Proteins und der einzelnen Peptide von RBPR2 und STRA6 zu beurteilen und die Tryptophan-Aminosäurereste in den einzelnen Peptiden und Proteinen zu bestimmen (Materialtabelle).
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter berechnen und bewerten Sie die Aminosäurezusammensetzung für Tryptophan (Trp)-Reste.
        HINWEIS: Tryptophan-Rückstände müssen in den einzelnen Peptiden oder Proteinen, die analysiert werden, vorhanden sein.
      3. Verdünnen Sie die einzelnen RBPR2- und STRA6-Peptide in verschiedenen mikromolaren Konzentrationen und inkubieren Sie einzeln mit 3 μg msRBP4 in einer 96-Well-Platte bei Raumtemperatur für 5 min. Regen Sie die Mischung bei 290 nm an und scannen Sie die Emission von 300 nm bis 400 nm Wellenlänge.
      4. Normalisieren Sie die Daten mit der Bedingung Blank (nur Puffer, kein Peptid und kein Protein) und der Peptidkontrollbedingung (kein Protein) und plotten Sie.
        HINWEIS: Das Inkrement der Tryptophan-Fluoreszenz bei Exposition gegenüber einer niedrigen bis hohen Peptidkonzentration deutet auf eine positive Wechselwirkung zwischen den beiden einzelnen Peptiden und dem RBP4-Protein hin.
    2. Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD)
      1. Verdünnen Sie die einzelnen Peptide und das rekombinante RBP4-Protein in 1x PBS-Puffer, pH 7,0. Verwenden Sie verschiedene Konzentrationen von RBPR2- und STRA6-Peptiden und RBP4-Protein von 0,1 bis 10 μg/ml für eine Qualitätskontrolle, wie unten beschrieben.
      2. Geben Sie einzelne verdünnte Peptide und Proteine in eine 0,1 cm dicke Küvette und messen Sie die CD-Absorption/Elliptizität mit einem CD-Spektralphotometer (195-250 nm). Verwenden Sie die folgende Formel, um die mittlere Restelliptizität (θ) zu berechnen.
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S steht für das CD-Signal in mθ; mRw steht für die mittlere Restmasse; c steht für die Konzentration des Proteins in mg/ml; und l steht für die Weglänge in cm.
      3. Berechnen Sie die prozentuale Änderung der Molekülstruktur mit der BeStSel-Sekundärstrukturanalyse zur Proteinfaltungsvorhersage durch CD-Spektroskopie (https://bestsel.elte.hu).
        HINWEIS: Die Sekundärstruktur zeigt die richtige Faltung und die konservierten Bestätigungen an, die für die Interaktionsstudie und das Ergebnis der Wechselwirkungen entscheidend sind. Überprüfen Sie die vorhergesagte Struktur der Domäne und fahren Sie mit der Interaktionsstudie fort.

2. SPR-Analyse zur Bestimmung der Bindungsaffinitäten und kinetischen Parameter von Vitamin-A-Membranrezeptoren (RBPR2 und STRA6) mit ihrem physiologischen Liganden RBP4

  1. Für die Immobilisierung von RBP4 auf der CM5-Chipoberfläche verwenden wir den SPR-Sensorchip, der einen auf eine Größe von ~100 nm erweiterten Carboxymethyldextran-Linker trägt, der kovalent an eine Goldoberfläche gebunden ist. In Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) wandelt N-Hydroxysuccinimid (NHS) die Carboxylgruppen auf der Chipoberfläche in N-Hydroxysuccinimidester um, die spontan mit den Amingruppen von Aminosäuren und Proteinen reagieren und den Liganden zwingen, sich kovalent an die Chipoberfläche zu binden (Table of Materials).
    1. Immobilisieren Sie das gereinigte msRBP4-Protein auf dem Sensorchip (Abbildung 1 und Abbildung 2). Wählen Sie im Menü Ausführen der Software den Assistenten und fahren Sie mit der Option Immobilisierung fort. Der Ligand (msRBP4-Protein aus Schritt 1.1) wird in Immobilisierungspuffer (10 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0) auf 10 μg/ml (4 μl Ligand + 396 μl Puffer) verdünnt und die Kupplungsreagenzien in Fläschchen aliquotiert. Öffnen Sie das Fenster des Immobilisierungs-Setup-Assistenten in der Softwaresteuerung, wählen Sie CM5-Chip und dann die Option Immobilisierung der Flusszelle 2 und den Zielwert von 1.200 Response Unit (RU) für das Erreichen einer Rmax von 30 RU in der kinetischen Studie und Waschlösung: Ethanolamin. Geben Sie den Namen RBP4 ein und klicken Sie auf Weiter.
      HINWEIS: Optional: Das Dialogfeld "Systemvorbereitungen " für die Option "Vor dem Lauf anfüllen " ist nicht erforderlich, wenn zuvor eine Grundierung mit dem Laufpuffer PBST (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit einer 0,05 %igen Tween-20-Detergenzienlösung) durchgeführt wurde.
    2. Klicken Sie im Dialogfeld Rack-Position auf Rack auswerfen. Nehmen Sie das Gestell und platzieren Sie die Fläschchen mit den für jedes Reagenz zugewiesenen Volumina: 156 μl msRBP4, 177 μl Ethanolamin, 89 μl EDC, 89 μl NHS und ein leeres Fläschchen. Setzen Sie das Rack mit den Probenfläschchen ein und klicken Sie auf OK und Weiter.
    3. Klicken Sie im Dialogfeld "Prepare Run Protocol " auf "Start and Save".
  2. Aufbau des kinetischen Assays für RBPR2- und STRA6-Peptide
    1. Verdünnen Sie die Maus-Peptide RBPR2, die mutierte RBPR2 und die STRA6-Peptide (chemisch zuvor31 synthetisiert und in der Materialtabelle aufgeführt) in Laufpuffer in einem Bereich von 0,8-26,6 μM.
    2. Öffnen Sie die Steuerungssoftware und wählen Sie Kinetik/Affinitäts-Assistent. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie die Vorlage , und wählen Sie Kinetik/Affinität aus. Geben Sie den Flusspfad 2-1 des Dialogfelds für die Einspritzsequenz ein (Durchflusszelle 2 als aktiv und Flusszelle 1 als Referenz), überprüfen Sie den Chiptyp CM5 und klicken Sie auf Weiter. Aktivieren Sie im Setup-Dialogfeld die Option Startzyklen ausführen, geben Sie Lösung: Puffer und Zyklen: ein und klicken Sie auf Weiter.
    3. Geben Sie im Dialog für die Injektionsparameter die Werte für die Probenparameter ein: Kontaktzeit: 120 s, Durchflussrate 30 μL/min, Dissoziationszeit 300 s; für Regenerationsparameter : Geben Sie den Namen der Regenerationslösung ein: Glycin-HCl (pH 2,5), Kontaktzeit: 30 s, Durchflussrate: 30 μL/min und klicken Sie auf Weiter.
    4. Geben Sie im Dialogfeld "Proben" den Namen der Peptide, das Molekulargewicht und die Konzentrationen ein und klicken Sie auf "Weiter". Weisen Sie im Dialogfeld "Rack-Position" die verdünnten Peptide als einzelne ~120 μl Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von 1 bis 100 μM und ~230 μl Puffer, ~120 μl Puffer und ~1.000 μl Glycin, pH 2,5, den Positionen auf dem Rack zu. Klicken Sie auf Gestell auswerfen und setzen Sie alle Fläschchen ein. Klicken Sie auf Weiter, und klicken Sie im Dialogfeld Ausführungsprotokoll vorbereiten auf Start, geben Sie einen Dateinamen ein, und speichern Sie (Abbildung 2).
    5. Klicken Sie in der Software auf das Startmenü und wählen Sie Evaluierung. Wählen Sie Öffnen Sie die Datei in der Software und wählen Sie aus dem Dropdown-Auswahlmenü Fc2-1, um das Reference cell Blank-subtrahierte aktive Sensorgramm für die Assoziations- und Dissoziationsphasen der msRBP4- und mutierten msRBPR2- und msSTRA6-Peptide zu analysieren.
    6. Klicken Sie auf die Dropdown-Schaltfläche Kinetik/Affinität und wählen Sie Oberflächengebunden; Um das Dialogfeld Kurven auswählen zu öffnen, aktivieren Sie Spalte in der Tabelle einschließen und klicken Sie auf Weiter. Dialogfeld "Daten auswählen", um leere, subtrahierte Sensorgramme anzuzeigen. Klicken Sie auf Kinetik und Affinität, behalten Sie die Standardparameter bei, und klicken Sie auf die Option "Anpassen " für die Kurvenanpassung. Überprüfen Sie die Registerkarte Bericht auf die Gleichgewichtsdissoziationskonstante Kd und Ka oder Kbei der Assoziationsrate und Kd oder Kbei der Dissoziationsrate. Speichern Sie das Kinetics-Datensensorgramm in .txt tabulatorgetrennten Format, und verwenden Sie die Werte zum Plotten von Diagrammen (Abbildung 3).
    7. Um die Affinitätskinetikkonstante Kd (Ligandenkonzentration, die im Gleichgewicht an die Hälfte der Rezeptoren bindet) zu bestimmen, kopieren Sie die Datenspalten und fügen Sie sie in die Datei im .txt Format ein, die aus dem in der Software verwendeten Diagramm "Auswertung bis XY" generiert wurde. Klicken Sie auf Analysieren und nichtlineare Regression (Kurvenanpassung), überprüfen Sie die Datenspalte, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie im Parameterdialogfeld auf Bindungssättigung und Ein Standort Spezifisches Bindungsanpassungsmodell mit der Formel:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Dabei ist Bmax die maximale Anzahl von Bindungsstellen (Response Unit), X die Konzentration der Peptide und Y die Bindung (Response Unit) (Abbildung 3).

3. Spektrophotometrie-Methode zur Quantifizierung des GPCR-11-cis-Netzhautproteinkomplexes (Retinylidenprotein Rhodopsin) in Netzhautlysaten

  1. Transportieren Sie die vorgegebene Gruppe von Mäusen, bestehend aus adulten WT-C57BL/6J-Mäusen, in die Dunkelkammer.
  2. Passen Sie die Mäuse über Nacht für 12-16 Stunden dunkel an und setzen Sie die Maus bei rotem Licht in eine Euthanasiekammer und öffnen Sie das CO2 -Gasventil am Regler auf 5 L/min für ~5 min. Sorgen Sie für den Tod, indem Sie Druck auf den Hals und den nach hinten gezogenen Schwanz ausüben (Zervixluxation).
  3. Entkernen Sie die Augenkugeln und homogenisieren Sie die Augen in einem eiskalten Puffer, der 20 mM Bis-Tris-Propan (1,3-Bis(hydroxymethyl)methylamino)propan; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und mit Proteaseinhibitor (Materialtabelle).
  4. Das Homogenat wird 15 min lang bei 16000 x g bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand mit wasserlöslichen zytosolischen Proteinen wird verworfen. Die pelletierte Membran und die Membranproteine werden in einem Puffer mit 20 mM n-Dodecyl-β-d-Maltosid (DDM), 20 mM Bis-Tris-Propan (BTP), pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA und mit Proteaseinhibitor für 1 h bei 4 °C auf einer rotierenden Plattform resuspendiert und gelöst.
  5. Die resolubilisierte Membranfraktion wird 1 h lang bei 16000 x g, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird mit 30 μl Rho 1D4-Antikörperkügelchen gemischt und 1 h bei 4 °C auf einer rotierenden Plattform inkubiert.
  6. Trennen Sie den Pulldown mit einem Magnetständer mit Kügelchen, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen mit Puffer 20 mM Bis-Tris-Propan (BTP) pH 7,4, 500 mM NaCl und 2 mM DDM.
  7. Eluieren Sie das Rhodopsin-Protein, indem Sie es 5-10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Puffer von 20 mM Bis-Tris-Propan (BTP), pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM mit 0,2 mg/mL 1D4-Peptid (-TETSQVAPA) inkubieren (Abbildung 4 und Abbildung 5).
  8. Analysieren Sie die Eluierung auf Absorption von 200 nm bis 800 nm mit einer rechteckigen Submikro-Quarzküvette mit 2 mm Öffnung, 10 mm Weglänge, 50 μl in einer schnellen Scan-Einstellung mit einem Spektralphotometer.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur hochwertige Quarzküvetten (Abbildung 4).
  9. Um die Qualität zu validieren und zu bestimmen, überprüfen und belichten Sie die Elue 1 Minute lang mit hellem Licht, dann wiederholen Sie Schritt 3.8.
  10. Subtrahieren Sie die Blank-Extinktion und berechnen Sie das Verhältnis der analysierten Absorptionsspektren zur Absorption bei 500 nm für 11-cis-retinales Opsin, 380 nm für lichtexponiertes all-trans-retinales gebundenes Opsin und 280 nm für ligandenfreies Apo-Opsin-Protein (Abbildung 6). Das freie Opsin ohne Liganden retinal ergibt eine Basisabsorption bei 500 nm.
  11. Um die Rhodopsinkonzentration zu quantifizieren, verwenden Sie das Beer-Lambertsche Gesetz:
    A=ε· C·l oder C=A/ε·l
    Dabei ist A die Absorption ε molaren Extinktionskoeffizienten (Rhodopsin ε500 = 40.600 M−1 cm−1 für freies Apo Opsin ε280 = 81.200 M−1 cm−1), C ist die Konzentration und l Weglänge.
  12. Für die Quantifizierung von ligandiertem Opsin in Prozent wird ein Verhältnis von A280/A500 verwendet.
  13. Plotten Sie die Blank-subtrahierten Absorptionsspektren und berechnen Sie den freien Opsinwert32.
  14. Berechnen Sie die Konzentration von Rhodopsin mit dem Extinktionskoeffizienten ε500 = 40600 M-1 cm-1. Die Konzentration von ligandenfreiem Opsin wird nach dem Beer-Lambert-Gesetz unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε280 = 81.200 M-1 cm-1 berechnet.

Ergebnisse

Es werden quantitative Methoden beschrieben, um Protein-Liganden-Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Photorezeptor-Opsin mit ihren jeweiligen physiologischen Liganden zu untersuchen. Die rekombinante Maus RBP4 sollte in E. coli exprimiert und das gereinigte Protein als konjugierter Ligand auf einem SPR-Chip verwendet werden. Das chemisch synthetisierte RBPR2, STRA6 und die Mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" eines ~40 Aminosäuren...

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
SPR-Methodik
In-silico-Modellierung und Docking-Analyse: Die vorhergesagte Struktur von RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) und STRA6 sowie die bekannte Struktur für die msRBP4 PDB-Datenbank (RSCB PDB ID: 2wqa) sollten für die Docking-Studieverwendet werden 29,31. Zusätzlich sollten in vitro Methoden (Zellkultur) ver...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Konzeption der Studie; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Verfassen des Manuskripts oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Beata Jastrzebska, Ph.D. (Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, OH) für ihre Ratschläge zum Rhodopsin-Absorptionsprotokoll. Diese Arbeit wurde durch ein NIH-NEI-Stipendium (EY030889 und 3R01EY030889-03S1) und teilweise durch die Startkapitalhilfe der University of Minnesota für G.P.L. unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

Referenzen

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