Methodik zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Opsin-Protein mit ihren Liganden bei der Erzeugung des Retinyliden-Proteins

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir zwei quantitative Methoden zur Untersuchung der Protein-Liganden-Wechselwirkungen von Vitamin-A-Membranrezeptoren und Photorezeptor-Opsin mit ihren jeweiligen physiologischen Liganden.

Zusammenfassung

Die Verteilung von Vitamin A/all-trans-Retinol (ROL) über die Nahrung im Körper ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Retinoidfunktion in peripheren Geweben und die Bildung des Retinyliden-Proteins für die Sehfunktion. RBP4-ROL ist der Komplex von ROL mit dem Retinol-bindenden Protein 4 (RBP4), das im Blut vorhanden ist. Zwei Membranrezeptoren, Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) in der Leber und STimuliert durch Retinsäure 6 Retinol (STRA6) im Auge, binden zirkulatorisches RBP4 und dieser Mechanismus ist entscheidend für die Internalisierung von ROL in die Zellen. Die Etablierung von Methoden zur Untersuchung der Rezeptor-Liganden-Kinetik ist essentiell für das Verständnis der physiologischen Funktion von Vitamin-A-Rezeptoren für die Retinoid-Homöostase. Mit Hilfe von Oberflächenplasmonenresonanz-Assays (SPR) können wir die Bindungsaffinitäten und kinetischen Parameter von Vitamin-A-Membranrezeptoren mit seinem physiologischen Liganden RBP4 analysieren.

Diese Methoden können neue strukturelle und biochemische Informationen von RBP4-Bindungsmotiven in RBPR2 und STRA6 aufdecken, die für das Verständnis pathologischer Zustände von Vitamin-A-Mangel entscheidend sind. Im Auge wird internalisiertes ROL zu 11-cis Retinal metabolisiert, dem visuellen Chromophor, das in Photorezeptoren an Opsin bindet, um das Retinylidenprotein Rhodopsin zu bilden. Die Absorption von Licht bewirkt die cis-zu-trans-Isomerisierung von 11-cis-Retinal, was zu Konformationsänderungen im Rhodopsin und der anschließenden Aktivierung der Phototransduktionskaskade führt. Verminderte Konzentrationen von Serum- und okulärer ROL können die Bildung von Retonylidenprotein beeinflussen, was wiederum zu einer Rhodopsin-Fehllokalisation, einer Apoprotein-Opsin-Akkumulation, Nachtblindheit und einer Degeneration des äußeren Photorezeptorsegments führen kann, was zu Retinitis Pigmentosa oder Leber Congenital Amaurose führt.

Daher sind spektrophotometrische Methoden zur Quantifizierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors Opsin-11-cis-Netzhautkomplex in der Netzhaut entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der retinalen Zelldegeneration in den oben genannten pathologischen Zuständen. Mit diesen umfassenden Methoden werden die Forscher in der Lage sein, die Vitamin-A-Versorgung über die Nahrung bei der Aufrechterhaltung der systemischen und okulären Retinoid-Homöostase besser zu beurteilen, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Retinyliden-Proteinkonzentrationen in Photorezeptoren entscheidend ist, was für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion beim Menschen entscheidend ist.

Einleitung

Über die Nahrung gewonnenes Vitamin A/all-trans-Retinol/ROL ist eine wichtige Komponente, die eine Rolle bei der Sehfunktion spielt ^1,2. Das Chromophor 11-cis Retinal, ein Metabolit von Vitamin A in der Nahrung, bindet an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Opsin, um das Retinyliden-Protein Rhodopsin in den Photorezeptoren zu erzeugen. Wenn Licht auf das Auge fällt, erfährt die Konfiguration von Rhodopsin eine grundlegende Veränderung durch die Umwandlung seiner 11-cis-retinalen Komponente in die all-trans-retinal. Diese Konfigurations....

Protokoll

1. Methodik der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

1. Aufbereitung und Aufreinigung des RBP4-Proteins der Maus
   1. Entwerfen Sie Primer zur Generierung von Maus-RBP4 (msRBP4) cDNA in voller Länge (NCBI-Referenzsequenz: NM_001159487.1). Klonieren Sie die msRBP4 cDNA in einen pET28a His-Tag Kanamycin-resistenten Expressionsvektor und exprimieren Sie sie in BL-21 DE3-Zellen (Table of Materials).
   2. Die BL-21 DE3-kompetenten Zellen (gemäß dem Protokoll des Herstellers) werden mit einem ligierten msRBP4-pET28a-Vektor transformiert und dann auf Luria-Bertani (LB)....

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
SPR-Methodik
In-silico-Modellierung und Docking-Analyse: Die vorhergesagte Struktur von RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) und STRA6 sowie die bekannte Struktur für die msRBP4 PDB-Datenbank (RSCB PDB ID: 2wqa) sollten für die Docking-Studie^{verwendet werden 29,31}. Zusätzlich sollten in vitro Methoden (Zellkultur) ver.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms