Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo due metodi quantitativi per studiare le interazioni proteina-ligando dei recettori di membrana della vitamina A e dell'opsina del fotorecettore con i rispettivi ligandi fisiologici.

Abstract

La distribuzione alimentare della vitamina A/all-trans retinolo (ROL) in tutto il corpo è fondamentale per mantenere la funzione retinoide nei tessuti periferici e generare la proteina retinilidene per la funzione visiva. RBP4-ROL è il complesso di ROL con la proteina legante il retinolo 4 (RBP4), presente nel sangue. Due recettori di membrana, il recettore 2 della proteina legante il retinolo 4 (RBPR2) nel fegato e STimulato dall'acido retinoico 6 retinolo (STRA6) nell'occhio, legano RBP4 circolatorio e questo meccanismo è fondamentale per internalizzare il ROL nelle cellule. Stabilire metodi per studiare la cinetica recettore-ligando è essenziale per comprendere la funzione fisiologica dei recettori della vitamina A per l'omeostasi dei retinoidi. Utilizzando saggi di risonanza plasmonica di superficie (SPR), possiamo analizzare le affinità di legame e i parametri cinetici dei recettori di membrana della vitamina A con il suo ligando fisiologico RBP4.

Queste metodologie possono rivelare nuove informazioni strutturali e biochimiche dei motivi di legame di RBP4 in RBPR2 e STRA6, che sono fondamentali per comprendere gli stati patologici di carenza di vitamina A. Nell'occhio, il ROL internalizzato viene metabolizzato in 11-cis retinale, il cromoforo visivo che si lega all'opsina nei fotorecettori per formare la proteina retinilidenica, la rodopsina. L'assorbanza della luce provoca l'isomerizzazione cis-trans della retina 11-cis, inducendo cambiamenti conformazionali nella rodopsina e la successiva attivazione della cascata di fototrasduzione. La diminuzione delle concentrazioni di ROL sierica e oculare può influire sulla formazione della proteina retinilidene, che a sua volta può causare un'errata localizzazione della rodopsina, l'accumulo di opsina apoproteica, cecità notturna e degenerazione del segmento esterno dei fotorecettori, portando a retinite pigmentosa o amaurosi congenita di Leber.

Pertanto, le metodologie spettrofotometriche per quantificare il complesso retinico opsina-11-cis accoppiato al recettore della proteina G nella retina sono fondamentali per comprendere i meccanismi di degenerazione delle cellule retiniche negli stati patologici sopra menzionati. Con queste metodologie complete, i ricercatori saranno in grado di valutare meglio l'apporto alimentare di vitamina A nel mantenimento dell'omeostasi sistemica e oculare dei retinoidi, che è fondamentale per la generazione e il mantenimento delle concentrazioni di proteina retinilidene nei fotorecettori, che è fondamentale per sostenere la funzione visiva negli esseri umani.

Introduzione

La vitamina A/retinolo/ROL ottenuti con la dieta è un componente importante che svolge un ruolo nella funzione visiva 1,2. Il cromoforo 11-cis retinal, un metabolita della vitamina A alimentare, si lega all'opsina del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) per generare la proteina retinilidenica, la rodopsina, nei fotorecettori. Quando la luce cade sull'occhio, la configurazione della rodopsina subisce un cambiamento fondamentale attraverso la conversione della sua componente 11-cis-retinica in all-trans-retinal. Questo cambiamento di configurazione innesca una cascata di fototrasduzione all'interno dei fotorecettori dei bastoncelli, convertendo la luce in un segnale elettrico, che viene trasmesso alla corteccia visiva nel cervello attraverso il nervo ottico 3,4,5,6,7,8,9,10 . La diminuzione delle concentrazioni di ROL sierica e oculare può influire sulla formazione della proteina retinilidene, che a sua volta causa l'errata localizzazione dell'opsina, l'accumulo di opsina apoproteica, la cecità notturna e la degenerazione dell'OS dei fotorecettori, portando alla retinite pigmentosa o all'amaurosi congenita di Leber, che può causare cecità 3,10.

Il retinolo all-trans è la forma di trasporto fondamentale della vitamina A nella dieta ed è la fonte da cui derivano tutti i retinoidi funzionali e i metaboliti della vitamina A nella dieta. Il fegato funge da organo principale per l'immagazzinamento della vitamina A nella dieta. Il retinolo epatico viene trasportato attraverso il siero come complesso con la proteina legante il retinolo 4 (RBP4). RBP4, espresso principalmente nel fegato, forma un olocomplesso con il substrato del retinolo e la transtiretina (TTR), che entra in circolo 11,12,13,14,15,16,17. Il rapporto di un recettore di superficie cellulare per RBP4 negli anni '70 ha portato all'ipotesi di proteine di trasporto di membrana che aiutano il trasporto dei retinoidi dentro e fuori le cellule. Il recettore della superficie cellulare per il retinolo legato a RBP4 (RBP4-ROL) è stato identificato come STimulato dall'acido retinoico 6 retinolo (STRA6) nell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dell'occhio. STRA6 si lega al complesso olo-RBP4 circolatorio e trasporta il retinolo legato a RBP4 attraverso l'RPE per essere utilizzato dai fotorecettori18,19. Le mutazioni in STRA6 possono portare a una miriade di malattie e fenotipi associati a ridotte concentrazioni di ROL oculari. Le mutazioni di STRA6 durante lo sviluppo possono portare ad anoftalmia, microftalmia e altri sintomi non oculari che si sovrappongono ai fenotipi associati alla sindrome di Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 è espresso in diversi organi e tessuti, come l'RPE nell'occhio, ma non in tutti i tessuti26,27. Sebbene il sito principale di stoccaggio dei retinoidi sia il fegato, STRA6 non è espresso nel fegato.

Alapatt e colleghi hanno scoperto che il recettore 2 della proteina legante il retinolo 4 (RBPR2) legava RBP4 con elevata affinità ed era responsabile dell'assorbimento del retinolo legato a RBP4 nel fegato, simile a STRA6 nell'RPE28. È stato riportato che RBPR2 condivide l'omologia strutturale con STRA6 29,30,31. Si propone che RBP4 si leghi ai residui S294, Y295 e L296 su RBPR2, un dominio di legame agli amminoacidi parzialmente conservato tra RBPR2 e STRA6 29,30,31. Da questi studi, si propone che i recettori di membrana della vitamina A come STRA6 e RBPR2, che contengono uno o più residui/domini di legame extracellulare, interagiscano con RBP4-ROL circolatorio. I recettori di membrana, quindi, svolgono un ruolo importante nel legame del recettore alla RBP4 circolatoria per l'internalizzazione di ROL nei tessuti bersaglio, come il fegato e l'occhio.

Nella prima parte di questo studio, abbiamo utilizzato la risonanza plasmonica di superficie (SPR) per studiare l'interazione di due recettori di membrana della vitamina A (RBPR2 e STRA6) con il loro ligando fisiologico RBP431. Le affinità di legame e la cinetica di associazione/dissociazione dei complessi proteina-ligando possono essere misurate in tempo reale utilizzando SPR. Questa metodologia mirava a fornire informazioni cinetiche, strutturali e biochimiche critiche sui motivi di legame di RBP4 in RBPR2 e STRA6, che sono fondamentali per comprendere gli stati patologici di carenza di vitamina A31,32. Come accennato in precedenza, il ROL circolatorio viene internalizzato nell'RPE tramite STRA6 per generare il cromoforo 11-cis retinico, che si lega all'opsina per generare la proteina retinilidene, la rodopsina, nei fotorecettori33. Abbiamo utilizzato metodologie di spettrofotometria per quantificare la GPCR-opsina e il suo ligando 11-cis complesso retinico nei lisati retinici murini, che è fondamentale per comprendere i meccanismi della proteina retinilidene, la rodopsina, negli stati patologici oculari della Retinite Pigmentosa o dell'Amaurosi Congenita di Leber34. In generale, questi protocolli possono essere applicati per studiare in vitro le conseguenze fisiologiche di RBP4, STRA6 o RBPR2 mutanti nell'influenzare l'omeostasi sistemica e oculare della vitamina A o l'impatto delle rodopsine mutanti o delle proteine del ciclo retinoide sulla funzione visiva35,36.

Protocollo

1. Metodologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR)

  1. Preparazione e purificazione della proteina RBP4 di topo
    1. Primer di progettazione per generare cDNA di topo RBP4 (msRBP4) a lunghezza intera (sequenza di riferimento NCBI: NM_001159487.1). Clonare il cDNA msRBP4 in un vettore di espressione pET28a His-tag Kanamicina resistente ed esprimerlo in cellule BL-21 DE3 (Tabella dei materiali).
    2. Trasformare le cellule competenti BL-21 DE3 (secondo il protocollo del produttore) con il vettore msRBP4-pET28a ligato e quindi impiattare su piastre di brodo Agar Luria-Bertani (LB) contenenti Kanamicina 50 μg/mL30,37. Incubare le piastre per una notte a 37 °C in un'incubatrice e vagliare le colonie positive il giorno successivo.
    3. Prelevare una singola colonia e incubare per una notte a 37 °C in 5 ml di brodo LB contenente Kanamicina 50 μg/mL.
    4. Per la coltura secondaria in 500 mL di brodo LB contenente Kanamicina 50 μg/mL, utilizzare l'1% del volume della coltura primaria (dal passaggio 1.1.3.) e incubare a 37 °C per 3-4 ore; Controllare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro. Idealmente, procedere se il valore OD è compreso tra 0,6 e 1 per indurre l'espressione proteica con 0,5 mM IPTG a 24 °C durante la notte.
    5. Utilizzare più concentrazioni di IPTG di 0,1-1 mM e un intervallo di temperatura di 16-30 °C per ottimizzare l'espressione e la stabilità di msRBP4.
    6. Centrifugare la coltura (dal punto 1.1.5) a 16.000 × g per 10 minuti, scartare il surnatante e mantenere il pellet in ghiaccio.
    7. Omogeneizzare il pellet con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% glicerolo, 0,5 mM PMSF e inibitori della proteasi [pH 8,0]). Sonicare il lisato per cicli di 15 s ON e 30 s OFF utilizzando un omogeneizzatore con una potenza di 250 Watt e una frequenza di uscita del 40-50% a 20 kHz. Ripeti 5 volte.
    8. Rimuovere i detriti cellulari e le cellule non lisate mediante centrifugazione a 16.000 × g per 20 minuti. Far passare il surnatante del lisato attraverso una colonna NTA di nichel bilanciata con tampone.
    9. Lavare la colonna con tampone di lisi (dal passaggio 1.1.8) contenente 30 mM di imidazolo.
    10. In frazioni, eluire la proteina msRBP4 legata utilizzando un tampone contenente 250 mM di imidazolo. Eseguire le frazioni eluite e monitorare visivamente la quantità di proteine con un gel di poliacrilammide SDS al 12%, colorato con Coomassie Brilliant Blue R-250 in soluzione di metanolo:acqua:acido acetico (45:45:10) e decolorare con soluzione senza colorazione Coomassie metanolo:acqua:acido acetico (45:45:10).
    11. Raggruppare le frazioni inutilizzate e dializzare le frazioni raggruppate con una cassetta per dialisi da 10K da 10 kDa MWCO.
    12. Valutare la qualità della frazione dializzata su un gel SDS-PAGE al 12% e quantificare la concentrazione proteica.
      NOTA: La proteina Apo-RBP4 è stata utilizzata nell'analisi SPR. Per la generazione di olo-RBP4 (RBP4-retinolo), fare riferimento ai protocolli dettagliati pubblicati altrove 36,37.
  2. Validazione iniziale dei peptidi RBPR2 e STRA6 con RBP4 per la struttura e l'interazione mediante saggio di fluorescenza del triptofano e spettroscopia di dicroismo circolare (CD)
    1. Saggio di fluorescenza del triptofano
      1. Utilizza lo strumento di analisi della composizione proteica online (https://web.expasy.org/protparam/) e incolla la sequenza di aminoacidi in un codice di una lettera per valutare la composizione strutturale della proteina ricombinante RBP4 e dei singoli peptidi di RBPR2 e STRA6 per determinare i residui di triptofano amminoacido nei singoli peptidi e proteine (Tabella dei materiali).
      2. Fare clic sul pulsante Calcola parametri e valutare la composizione degli amminoacidi per i residui di triptofano (Trp).
        NOTA: I residui di triptofano devono essere presenti nei singoli peptidi o proteine analizzati.
      3. Diluire i singoli peptidi RBPR2 e STRA6 in varie concentrazioni micromolari e incubare singolarmente con 3 μg msdi RBP4 in una piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente per 5 minuti. Eccita la miscela a 290 nm e scansiona l'emissione da 300 nm a 400 nm di lunghezza d'onda.
      4. Normalizza i dati con la condizione di controllo del vuoto (solo tampone, nessun peptide e nessuna proteina) e del peptide (nessuna proteina) e traccia.
        NOTA: L'incremento della fluorescenza del triptofano in seguito all'esposizione a una concentrazione peptidica da bassa ad alta suggerisce un'interazione positiva tra i due singoli peptidi e la proteina RBP4.
    2. Spettroscopia di dicroismo circolare (CD)
      1. Diluire i singoli peptidi e la proteina ricombinante RBP4 in 1x tampone PBS, pH 7,0. Utilizzare varie concentrazioni di peptidi RBPR2 e STRA6 e proteina RBP4 da 0,1 a 10 μg/mL per un controllo di qualità, come descritto di seguito.
      2. Aggiungere singoli peptidi e proteine diluiti in una cuvetta lunga un percorso di 0,1 cm e misurare l'assorbanza/ellitticità del CD utilizzando uno spettrofotometro CD (195-250 nm). Utilizzare la formula seguente per calcolare l'ellitticità media dei residui (θ).
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S rappresenta il segnale CD in mθ; mRw rappresenta la massa media dei residui; c rappresenta la concentrazione della proteina in mg/mL; e l rappresenta la lunghezza del percorso in cm.
      3. Calcola la variazione percentuale della struttura molecolare utilizzando l'analisi della struttura secondaria BeStSel per la previsione del ripiegamento delle proteine mediante spettroscopia CD (https://bestsel.elte.hu).
        NOTA: La struttura secondaria indica il corretto ripiegamento e le conferme conservate cruciali per lo studio dell'interazione e l'esito delle interazioni. Ispezionare la struttura prevista del dominio e procedere ulteriormente con lo studio dell'interazione.

2. Analisi SPR per determinare le affinità di legame e i parametri cinetici dei recettori di membrana della vitamina A (RBPR2 e STRA6) con il loro ligando fisiologico RBP4

  1. Per l'immobilizzazione di RBP4 sulla configurazione della superficie del chip CM5, utilizziamo il chip del sensore SPR, che trasporta un linker carbossimetildestrano esteso a una dimensione di ~100 nm attaccato in modo covalente su una superficie d'oro. In presenza di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC), la N-idrossisuccinimide (NHS) converte i gruppi carbossilici sulla superficie del chip in esteri N-idrossisuccinimide, che reagiscono spontaneamente con i gruppi amminici di amminoacidi e proteine, costringendo il ligando a legarsi covalentemente sulla superficie del chip (Tabella dei materiali).
    1. Immobilizzare la proteina msRBP4 purificata sul chip del sensore (Figura 1 e Figura 2). Nel menu Esegui del software, scegliere la procedura guidata e procedere con l'opzione di immobilizzazione . Diluire il ligando (proteina msRBP4 ottenuta dalla fase 1.1) nel tampone di immobilizzazione (10 mM di tampone acetato di sodio, pH 5,0) a 10 μg/mL (4 μL di ligando + 396 μL di tampone) e aliquotare i reagenti di accoppiamento in fiale. Aprire la finestra della procedura guidata di configurazione dell'immobilizzazione dal controllo software, selezionare Chip CM5 e l'opzione Immobilizzare la cella di flusso 2 e il livello target di 1.200 unità di risposta (RU) per ottenere un Rmax di 30 RU nello studio cinetico e nella soluzione di lavaggio: etanolammina. Immettere il nome RBP4 e fare clic su Avanti.
      NOTA: Facoltativo: la finestra di dialogo Preparazioni di sistema per l'opzione Prime prima dell'esecuzione non è necessaria se in precedenza è stato eseguito l'adescamento con tampone di corsa PBST (soluzione salina tamponata con fosfato con una soluzione detergente Tween 20 allo 0,05%).
    2. Nella finestra di dialogo Posizione rack fare clic su Espelli rack. Prendere il rack e posizionare le fiale con i volumi assegnati per ciascun reagente: 156 μL di msRBP4, 177 μL di etanolammina, 89 μL di EDC, 89 μL di NHS e una fiala vuota. Inserire il rack con le fiale di campionamento e fare clic su OK e Avanti.
    3. Nella finestra di dialogo Prepara protocollo di esecuzione fare clic su Avvia e salva.
  2. Configurazione del saggio cinetico dei peptidi RBPR2 e STRA6
    1. Diluire in serie i peptidi RBPR2 di topo, RBPR2 mutante e STRA6 (sintetizzati chimicamente in precedenza31 ed elencati nella Tabella dei materiali) in un tampone di corsa in un intervallo di 0,8-26,6 μM.
    2. Aprire il software di controllo e selezionare la procedura guidata Cinetica/Affinità. Fare clic su File | Aprire il modello e selezionare Cinetica/Affinità. Immettere il percorso del flusso 2-1 della finestra di dialogo della sequenza di iniezione (cella di flusso 2 attiva e cella di flusso 1 come riferimento), controllare il tipo di chip CM5 e fare clic su Avanti. Nella finestra di dialogo di configurazione, selezionare Esegui cicli di avvio, immettere Soluzione: buffer e cicli: e fare clic su Avanti.
    3. Nella finestra di dialogo dei parametri di iniezione , inserire i valori per i parametri del campione : tempo di contatto: 120 s, portata 30 μL/min, tempo di dissociazione 300 s; per i parametri di rigenerazione : inserire il nome della soluzione di rigenerazione: Glicina-HCl (pH 2,5), tempo di contatto: 30 s, portata: 30 μL/min e fare clic su Avanti.
    4. Nella finestra di dialogo dei campioni , inserisci il nome dei peptidi, il peso molecolare e le concentrazioni e fai clic su Avanti. Nella finestra di dialogo Posizione rack , assegnare i peptidi diluiti come singoli campioni da ~120 μL di varie concentrazioni da 1 a 100 μM e ~230 μL di tampone, ~120 μL di tampone e ~1.000 μL di glicina, pH 2,5, alle posizioni sul rack. Fare clic su Eject Rack (Espellere rack ) e inserire tutte le fiale. Fare clic su Avanti e nella finestra di dialogo Prepara protocollo di esecuzione fare clic su Avvia, immettere un nome file e salvare (Figura 2).
    5. Nel software, fare clic sul menu Start e selezionare Valutazione. Scegli apri il file nel software e, dal menu di selezione a discesa, scegli Fc2-1 per analizzare il sensore attivo sottratto in bianco della cella di riferimento per le fasi di associazione e dissociazione dei peptidi msRBP4 e mutanti msRBPR2 e msSTRA6.
    6. Fare clic sul pulsante a discesa Cinetica/Affinità e scegliere Superficie limitata; per aprire la finestra di dialogo Seleziona curve , selezionare Includi colonna nella tabella e fare clic su Avanti. Seleziona la finestra di dialogo Dati per mostrare i sensorgram sottratti in bianco; fare clic su Cinetica e affinità, mantenere i parametri predefiniti e fare clic sull'opzione Adatta per l'adattamento della curva. Ispezionare la scheda Rapporto per verificare la presenza di costante di dissociazione di equilibrio Kd e Ka o Ksul tasso di associazione e Kd o Kfuori dal tasso di dissociazione. Salvare il sensorgram dei dati Kinetics in .txt formato delimitato da schede e utilizzare i valori per tracciare i grafici (Figura 3).
    7. Per determinare la costante cinetica di affinità Kd (concentrazione del ligando che si lega a metà dei recettori all'equilibrio), copiare e incollare le colonne di dati nel file in formato .txt generato dal grafico Evaluation to XY utilizzato nel software. Fare clic su Analizza e Regressione non lineare (adattamento della curva), controllare la colonna dei dati e fare clic su OK. Nella finestra di dialogo dei parametri , fare clic su Saturazione rilegatura e su Modello di raccordo rilegatura specifico per un sito con la formula seguente:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Dove Bmax è il numero massimo di siti di legame (unità di risposta), X è la concentrazione dei peptidi e Y è il legame (unità di risposta) (Figura 3).

3. Metodologia spettrofotometrica per quantificare il complesso proteico retinico GPCR-11-cis (proteina retinilidene rodopsina) nei lisati retinici

  1. Trasporta il gruppo predeterminato di topi composto da topi adulti WT-C57BL/6J nella camera oscura.
  2. L'oscurità adatta i topi durante la notte per 12-16 ore e, sotto la luce rossa, posiziona il topo in una camera di eutanasia e apri la valvola del gas CO2 sul regolatore a 5 L/min per ~ 5 minuti. Garantire la morte esercitando una pressione sul collo e sulla coda tirata all'indietro (lussazione cervicale).
  3. Enucleare i globi oculari e omogeneizzare gli occhi in un tampone ghiacciato contenente 20 mM bis-tris propano (1,3-bis (tris(idrossimetil)metilammino)propano; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e con inibitore della proteasi (Tabella dei materiali).
  4. Centrifugare l'omogenato per 15 minuti a 16000 x g a 4 °C, scartare il surnatante contenente proteine citosoliche solubili in acqua. Risospendere e solubilizzare la membrana pellettata e le proteine di membrana in tampone contenente 20 mM di n-dodecil-β-d-maltoside (DDM), 20 mM di bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM di NaCl, 1 mM di EDTA e con inibitore della proteasi per 1 ora a 4 °C su una piattaforma rotante.
  5. Centrifugare la frazione di membrana risolubilizzata per 1 ora a 16000 x g, 4 °C. Miscelare il surnatante con 30 μl di perle di anticorpi Rho 1D4 e incubare per 1 ora a 4 °C su una piattaforma rotante.
  6. Utilizzando un supporto magnetico, separare il pulldown utilizzando le perline, scartare il surnatante e lavare le perle con tampone 20 mM bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 500 mM NaCl e 2 mM DDM.
  7. Eluire la proteina rodopsina incubando per 5-10 minuti a temperatura ambiente con tampone 20 mM di bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM di NaCl, 2 mM DDM contenenti 0,2 mg/mL di peptide 1D4 (-TETSQVAPA) (Figura 4 e Figura 5).
  8. Analizza l'eluizione per l'assorbanza da 200 nm a 800 nm utilizzando una cuvetta rettangolare, sub-micro, al quarzo, apertura di 2 mm, lunghezza del percorso di 10 mm, 50 μl in un'impostazione di scansione rapida con aspectrofotometro.
    NOTA: Utilizzare solo cuvette al quarzo di alta qualità (Figura 4).
  9. Per convalidare e determinare la qualità, controllare ed esporre l'eluizione a una luce intensa per 1 minuto, quindi ripetere il passaggio 3.8.
  10. Sottrarre l'assorbanza del bianco e calcolare il rapporto tra gli spettri di assorbanza analizzati con l'assorbanza a 500 nm per l'opsina legata alla retina 11-cis , 380 nm per l'opsina legata alla retina all-trans esposta alla luce e 280 nm per la proteina Apo-Opsina priva di ligando (Figura 6). L'opsina libera senza ligando retinico fornisce un'assorbanza basale a 500 nm.
  11. Per quantificare la concentrazione di rodopsina, utilizzare la legge di Beer-Lambert:
    A=ε· C·l o C=A/ε·l
    Dove A è l'assorbanza, ε il coefficiente di estinzione molare (rodopsina ε500 = 40.600 M−1 cm−1 per l'Apo Opsina libera ε280 = 81.200 M−1 cm−1), C è la concentrazione e l la lunghezza del cammino.
  12. Per quantificare l'Opsina ligata in percentuale, utilizzare un rapporto di A280/A500.
  13. Tracciare gli spettri di assorbanza sottratti in bianco e calcolare il valore dell'opsina libera32.
  14. Calcola la concentrazione di rodopsina utilizzando il coefficiente di estinzione ε500 = 40600 M−1 cm−1. La concentrazione di opsina libera da leganti è calcolata con la legge di Beer-Lambert utilizzando il coefficiente di estinzione ε280 = 81.200 M−1 cm−1.

Risultati

Vengono descritti metodi quantitativi per studiare le interazioni proteina-ligando dei recettori di membrana della vitamina A e dell'opsina fotorecettrice con i rispettivi ligandi fisiologici. La RBP4 ricombinante di topo deve essere espressa in E. coli e la proteina purificata deve essere utilizzata come ligando coniugato su un chip SPR. RBPR2, STRA6 e il mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" di un peptide di amminoacidi ~40 sintetizzati chimicamen...

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Metodologia SPR
Modellazione in silico e analisi di docking: la struttura prevista di RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) e STRA6 e la struttura nota per il database PDB msRBP4 (RSCB PDB ID: 2wqa), dovrebbero essere utilizzate per lo studio di docking29,31. Inoltre, dovrebbero essere utilizzati metodi in vitro (coltura ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto, o nella decisione di pubblicare i risultati.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano la Dott.ssa Beata Jastrzebska, Ph.D. (Dipartimento di Farmacologia, Case Western Reserve University, OH) per i suoi consigli sul protocollo di assorbanza della rodopsina. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH-NEI (EY030889 e 3R01EY030889-03S1) e, in parte, dai fondi di avviamento dell'Università del Minnesota a G.P.L.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluation softwareBiacore S200Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competent cellsThermo ScientificEC0114
CD spectrophotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Model fitting, data analysis
LB brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
Plasmid purification kitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis SpectrophotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Conforms

Riferimenti

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411 (2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676 (2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987 (2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229 (2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236 (2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371 (2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099 (2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657 (2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293 (2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169 (2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207 (2017).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

BiochimicaNumero 212Risonanza plasmonica di superficieRetinoloRBPR2STRA6RBP4Assorbanza della rodopsinaOpsina apoproteica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati