Metodologia per lo studio delle interazioni dei recettori di membrana della vitamina A e della proteina opsina con i loro ligandi nella generazione della proteina retinilidene

Riepilogo

Qui, descriviamo due metodi quantitativi per studiare le interazioni proteina-ligando dei recettori di membrana della vitamina A e dell'opsina del fotorecettore con i rispettivi ligandi fisiologici.

Abstract

La distribuzione alimentare della vitamina A/all-trans retinolo (ROL) in tutto il corpo è fondamentale per mantenere la funzione retinoide nei tessuti periferici e generare la proteina retinilidene per la funzione visiva. RBP4-ROL è il complesso di ROL con la proteina legante il retinolo 4 (RBP4), presente nel sangue. Due recettori di membrana, il recettore 2 della proteina legante il retinolo 4 (RBPR2) nel fegato e STimulato dall'acido retinoico 6 retinolo (STRA6) nell'occhio, legano RBP4 circolatorio e questo meccanismo è fondamentale per internalizzare il ROL nelle cellule. Stabilire metodi per studiare la cinetica recettore-ligando è essenziale per comprendere la funzione fisiologica dei recettori della vitamina A per l'omeostasi dei retinoidi. Utilizzando saggi di risonanza plasmonica di superficie (SPR), possiamo analizzare le affinità di legame e i parametri cinetici dei recettori di membrana della vitamina A con il suo ligando fisiologico RBP4.

Queste metodologie possono rivelare nuove informazioni strutturali e biochimiche dei motivi di legame di RBP4 in RBPR2 e STRA6, che sono fondamentali per comprendere gli stati patologici di carenza di vitamina A. Nell'occhio, il ROL internalizzato viene metabolizzato in 11-cis retinale, il cromoforo visivo che si lega all'opsina nei fotorecettori per formare la proteina retinilidenica, la rodopsina. L'assorbanza della luce provoca l'isomerizzazione cis-trans della retina 11-cis, inducendo cambiamenti conformazionali nella rodopsina e la successiva attivazione della cascata di fototrasduzione. La diminuzione delle concentrazioni di ROL sierica e oculare può influire sulla formazione della proteina retinilidene, che a sua volta può causare un'errata localizzazione della rodopsina, l'accumulo di opsina apoproteica, cecità notturna e degenerazione del segmento esterno dei fotorecettori, portando a retinite pigmentosa o amaurosi congenita di Leber.

Pertanto, le metodologie spettrofotometriche per quantificare il complesso retinico opsina-11-cis accoppiato al recettore della proteina G nella retina sono fondamentali per comprendere i meccanismi di degenerazione delle cellule retiniche negli stati patologici sopra menzionati. Con queste metodologie complete, i ricercatori saranno in grado di valutare meglio l'apporto alimentare di vitamina A nel mantenimento dell'omeostasi sistemica e oculare dei retinoidi, che è fondamentale per la generazione e il mantenimento delle concentrazioni di proteina retinilidene nei fotorecettori, che è fondamentale per sostenere la funzione visiva negli esseri umani.

Introduzione

La vitamina A/retinolo/ROL ottenuti con la dieta è un componente importante che svolge un ruolo nella funzione visiva ^1,2. Il cromoforo 11-cis retinal, un metabolita della vitamina A alimentare, si lega all'opsina del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) per generare la proteina retinilidenica, la rodopsina, nei fotorecettori. Quando la luce cade sull'occhio, la configurazione della rodopsina subisce un cambiamento fondamentale attraverso la conversione della sua componente 11-cis-retinica in all-trans-retinal. Questo cambiamento di c....

Protocollo

1. Metodologia di risonanza plasmonica di superficie (SPR)

1. Preparazione e purificazione della proteina RBP4 di topo
   1. Primer di progettazione per generare cDNA di topo RBP4 (msRBP4) a lunghezza intera (sequenza di riferimento NCBI: NM_001159487.1). Clonare il cDNA msRBP4 in un vettore di espressione pET28a His-tag Kanamicina resistente ed esprimerlo in cellule BL-21 DE3 (Tabella dei materiali).
   2. Trasformare le cellule competenti BL-21 DE3 (secondo il protocollo del produttore) con il vettore msRBP4-pET28a ligato e quindi impiattare su piastre di brod....

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Metodologia SPR
Modellazione in silico e analisi di docking: la struttura prevista di RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) e STRA6 e la struttura nota per il database PDB msRBP4 (RSCB PDB ID: 2wqa), dovrebbero essere utilizzate per lo studio di docking^29,31. Inoltre, dovrebbero essere utilizzati metodi in vitro (coltura .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms