Metodologia para Estudo das Interações dos Receptores de Membrana da Vitamina A e da Proteína Opsina com seus Ligantes na Geração da Proteína Retinilideno

Resumo

Aqui, descrevemos dois métodos quantitativos para estudar as interações proteína-ligante dos receptores de membrana da vitamina A e da opsina fotorreceptora com seus respectivos ligantes fisiológicos.

Resumo

A distribuição de vitamina A / retinol totalmente trans (ROL) em todo o corpo é fundamental para manter a função retinóide nos tecidos periféricos e gerar a proteína retinilideno para a função visual. RBP4-ROL é o complexo de ROL com a proteína de ligação ao retinol 4 (RBP4), que está presente no sangue. Dois receptores de membrana, o receptor 2 da proteína de ligação ao retinol 4 (RBPR2) no fígado e estimulado pelo retinol 6 retinol (STRA6) no olho, ligam-se ao RBP4 circulatório e esse mecanismo é crítico para internalizar o ROL nas células. O estabelecimento de métodos para investigar a cinética receptor-ligante é essencial para entender a função fisiológica dos receptores de vitamina A para a homeostase retinóide. Usando ensaios de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), podemos analisar as afinidades de ligação e os parâmetros cinéticos dos receptores de membrana da vitamina A com seu ligante fisiológico RBP4.

Essas metodologias podem revelar novas informações estruturais e bioquímicas dos motivos de ligação a RBP4 em RBPR2 e STRA6, que são críticos para a compreensão dos estados patológicos de deficiência de vitamina A. No olho, o ROL internalizado é metabolizado em retinal 11-cis, o cromóforo visual que se liga à opsina nos fotorreceptores para formar a proteína retinilideno, rodopsina. A absorbância da luz causa a isomerização cis-para-trans da retina 11-cis, induzindo alterações conformacionais na rodopsina e a subsequente ativação da cascata de fototransdução. A diminuição das concentrações de ROL sérico e ocular pode afetar a formação da proteína retinilideno, que por sua vez pode causar localização incorreta da rodopsina, acúmulo de apoproteína opsina, cegueira noturna e degeneração do segmento externo dos fotorreceptores, levando à retinite pigmentosa ou amaurose congênita de Leber.

Portanto, metodologias espectrofotométricas para quantificar o complexo retiniano opsina-11-cis acoplado ao receptor acoplado à proteína G na retina são críticas para a compreensão dos mecanismos de degeneração das células da retina nos estados patológicos acima mencionados. Com essas metodologias abrangentes, os investigadores poderão avaliar melhor o suprimento de vitamina A na dieta na manutenção da homeostase retinóide sistêmica e ocular, que é crítica para gerar e manter as concentrações de proteína retinilideno nos fotorreceptores, o que é crítico para sustentar a função visual em humanos.

Introdução

A vitamina A / retinol totalmente trans / ROL obtido na dieta é um componente importante que desempenha um papel na função visual ^1,2. O cromóforo 11-cis retinal, um metabólito da vitamina A da dieta, liga-se à opsina do receptor acoplado à proteína G (GPCR) para gerar a proteína retinilideno, rodopsina, nos fotorreceptores. Quando a luz incide sobre o olho, a configuração da rodopsina sofre uma mudança fundamental por meio da conversão de seu componente 11-cis-retinal para o totalmente trans-retiniano. Essa mudança de configuração desencade....

Protocolo

1. Metodologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR)

1. Preparação e purificação da proteína RBP4 de camundongo
   1. Projete primers para gerar cDNA RBP4 de camundongo de comprimento total (msRBP4) (Sequência de referência NCBI: NM_001159487.1). Clone o cDNA msRBP4 em um vetor de expressão resistente à canamicina pET28a His-tag e expresse em células BL-21 DE3 (Tabela de Materiais).
   2. Transformar as células competentes para BL-21 DE3 (de acordo com o protocolo do fabricante) com o vector msRBP4-pET28a ligado e, em seguida, colocar em placas de ágar d....

Discussão

Etapas críticas no protocolo
Metodologia SPR
Modelagem in silico e análise de docking: A estrutura prevista de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) e STRA6, e a estrutura conhecida para obanco de dados ms RBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa), devem ser usadas para o estudo de docking^29,31. Além disso, métodos in vitro (cultura de células) devem ser usados.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms