Metodologia para Estudo das Interações dos Receptores de Membrana da Vitamina A e da Proteína Opsina com seus Ligantes na Geração da Proteína Retinilideno

Resumo

Aqui, descrevemos dois métodos quantitativos para estudar as interações proteína-ligante dos receptores de membrana da vitamina A e da opsina fotorreceptora com seus respectivos ligantes fisiológicos.

Resumo

A distribuição de vitamina A / retinol totalmente trans (ROL) em todo o corpo é fundamental para manter a função retinóide nos tecidos periféricos e gerar a proteína retinilideno para a função visual. RBP4-ROL é o complexo de ROL com a proteína de ligação ao retinol 4 (RBP4), que está presente no sangue. Dois receptores de membrana, o receptor 2 da proteína de ligação ao retinol 4 (RBPR2) no fígado e estimulado pelo retinol 6 retinol (STRA6) no olho, ligam-se ao RBP4 circulatório e esse mecanismo é crítico para internalizar o ROL nas células. O estabelecimento de métodos para investigar a cinética receptor-ligante é essencial para entender a função fisiológica dos receptores de vitamina A para a homeostase retinóide. Usando ensaios de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), podemos analisar as afinidades de ligação e os parâmetros cinéticos dos receptores de membrana da vitamina A com seu ligante fisiológico RBP4.

Essas metodologias podem revelar novas informações estruturais e bioquímicas dos motivos de ligação a RBP4 em RBPR2 e STRA6, que são críticos para a compreensão dos estados patológicos de deficiência de vitamina A. No olho, o ROL internalizado é metabolizado em retinal 11-cis, o cromóforo visual que se liga à opsina nos fotorreceptores para formar a proteína retinilideno, rodopsina. A absorbância da luz causa a isomerização cis-para-trans da retina 11-cis, induzindo alterações conformacionais na rodopsina e a subsequente ativação da cascata de fototransdução. A diminuição das concentrações de ROL sérico e ocular pode afetar a formação da proteína retinilideno, que por sua vez pode causar localização incorreta da rodopsina, acúmulo de apoproteína opsina, cegueira noturna e degeneração do segmento externo dos fotorreceptores, levando à retinite pigmentosa ou amaurose congênita de Leber.

Portanto, metodologias espectrofotométricas para quantificar o complexo retiniano opsina-11-cis acoplado ao receptor acoplado à proteína G na retina são críticas para a compreensão dos mecanismos de degeneração das células da retina nos estados patológicos acima mencionados. Com essas metodologias abrangentes, os investigadores poderão avaliar melhor o suprimento de vitamina A na dieta na manutenção da homeostase retinóide sistêmica e ocular, que é crítica para gerar e manter as concentrações de proteína retinilideno nos fotorreceptores, o que é crítico para sustentar a função visual em humanos.

Introdução

A vitamina A / retinol totalmente trans / ROL obtido na dieta é um componente importante que desempenha um papel na função visual ^1,2. O cromóforo 11-cis retinal, um metabólito da vitamina A da dieta, liga-se à opsina do receptor acoplado à proteína G (GPCR) para gerar a proteína retinilideno, rodopsina, nos fotorreceptores. Quando a luz incide sobre o olho, a configuração da rodopsina sofre uma mudança fundamental por meio da conversão de seu componente 11-cis-retinal para o totalmente trans-retiniano. Essa mudança de configuração desencadeia uma cascata de fototransdução dentro dos fotorreceptores dos bastonetes, convertendo a luz em um sinal elétrico, que é transmitido ao córtex visual no cérebro através do nervo óptico 3,4,5,6,7,8,9,10 . Concentrações diminuídas de ROL sérico e ocular podem afetar a formação da proteína retinilideno, que por sua vez causa localização incorreta da opsina, acúmulo de apoproteína opsina, cegueira noturna e degeneração do EO dos fotorreceptores, levando à Retinite Pigmentosa ou Amaurose Congênita de Leber, que pode causar cegueira ^3,10.

O retinol totalmente trans é a forma de transporte fundamental da vitamina A na dieta e é a fonte da qual todos os retinóides funcionais e metabólitos da vitamina A da dieta são derivados. O fígado serve como o principal órgão para o armazenamento de vitamina A na dieta. O retinol hepático é transportado através do soro como seu complexo com a proteína 4 de ligação ao retinol (RBP4). A RBP4, expressa principalmente no fígado, forma um holocomplexo com o substrato retinol e transtirretina (TTR), que entra na circulação 11,12,13,14,15,16,17. O relato de um receptor de superfície celular para RBP4 na década de 1970 levou à hipótese de proteínas de transporte de membrana auxiliando no transporte de retinóides para dentro e para fora das células. O receptor de superfície celular para retinol ligado a RBP4 (RBP4-ROL) foi identificado como estimulado pelo retinol de ácido retinóico 6 (STRA6) no epitélio pigmentar da retina (EPR) do olho. O STRA6 se liga ao complexo holo-RBP4 circulatório e transporta o retinol ligado ao RBP4 através do EPR para ser utilizado pelos fotorreceptores^18,19. Mutações no STRA6 podem levar a uma miríade de doenças e fenótipos associados a concentrações reduzidas de ROL ocular. Mutações STRA6 durante o desenvolvimento podem levar a anoftalmia, microftalmia e outros sintomas não oculares que se sobrepõem aos fenótipos associados à síndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. O STRA6 é expresso em diferentes órgãos e tecidos, como o EPR no olho, mas não em todos os tecidos^26,27. Embora o local primário de armazenamento de retinóides seja o fígado, o STRA6 não é expresso no fígado.

Alapatt e colegas descobriram que o receptor 2 da proteína de ligação ao retinol 4 (RBPR2) se ligava ao RBP4 com alta afinidade e era responsável pela captação de retinol ligado ao RBP4 no fígado, semelhante ao STRA6 no RPE²⁸. Foi relatado que RBPR2 compartilha homologia estrutural com STRA6 29,30,31. Propõe-se que RBP4 se ligue aos resíduos S294, Y295 e L296 em RBPR2, um domínio de ligação a aminoácidos parcialmente conservado entre RBPR2 e STRA6 também 29,30,31. A partir desses estudos, propõe-se que os receptores de membrana da vitamina A, como STRA6 e RBPR2, que contêm um ou mais resíduos/domínios de ligação extracelular, interajam com o RBP4-ROL circulatório. Os receptores de membrana, portanto, desempenham um papel importante na ligação do receptor ao RBP4 circulatório para internalização do ROL nos tecidos-alvo, como o fígado e o olho.

Na primeira parte deste estudo, utilizamos a Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) para investigar a interação de dois receptores de membrana de vitamina A (RBPR2 e STRA6) com seu ligante fisiológico RBP4³¹. As afinidades de ligação e a cinética de associação/dissociação de proteínas a complexos ligantes podem ser medidas em tempo real usando SPR. Essa metodologia teve como objetivo fornecer informações cinéticas, estruturais e bioquímicas críticas sobre os motivos de ligação a RBP4 em RBPR2 e STRA6, que são críticos para a compreensão dos estados patológicos de deficiência de vitamina A^31,32. Como mencionado acima, o ROL circulatório é internalizado no EPR via STRA6 para gerar o cromóforo 11-cis retinal, que se liga à opsina para gerar a proteína retinilideno, rodopsina, nos fotorreceptores³³. Usamos metodologias de espectrofotometria para quantificar a GPCR-opsina e seu complexo retiniano ligante 11-cis em lisados retinianos murinos, o que é fundamental para a compreensão dos mecanismos de redução da proteína retinilideno, rodopsina, em estados patológicos oculares de Retinite Pigmentosa ou Amaurose Congênita de Leber³⁴. Em geral, esses protocolos podem ser aplicados para estudar in vitro as consequências fisiológicas da RBP4, STRA6 ou RBPR2 mutantes em influenciar a homeostase sistêmica e ocular da vitamina A ou o impacto da rodopsina mutante ou proteínas do ciclo retinóide na função visual^35,36.

Protocolo

1. Metodologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR)

1. Preparação e purificação da proteína RBP4 de camundongo
   1. Projete primers para gerar cDNA RBP4 de camundongo de comprimento total (msRBP4) (Sequência de referência NCBI: NM_001159487.1). Clone o cDNA msRBP4 em um vetor de expressão resistente à canamicina pET28a His-tag e expresse em células BL-21 DE3 (Tabela de Materiais).
   2. Transformar as células competentes para BL-21 DE3 (de acordo com o protocolo do fabricante) com o vector msRBP4-pET28a ligado e, em seguida, colocar em placas de ágar de caldo Luria-Bertani (LB) contendo canamicina 50 μg/ml^30,37. Incubar as placas durante a noite a 37 °C numa incubadora e procurar colónias positivas no dia seguinte.
   3. Escolha uma única colônia e incube durante a noite a 37 ° C em 5 mL de caldo LB contendo canamicina 50 μg / mL.
   4. Para cultura secundária em 500 mL de caldo LB contendo canamicina 50 μg / mL, use 1% do volume de cultura primária (da etapa 1.1.3.) e incube a 37 ° C por 3-4 h; Verifique a densidade óptica usando um espectrofotômetro. Idealmente, proceda se o valor de OD estiver entre 0,6 e 1 para induzir a expressão da proteína com 0,5 mM IPTG a 24 °C durante a noite.
   5. Use várias concentrações de IPTG de 0,1-1 mM e faixa de temperatura de 16-30 °C para otimizar a expressão e a estabilidade do msRBP4.
   6. Centrifugue a cultura (da etapa 1.1.5.) a 16.000 × g por 10 min, descarte o sobrenadante e mantenha o pellet no gelo.
   7. Homogeneizar o pellet com tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% de glicerol, 0,5 mM de PMSF e inibidores de protease [pH 8,0]). Sonicar o lisado por 15 s ON e 30 s OFF cycle usando um homogeneizador com saída de 250 Watt e 40-50% de frequência de saída de 20 kHz. Repita 5x.
   8. Remover os restos celulares e as células não lisadas por centrifugação a 16.000 × g durante 20 min. Passar o sobrenadante do lisado através de uma coluna NTA de níquel com equilíbrio tampão.
   9. Lavar a coluna com tampão de lise (do passo 1.1.8) contendo 30 mM de imidazol.
   10. Em frações, eluir a proteína msRBP4 ligada usando tampão contendo 250 mM de imidazol. Execute as frações eluídas e monitore visualmente a quantidade de proteína com um gel de poliacrilamida SDS a 12%, corado com Coomassie Brilliant Blue R-250 em solução de metanol: água: ácido acético (45:45:10) e remova a coloração com solução sem coloração de Coomassie metanol: água: ácido acético (45:45:10).
   11. Agrupe as frações não utilizadas e dialise as frações agrupadas com um de diálise de 10K de 10 kDa MWCO.
   12. Avalie a qualidade da fração dialisada em um gel SDS-PAGE a 12% e quantifique a concentração de proteína.
       NOTA: A proteína Apo-RBP4 foi usada na análise da RPS. Para gerar holo-RBP4 (RBP4-retinol), consulte protocolos detalhados publicados em outro lugar ^36,37.
2. Validação inicial dos peptídeos RBPR2 e STRA6 com RBP4 para estrutura e interação por ensaio de fluorescência de triptofano e espectroscopia de dicroísmo circular (CD)
   1. Ensaio de fluorescência de triptofano
      1. Use a ferramenta de análise de composição de proteína on-line (https://web.expasy.org/protparam/) e cole a sequência de aminoácidos em código de uma letra para avaliar a composição estrutural da proteína RBP4 recombinante e os peptídeos individuais de RBPR2 e STRA6 para determinar os resíduos de aminoácidos triptofano nos peptídeos e proteínas individuais (Tabela de Materiais).
      2. Clique no botão calcular parâmetros e avalie a composição de aminoácidos para resíduos de triptofano (Trp).
         NOTA: Os resíduos de triptofano devem estar presentes nos peptídeos ou proteínas individuais que estão sendo analisados.
      3. Dilua os peptídeos RBPR2 e STRA6 individuais em várias concentrações micromolares e incube individualmente com 3 μg msRBP4 em uma placa de 96 poços em temperatura ambiente por 5 min. Excitar a mistura a 290 nm e varrer a emissão do comprimento de onda de 300 nm a 400 nm.
      4. Normalize os dados com a condição de controle em branco (somente tampão, sem peptídeo e sem proteína) e peptídeo (sem proteína) e plotagem.
         NOTA: O incremento de fluorescência do triptofano após a exposição a uma concentração de peptídeo baixa a alta sugere uma interação positiva entre os dois peptídeos individuais e a proteína RBP4.
   2. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD)
      1. Dilua os peptídeos individuais e a proteína RBP4 recombinante em 1x tampão PBS, pH 7,0. Use várias concentrações de peptídeos RBPR2 e STRA6 e proteína RBP4 de 0,1 a 10 μg/mL para uma verificação de qualidade, conforme descrito abaixo.
      2. Adicionar peptídeos e proteínas diluídos individuais numa cubeta de 0,1 cm de comprimento e medir a absorbância/elipticidade da CD utilizando um espectrofotómetro de CD (195-250 nm). Use a fórmula abaixo para calcular a elipticidade média do resíduo (θ).
         [v] = (S × mRw)/(10cl)
         S representa o sinal CD em mθ; mRw representa a massa média do resíduo; c representa a concentração da proteína em mg/mL; e l representa o comprimento do caminho em cm.
      3. Calcule a variação percentual na estrutura da molécula usando a Análise de Estrutura Secundária BeStSel para Previsão de Dobras de Proteínas por Espectroscopia de CD (https://bestsel.elte.hu).
         NOTA: A estrutura secundária indica o dobramento adequado e as confirmações conservadas cruciais para o estudo de interação e o resultado das interações. Inspecione a estrutura prevista do domínio e prossiga com o estudo de interação.

2. Análise de SPR para determinar as afinidades de ligação e parâmetros cinéticos dos receptores de membrana da vitamina A (RBPR2 e STRA6) com seu ligante fisiológico RBP4

1. Para a imobilização do RBP4 na configuração da superfície do chip CM5, usamos o chip sensor SPR, que carrega um ligante carboximetil dextrano estendido a um tamanho de ~ 100 nm covalentemente preso em uma superfície de ouro. Na presença de cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), a N-hidroxisuccinimida (NHS) converte os grupos carboxila na superfície do chip em ésteres de N-hidroxisuccinimida, que reagem espontaneamente com os grupos amina de aminoácidos e proteínas, forçando o ligante a se ligar covalentemente à superfície do chip (Tabela de Materiais).
   1. Imobilize a proteína msRBP4 purificada no chip do sensor (Figura 1 e Figura 2). No menu Executar do software, escolha o Assistente e prossiga com a opção de imobilização . Diluir o ligante (proteína msRBP4 obtida na etapa 1.1) em tampão de imobilização (tampão acetato de sódio 10 mM, pH 5,0) para 10 μg/ml (4 μL de ligante + 396 μL de tampão) e alíquota dos reagentes de acoplamento em frascos para injetáveis. Abra a janela do assistente de configuração de imobilização no controle do software, selecione o chip CM5 e a opção Imobilizar a célula de fluxo 2 e o nível-alvo de 1,200 Unidade de resposta (RU) para atingir Rmax de 30 RU no estudo cinético e na solução de lavagem: etanolamina. Digite o nome RBP4 e clique em Avançar.
      NOTA: Opcional: A caixa de diálogo Preparações do sistema para a opção Preparar antes da execução não é necessária se a preparação com o tampão PBST (solução salina tamponada com fosfato com uma solução detergente Tween 20 a 0,05%) tiver sido realizada anteriormente.
   2. Na caixa de diálogo Posição do rack , clique em Ejetar rack. Pegue na prateleira e coloque os frascos com os volumes atribuídos para cada reagente: 156 μL de msRBP4, 177 μL de etanolamina, 89 μL de EDC, 89 μL de NHS e um frasco vazio. Insira o rack com sample frascos e clique em OK e Avançar.
   3. Na caixa de diálogo Preparar Executar Protocolo , clique em Iniciar e Salvar.
2. Configuração do ensaio cinético dos peptídeos RBPR2 e STRA6
   1. Dilua em série os peptídeos RBPR2, RBPR2 mutante e STRA6 de camundongo (sintetizados quimicamente anteriormente³¹ e listados na Tabela de Materiais) em tampão de corrida em uma faixa de 0,8-26,6 μM.
   2. Abra o software de controle e selecione o assistente Kinetics/Affinity. Clique em Arquivo | Abra o modelo e selecione Cinética/Afinidade. Insira o caminho do fluxo de diálogo da sequência de injeção 2-1 (célula de fluxo 2 como ativa e célula de fluxo 1 como referência), verifique o Tipo de chip CM5 e clique em Avançar. Na caixa de diálogo de configuração , marque Executar ciclos de inicialização, insira Solução: buffer e ciclos: e clique em Avançar.
   3. Na caixa de diálogo de parâmetros de injeção , insira os valores para os parâmetros da amostra : tempo de contato: 120 s, vazão 30 μL/min, tempo de dissociação 300 s; para parâmetros de regeneração : insira o nome da solução de regeneração: Glicina-HCl (pH 2.5), tempo de contato: 30 s, vazão: 30 μL/min e clique em Avançar.
   4. Na caixa de diálogo de amostras , insira o nome dos peptídeos, peso molecular e concentrações e clique em Avançar. Na caixa de diálogo Posição do rack , atribua os peptídeos diluídos como amostras individuais de ~120 μL de várias concentrações de 1 a 100 μM e ~230 μL de tampão, ~120 μL de tampão e ~1.000 μL de glicina, pH 2,5, às posições no rack. Clique em Ejetar rack e insira todos os frascos. Clique em Avançar e, na caixa de diálogo Preparar Protocolo de Execução , clique em Iniciar, insira um nome de arquivo e Salvar (Figura 2).
   5. No software, clique no menu Iniciar e selecione Avaliação. Escolha abrir o arquivo no software e, no menu suspenso de seleção, escolha Fc2-1 para analisar o sensorgrama ativo subtraído em branco da célula de referência para as fases de associação e dissociação dos peptídeos msRBP4 e msRBPR2 e msSTRA6 mutantes.
   6. Clique no botão suspenso Cinética/Afinidade e escolha Limite de superfície; para abrir a caixa de diálogo Selecionar curvas , marque a coluna de inclusão na tabela e clique em Avançar. Selecione a caixa de diálogo Dados para mostrar os sensorgramas subtraídos em branco; clique em Cinética e afinidade, mantenha os parâmetros padrão e clique na opção Ajustar para ajuste de curva. Inspecione a guia Relatório para obter a constante de dissociação de equilíbrio K_d e K_a ou K_na taxa de associação e K_d ou K_na taxa de dissociação. Salve o sensorgrama de dados cinéticos em .txt formato delimitado por guias e use os valores para plotar gráficos (Figura 3).
   7. Para determinar a constante cinética de afinidade K_d (concentração de ligante que se liga a metade dos receptores em equilíbrio), copie e cole as colunas de dados no arquivo de formato .txt gerado a partir do gráfico de avaliação para XY usado no software. Clique em Analisar e regressão não linear (ajuste de curva), verifique a coluna de dados e clique em Ok. Na caixa de diálogo de parâmetros , clique em Saturação de vinculação e em Modelo de encaixe de vinculação específico de um site com a fórmula de:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Onde Bmax é o número máximo de sítios de ligação (Unidade de Resposta), X é a concentração dos peptídeos e Y é a ligação (Unidade de Resposta) (Figura 3).

3. Metodologia de espectrofotometria para quantificar o complexo proteico retiniano GPCR-11-cis (retinilideno proteína rodopsina) em lisados retinianos

1. Transporte o grupo predeterminado de camundongos que consiste em camundongos WT-C57BL/6J adultos para a sala escura.
2. Adapte os camundongos durante a noite por 12-16 h e, sob luz vermelha, coloque o camundongo em uma câmara de eutanásia e abra a válvula de gás CO₂ no regulador a 5 L / min por ~ 5 min. Garanta a morte aplicando pressão no pescoço e na cauda puxada para trás (luxação cervical).
3. Enuclear os globos oculares e homogeneizar os olhos num tampão gelado contendo 20 mM de bis-tris propano (1,3-bis (tris(hidroximetil)metilamino)propano; BTP) pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM e com inibidor de protease (Tabela de Materiais).
4. Centrifugar o homogenato durante 15 min a 16000 x g a 4 °C, rejeitar o sobrenadante contendo proteínas citosólicas solúveis em água. Ressuspender e solubilizar a membrana peletizada e as proteínas da membrana em tampão contendo 20 mM de n-dodecil-β-d-maltosídeo (DDM), 20 mM de bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e com inibidor de protease durante 1 h a 4 °C numa plataforma rotativa.
5. Centrifugar a fracção de membrana resolubilizada durante 1 h a 16000 x g, 4 °C. Misturar o sobrenadante com 30 μL de esferas de anticorpo Rho 1D4 e incubar durante 1 h a 4 °C numa plataforma rotativa.
6. Usando um suporte magnético, separe o pulldown usando contas, descarte o sobrenadante e lave as contas com tampão 20 mM bis-tris propano (BTP) pH 7.4, 500 mM NaCl e 2 mM DDM.
7. Eluir a proteína rodopsina incubando por 5-10 min em temperatura ambiente com tampão 20 mM bis-tris propano (BTP) pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM contendo 0,2 mg / mL 1D4 peptídeo (-TETSQVAPA) (Figura 4 e Figura 5).
8. Analise a absorbância do eluimento de 200 nm a 800 nm usando uma cubeta retangular, submicro, quartzo, abertura de 2 mm, comprimento de caminho de 10 mm, 50 μL em uma configuração de varredura rápida com espectrofotômetro.
   NOTA: Use apenas cubetas de quartzo de alta qualidade (Figura 4).
9. Para validar e determinar a qualidade, verifique e exponha a eluição à luz brilhante por 1 min e, em seguida, repita a etapa 3.8.
10. Subtraia a absorbância em branco e calcule a proporção dos espectros de absorbância analisados com absorbância a 500 nm para opsina ligada à retina 11-cis, 380 nm para opsina ligada à retina totalmente trans exposta à luz e 280 nm para proteína Apo-Opsina livre de ligante (Figura 6). A opsina livre sem ligante retinal fornece uma absorbância basal a 500 nm.
11. Para quantificar a concentração de rodopsina, use a Lei de Beer-Lambert:
    A = ε · C·l ou C=A/ε·l
    Onde A é a absorbância, ε o coeficiente de extinção molar (rodopsina ε500 = 40.600 M⁻¹ cm⁻¹ para Apo Opsina livre ε280 = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹), C é a concentração e l comprimento do caminho.
12. Para quantificar a opsina ligante em porcentagem, use uma proporção de A280 / A500.
13. Traçar os espectros de absorvância subtraídos em branco e calcular o valor de opsina livre³².
14. Calcule a concentração de rodopsina usando o coeficiente de extinção ε₅₀₀ = 40600 M⁻¹ cm⁻¹. A concentração de opsina livre de ligante é calculada com a Lei de Beer-Lambert usando o coeficiente de extinção ε₂₈₀ = 81.200 M⁻¹ cm⁻¹.

Resultados

Métodos quantitativos são descritos para estudar as interações proteína-ligante de receptores de membrana de vitamina A e fotorreceptor opsina com seus respectivos ligantes fisiológicos. O RBP4 de camundongo recombinante deve ser expresso em E. coli e a proteína purificada usada como ligante conjugado em um chip SPR. O RBPR2, STRA6 sintetizado quimicamente e o mutante S294A RBPR2 "SYL motif RBP4 interacting extracellular site" de um peptídeo de ~ 40 aminoácidos é usado...

Discussão

Etapas críticas no protocolo
Metodologia SPR
Modelagem in silico e análise de docking: A estrutura prevista de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) e STRA6, e a estrutura conhecida para obanco de dados ms RBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa), devem ser usadas para o estudo de docking^29,31. Além disso, métodos in vitro (cultura de células) devem ser usados...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms